Nos gustaría dar las gracias a Mohammad Saleem, Jing Wu y Krishnan Raghunathan útil para los debates. También se agradece a Priya Begani de asistencia durante el rodaje. Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R01 AI071727 (AO) y R01 GM110052 (a SLV).

Día 1: Expresión de la mordaza de proteínas usando el basado en lisado de germen de trigo in vitro transcripción-traducción Sistema 1. Preparación de VIH-1 Gag <ol><li> Retire todos los reactivos del kit FBEC germen de trigo comercial del congelador (lisados ​​de germen de trigo se almacenan a -80 ºC; otros reactivos a -20 ºC). Descongelar en hielo y mezclar los componentes como se muestra en la Tabla 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (La alimentación de la mezcla) </td><td></td></tr><tr><td> solución de alimentación </td><td> 900 l </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 80 l </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 20 l </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1.000 l </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mix-2 (lisado de la mezcla) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> lisados ​​de germen de trigo </td><td> 15 l </td></tr><tr><td> RNasa libre de agua </td><td> 7 l </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> El ADN de plásmido en tampón TE (1 g / l) ** </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> tampón de reacción </td><td> 15 l </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> Total </td><td> 50 l </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Composiciones de mezclas requeridas para las reacciones de germen de trigo. Nota: Si el experimento se diseñó para examinar el efecto de la eliminación del RNA por RNasa en unión a la membrana de la mordaza, reemplazar los inhibidores de ribonucleasa con agua libre de RNasa. El ADN del plásmido debe estar libre de impurezas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Sin embargo, plasmids preparar usando convencional, pero no, kits de aislamiento de plásmidos por endotoxinas libres se han utilizado con éxito. las instrucciones del fabricante también recomienda el uso de ADN disuelto en agua libre de nucleasa. Si el uso de ADN en suspensión en TE [10 mM Tris-HCl (pH 7,4) que contiene EDTA 1 mM], evitar el uso de menores concentraciones de ADN, ya que EDTA en TE puede afectar el rendimiento. Los plásmidos disueltos en tampón TE a una gama de concentración de 0,8-1 g / l han utilizado con éxito. <ol start="2"><li> Primero se debe agregar la mezcla de alimentación (Mix-1) en el cassette de reacción (cámara transparente). A continuación, añadir la mezcla de lisado (Mix-2) a la otra cámara (rojo). No introducir burbujas, mientras que la adición de las mezclas en sus respectivas cámaras, ya que puede dar lugar al intercambio ineficaz de los componentes de la solución y por lo tanto reducir la eficacia de la reacción. </li><li> Cubrir las cámaras con la película adhesiva suministrada con el kit. </li><li> Inserte la cinta de reacción en el soporte de cassette y Incubadoraste el conjunto durante 24 horas a 24 ºC a una velocidad de agitación constante de 900 rpm en un Eppendorf Thermomixer R. </li></ol> Día 2: Preparar GUVs por Electroformation y Harvest lisados ​​de germen de trigo 2. Preparación de GUVs <ol><li> lípidos alícuotas disueltos en disolventes inorgánicos tales como cloroformo o mezclas de cloroformo y metanol en viales de vidrio con tapones de rosca alineados con revestimientos de teflón y envueltos con Parafilm. Manejar los lípidos con jeringas de vidrio de tipo Hamilton, o si están disponibles, puntas de plástico de cloroformo-resistente. Sacar viales de vidrio que contienen los lípidos para ser utilizado para la preparación de la GUV -20 ºC congelador. <ol><li> Una vez que los viales se equilibraron a temperatura ambiente, asegurarse mediante inspección visual de que las suspensiones de lípidos son claras. La calidad de los lípidos, en particular los lípidos ácidos, tales como fosfatidilserina palmitoil-oleoil (POPS) y PI (4,5) P 2, es importante para experimentos exitosos. No utilice los lípidos que se encuentranen alícuotas durante más de 2 meses. </li></ol></li><li> Pre-calentar un bloque de calor a la temperatura deseada. Esta temperatura debe ser al menos 5 ºC mayor que la temperatura de fusión (Tm) del lípido (s) con la más alta T m. </li><li> Calcular los volúmenes de lípidos necesarios de acuerdo con las proporciones molares de lípidos deseados. Para el estudio de la unión aquí el VIH-1 Gag, utilice las siguientes relaciones molares como se muestra en la Tabla 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mezcla de lípidos </td><td> Relación molar </td><td> Volumen (en l) </td><td> de la concentración </td></tr><tr><td> POPC + + POPS Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + + POPS Chol + Cerebro-PI (4,5) P2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; + 20 + 40 + 30 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Cerebro-PI (4,5) P2: 1 mg / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Los volúmenes de diferentes lípidos utiliza para obtener GUVs. <ol start="4"><li> Añadir los volúmenes deseados de lípidos en un vial de vidrio con tapón de rosca limpia. </li><li> Toboganes de dimensiones 25 x 50 x 1,1 mm 3 y la resistencia 70-100 Ohmio (como se describe en el catálogo) Uso ITO-revestido. Coloque dos portaobjetos recubiertos con ITO en un banco limpio. Cada cámara electroformation requiere dos-estaño-óxido de indio (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertas. Compruebe que el lado conductor de la lámina de vidrio se encuentre hacia arriba mediante la comprobación de la resistencia con un multímetro. Debe mostrar un valor de aproximadamente 200 Ω. Asegúrese de que la superficie de las diapositivas son limpios frotándolos suavemente con etanol al 70%, utilizando toallitas sin pelusa. </li><li> Limpiar la superficie exterior de una aguja de una jeringa por rinsing con cloroformo y coloque la jeringa en el bloque de calor. </li><li> Coloque un nuevo portaobjetos de vidrio recubierto con ITO en el bloque de calor con el lado conductor hacia arriba y deje que se equilibre a la temperatura deseada por lo general alrededor de 2-3 minutos. No vuelva a utilizar las placas de vidrio recubiertas con ITO para un riesgo potencial de que el ITO-recubrimiento sobre los portaobjetos de vidrio podría ser dañado durante los procedimientos de limpieza. </li><li> Use un volumen de 40-50 l de la mezcla de lípidos para cada diapositiva para el uniforme y sin embargo rápida propagación de los lípidos en el portaobjetos de vidrio. Ajustar el volumen total con un disolvente orgánico apropiado tal como cloroformo. <ol><li> Coloque una media del volumen total de la mezcla de lípidos en el portaobjetos de vidrio y se extendió inmediatamente el lípido utilizando la jeringa limpiado (paso 2.6) para dejar una película de lípidos uniforme (que se mueve la aguja 2-3 veces a través de la corredera). Corre la película lipídica suavemente (pero rápidamente) para evitar cualquier daño a la capa de ITO delgada. No uniforme difundir o propagar áspera puede llevar a un nivel óptimorendimientos o heterogeneidad computacional de GUVs. </li><li> Por lo tanto, garantizar la propagación uniforme mediante la inspección de la película de lípido después de extenderse antes de proceder con el paso siguiente. Si la opacidad de la película aparece excesivamente no uniforme, vuelva a realizar el procedimiento utilizando una nueva diapositiva. </li></ol></li><li> Colocar el portaobjetos recubierto dentro de un plato de Petri con el lado recubierto hacia arriba. </li><li> Repetir los pasos 2.6 a 2.9 para el resto de la mezcla utilizando otra diapositiva recubierto con ITO. </li><li> Coloque la placa de Petri que contiene tanto los portaobjetos en una cámara de desecación de vacío convencional durante 60-90 min para eliminar cualquier traza de disolventes orgánicos. </li><li> Durante este proceso, establecer la incubadora a la misma temperatura que la del bloque de calor (65 ° C en la mayoría de los casos) y pre-calentamiento a 300 mM de solución de sacarosa en la incubadora. </li><li> Después del secado, llevar la placa de Petri a la banca y colocar la lámina de vidrio sobre una superficie limpia. </li><li> Limpiar suavemente una junta de PDMS (Figura 1) con 70% de etanol y se seca completamente. </li><li> Colocarlo en el portaobjetos de vidrio recubiertos con lípidos, como se muestra en la Figura 1 y suavemente y presione firmemente para que los junta forma un sello hermético. Confirmar la ausencia de huecos entre la junta de PDMS y la corredera. Esto da como resultado la formación de una cámara poco profunda que contiene la solución de sacarosa. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figura 1:. El diseño de la placa de vidrio recubierto con ITO utilizado para electroformation <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="16"><li> Llenar la cámara con una solución de sacarosa pre-calentado, sin burbujas. </li><li> Coloque el otro portaobjetos recubierto en la parte superior para hacer un sello hermético. Asegúrese de que no hay burbujas. El montaje final debe aparecer como se muestra en la Figura 2. Fije la cámara de usinclips g aglutinante. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figura 2:. Representación esquemática de la cámara de electroformation (vista lateral) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="18"><li> Eliminar el exceso de sacarosa por aspiración y limpiar las diapositivas utilizando toallitas sin pelusa. Sujetar las diapositivas a la barra de cobre de modo que las partes conductoras están en contacto uniforme con la barra. Asegúrese de que sólo un lado conductor de la placa de vidrio está en contacto con una barra de cobre. </li><li> Conectar la barra de cobre a la salida del generador de funciones utilizando las pinzas de cocodrilo. Coloque el conjunto dentro de la incubadora para permitir el montaje se equilibre a la temperatura deseada. </li><li> Aplicar una frecuencia de onda sinusoidal de 10 Hz y una diferencia de potencial de 1 V por 90 min. ensure que la tensión es de 1 V por un multímetro como se muestra en la Figura 3. Continuar el proceso de 90 min. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figura 3:. Las posiciones en las que se colocan los electrodos del multímetro para medir la frecuencia y la corriente <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="21"><li> Después de 90 min, disminuir lentamente la frecuencia de 2 Hz y continuar electroformation durante otros 10 minutos. Durante este tiempo, la cosecha en reacciones de traducción in vitro (pasos 3.1 a 3.2). </li><li> Desconectar el generador de funciones y deje que el conjunto se enfríe a temperatura ambiente lentamente (apagando la incubadora y dejando la puerta ligeramente abierta incubadora). </li><li> Después de enfriar, desconectar los cables al generadorde las correderas. GUVs puede ser muy frágil y por lo tanto necesitan ser manejados con mucho cuidado. Con precaución, el conjunto de la banca. </li><li> Desmontar la cámara quitando suavemente el carro superior con unas pinzas. Cosechar la suspensión que contiene GUVs sacarosa utilizando una punta de corte de 1.000 l y transferir a un tubo limpio. Manejar el tubo suavemente para evitar interrupciones de GUVs. </li><li> Usa los GUVs inmediatamente. GUVs son estables durante al menos 90 min después de la cosecha cuando se almacena a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Las reacciones de traducción in vitro de la cosecha <ol><li> Cosecha de las reacciones de traducción in vitro que contienen las proteínas deseadas de la cámara de rojo utilizando una micropipeta en un tubo. </li><li> Para eliminar las proteínas agregadas, girar los lisados ​​a 16.200 xg durante 15 min en una centrífuga de mesa y transferir cuidadosamente el sobrenadante a otro tubo. </li></ol> 4. Ensayo de unión GUV <ol><li> Con una punta de corte, mezcla 51; l de reacciones de traducción in vitro que contienen proteínas traducidas y 5 l de GUVs en un tubo y se incuba a temperatura ambiente durante 2-3 min. </li><li> Adjuntar una hoja de PDMS con un agujero pequeño (3-4 mm de diámetro) en una hoja de la cubierta limpia y asegurar un sellado hermético presionando suavemente y firmemente contra el cubreobjetos. </li><li> Coloque la mezcla de 10 l de la etapa 4.1 en el pequeño orificio. </li><li> Image la mezcla bajo un microscopio de fluorescencia confocal invertido epi- o a temperatura ambiente. Nota: Para evitar la evaporación, la cámara de formación de imágenes puede ser cubierto por un cubreobjetos. </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles+from+native+membranes+and+organic+lipid+mixtures+for+the+study+of+lipid+domains+under+physiological+ionic-strength+conditions.">Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions.</a> Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).</li><li>Olety, B., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+played+by+acidic+lipids+in+HIV-1+Gag+membrane+binding.">Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding.</a> Virus Res. 193, 108-115 (2014).</li><li>Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters.">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li><li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding.">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li><li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules.">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529 (2015).</li></ol>

We declare that we have no conflicting interests.

El ensayo de unión GUV como se describe anteriormente proporciona una buena alternativa en escenarios en los otros ensayos de interacción proteína-lípido tienen sus limitaciones. Este ensayo nos permite examinar las interacciones entre myristoylated la mordaza de cuerpo entero y ácidos lípidos con cadenas de acilo de longitud nativa en el contexto bicapa lipídica y lo hacen sin larga centrifugación de flotación a través de gradientes de sacarosa de alta densidad u otro tratamiento posterior a la unión de Gag-lípido complejos. Otra ventaja es que el comportamiento de la mordaza puede ser examinado en una mezcla compleja (por ejemplo, en presencia de componentes citosólicos), que no se consigue fácilmente en otras técnicas en tiempo real tales como ensayos basados ​​en resonancia de plasmón superficial. Por lo tanto, se puede argumentar que el ensayo descrito aquí permite la evaluación en tiempo real de las interacciones de lípidos Gag-ácidos en un contexto más nativo que otros ensayos utilizados en el campo. Sin embargo, hay limitaciones asociadas con el método que sebien. Para asegurarse de que GUVs en una preparación dada tienen composición similar entre sí y a la mezcla original, electroformation deben ser realizadas bien por encima de la temperatura de transición de los lípidos que tienen la temperatura de transición más alta presente en la mezcla 25,26. Sin embargo, es posible que la exposición de los lípidos a temperaturas más altas durante más tiempo puede conducir a la ruptura de lípidos 25,27. Por lo tanto, para controlar la calidad de GUVs, además de la inspección visual permitido por la inclusión de colorantes fluorescentes de lípidos (por ejemplo, DID), es deseable para probar la funcionalidad del lípido de interés [por ejemplo, PI (4,5) P 2 ] utilizando una sonda-lípido específico. Además, con composiciones GUV que dan lugar a separación de fases a una cierta temperatura, se debe tener cuidado para mantener con precisión una temperatura deseada cuando la observación de la interacción proteína-GUV. Otra limitación es que las soluciones de mayor fuerza iónica son incompatibles con la electroprotocolo de formación describe aquí, y por lo tanto GUVs se cultivan y se mantiene en 300 mM de solución de sacarosa al 26. Cabe destacar, sin embargo, algunos estudios han utilizado con éxito tampones a fuerzas iónicas fisiológicas en sus protocolos electroformation modificados 28. Un aspecto crítico es la cantidad de Gag. Un sistema basado en lisado de reticulocitos de conejo se utiliza a menudo para la preparación de de longitud completa del VIH-1 Gag en ensayos de liposoma de flotación. Sin embargo, la cantidad de etiquetado-YFP Gag de longitud completa obtenido en este sistema era insuficiente para la visualización de la mordaza de la unión a GUVs. Para hacer frente a este problema, el sistema de transcripción-traducción de germen de trigo a base de lisado libre de células, que produce aproximadamente 8-10 veces mayor cantidad de Gag, se utilizó en el ensayo actual. Sin embargo, si los experimentos de unión GUV deben realizarse en ausencia de componentes de lisado de células eucariotas, se puede utilizar proteínas purificadas marcadas con un fluoróforo como se ha hecho recientemente (descrito a continuación). Se ha demostrado que la unión específica y de Gag a membranas eficiente es un proceso cooperativo regulado por varios factores, tales como miristato, RNA, grupos de cabeza de lípidos y las cadenas de acilo, y las interacciones Gag-de la mordaza (revisado en referencia 29). El sistema in vitro describir aquí puede ampliarse para abordar el papel de los factores de forma individual o en combinación para entender el orden de los acontecimientos en el proceso cooperativo de unión a la membrana de la mordaza. Hasta el momento, el sistema de ensayo descrito dilucidado un papel inesperado de insaturados PI (4,5) P 2 cadenas de acilo en la unión de Gag, pero no la de un PI-células procedentes de mamíferos canónica (4,5) P 2 unión a dominio ( el dominio de homología pleckstrin de la fosfolipasa C delta 1) 24, un hallazgo que no había sido revelado por los ensayos de liposomas de flotación. sistemas de ensayo basados ​​en GUV también se han utilizado para comprender otros aspectos de la biología de la mordaza. El uso de un derivado de la mordaza que contiene un recep inducible artificialmotivo erization y GUVs con la balsa similar y no balsa igual que los dominios, Keller et al. examinaron la relación entre la mordaza de la partición de los dominios &#39;balsa-como&#39; multimerización y 30. Un estudio realizado por Carlson et al. Ha utilizado el sistema GUV y Gag purificado y marcado con fluorescencia para entender el orden secuencial de reclutamiento de varios complejos de clasificación endosomal requeridas para el transporte (ESCRT) las proteínas por el Mordaza unida a la membrana 31. Recientemente, otro estudio informó la reconstitución del proceso de gemación de vesículas Gag-inducida en el uso de la mordaza GUV conjugado con un fluoróforo 32. VIH-1 Gag multimerización conduce a la formación de celosía Gag submembrane que se cree que la curva de las membranas durante el montaje. Por lo tanto, con nuevas mejoras en los sistemas de ensayo Gag-GUV, la relación entre los cambios de curvatura de la membrana y la membrana de la mordaza de unión, que es posiblemente el aspecto menos comprendido dentro del conjunto de VIH, se puede analizar como se está haciendo foR otras proteínas celulares curvatura sensible 33. En resumen, el uso de este protocolo, se puede obtener cantidades suficientes de myristoylated la mordaza de larga duración y visualizar la mordaza de unión a membranas GUV. Este protocolo puede desarrollarse más para examinar diversas etapas del VIH-1 y el conjunto de procesos en ciernes.

virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es un virus con envuelta que se reúne en los brotes y de la membrana plasmática (PM) en la mayoría de tipos de células. El montaje de VIH-1 partículas de virus está impulsado por la proteína del núcleo viral 55 kDa denominado Pr55 Gag (Gag). Gag se sintetiza como una poliproteína precursora compuesta de cuatro grandes dominios estructurales, a saber, matriz, la cápside, la nucleocápside, y p6, así como dos péptidos espaciadores SP1 y SP2. Durante el montaje, la matriz (MA) de dominio es responsable de la orientación de la mordaza para el lugar de montaje, la cápside (CA) de dominio media interacciones Gag-Gag, la nucleocápside (NC) de dominio recluta ARN genómico viral, y factores del huésped p6 reclutas que ayudan escisión de partícula de virus de la membrana plasmática. Gag también sufre una modificación co-traduccional por la adición de un ácido graso de 14 carbonos o resto miristato de en su extremo N-terminal. unión de la mordaza de la membrana es un requisito esencial para el ensamblaje viral, ya que mutants que son defectuosos en la unión a la membrana no pueden producir partículas de virus. Nosotros y otros han demostrado que la unión de la mordaza está mediada por señales bipartitos dentro del dominio MA membrana: la fracción de miristato de N-terminal que media las interacciones hidrofóbicas con la bicapa de lípidos y un grupo de residuos básicos en el dominio MA denomina como región altamente básica ( HBR) que interactúa con los lípidos ácidos en el PM 1-4. Los estudios de la mordaza de la membrana interacciones utilizando la expresión ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatasa IV (5ptaseIV), una enzima que cataliza la hidrólisis de fosfatidilinositol fosfolípidos ácidos PM-específica (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, en las células sugiere que Gag-PM localización está mediada por PI (4,5) P 2 3,5. Sin embargo, los estudios in vitro con el objetivo de comprender los detalles más mecanicistas de Gag-PI (4,5) P2 interacciones han demostrado ser un reto para un número de razones. porejemplo, la purificación de longitud completa myristoylated VIH-1 Gag para experimentos bioquímicos ha sido técnicamente difícil al menos en parte debido a la tendencia de la mordaza a agregarse durante la purificación. Por lo tanto, las formas truncadas de VIH-1 Gag, como Myr-MA o Myr-MA-CA, o la forma no myristoylated se han utilizado con frecuencia en los estudios que requieren la purificación de la mordaza (por ejemplo, resonancia magnética nuclear, la huella de la proteína, y la superficie resonancia de plasmón 6-9). Alternativamente, acoplados en reacciones de transcripción-traducción in vitro se han utilizado para producir de longitud completa myristoylated VIH-1 Gag en otros estudios bioquímicos 1,2. Típicamente, en este sistema, un plásmido Gag-codificación se transcribe y se traduce con lisados ​​de células eucariotas (por ejemplo, lisados ​​de reticulocitos de conejo) que están desprovistos de cualquier membranas celulares y ARN mensajeros, pero contienen la maquinaria para la transcripción y la traducción. Después de la reacción, los lisados ​​celulares que contienen Gag se mezclan con membranes para el análisis de las interacciones de la mordaza con los lípidos. Además de la facilidad de la preparación de longitud completa myristoylated Gag, los métodos que utilizan el sistema de traducción de la transcripción in vitro tienen una ventaja que la síntesis de Gag y reacciones de unión de membrana posterior se producen en un medio &#39;eucariota citosol-como &quot;que pueden representar mejor las condiciones fisiológicas. Esta propiedad contribuyó a los estudios que mostraron que las moléculas de ARN unido al dominio MA regulan Gag unión a lípidos ácidas de manera competitiva 1,2,10-12. Sin embargo, ya que la cantidad total de proteínas Gag obtenidos en estos lisados ​​celulares no son altos, marcaje metabólico de las proteínas con aminoácidos radiomarcados es necesaria para su detección. Dependiendo del método para medir las interacciones Gag-lípidos, se han utilizado una variedad de preparaciones de membrana. Cada uno de estos métodos tiene sus ventajas y limitaciones. La mayoría de los ensayos basados ​​en RMN requieren el uso de lípidos con acilo cortocadenas que son solubles en agua (por ejemplo, C4 y C8-PI (4,5) P2) 6,8. Si bien los métodos de RMN de ensayo de fijación de la mordaza a los lípidos que tienen cadenas acilo largas que se encuentran en las células están siendo desarrollados, se han utilizado solamente con MA myristoylated o nonmyristoylated hasta ahora 8,13. Alternativamente, los liposomas preparados a partir de lípidos que tienen cadenas de longitud de acilo nativos se han utilizado en los métodos bioquímicos tales como la flotación del liposoma o liposoma de bolas fluorescentes ensayos de unión 2,3,10,14-16. Sin embargo, los liposomas usados ​​en estos ensayos tienen diámetros pequeños, y por lo tanto sus membranas tienen curvaturas pronunciadas y positivos. En contraste, durante la primera fase de ensamblaje de partículas en las células infectadas por VIH-1, Gag se une a la PM, que es casi plano sobre la escala de Gag, y posteriormente induce curvatura negativa durante ciernes. Por lo tanto, las membranas de liposomas con curvatura pronunciada y positivo podría no ser bicapas lipídicas ideales para estudiar las interacciones Gag-lípido. En cuanto a flot liposomaLos ensayos ación, otro posible advertencia es que la exposición de los complejos de lípidos a Gag-gradiente de sacarosa hipertónica durante la centrifugación pueden afectar el resultado experimental. Para aliviar estas limitaciones y proporcionar un sistema experimental complementaria, ensayos para la mordaza de unión a vesículas unilamelares gigantes (GUVs) se han desarrollado en los últimos años. GUVs son vesículas bicapa de lípidos individuales cuyos diámetros extender a varias decenas de micrómetros. Por lo tanto, la curvatura de estas membranas se asemeja a la PM en la escala de Gag. Por otra parte, debido a su gran tamaño, lo que permite la inspección visual en los microscopios ópticos, membrana de unión a proteínas Gag de fluorescencia etiquetados o marcados para estas vesículas después de la mezcla puede determinarse fácilmente sin el tratamiento posterior de los complejos de la mordaza en lípidos. Se describen un protocolo para el estudio del VIH-1 de unión utilizando GUVs obtenidos a partir de un método electroformation membrana de la mordaza. Diversos métodos tales como la hidratación suave, gel de hidratación asistida, micrófonochorro rofluidic, y electroformation 17-22 se han utilizado para obtener GUVs. Para el protocolo descrito aquí, el método electroformation se usa principalmente debido a su eficiencia en la formación de GUVs con los lípidos ácidos y su relativa facilidad de uso sin la necesidad de configuraciones de caras. Desde la visualización de Gag requiere un indicador fluorescente, amarillo proteína fluorescente (YFP) se añade genéticamente a la C-terminal de Gag (Gag-YFP). Proteínas Gag-YFP se obtienen in vitro de transcripción y traducción reacciones en trigo en lisados ​​de germen basado en la tecnología continua de cambio de flujo continuo (CECF). En esta tecnología, tanto la eliminación de subproductos inhibidores de las reacciones y de suministro de sustratos de reacción y componentes de energía se consigue en un mecanismo basado en diálisis. Para estas reacciones, se utiliza un plásmido que codifica Gag-YFP bajo el control de un promotor T7. Es de destacar que, como se ha mostrado anteriormente, lisados ​​de germen de trigo apoyan miristoilación sin componentes adicionales 23,24. Usando este método, ha sido posible obtener cantidades suficientes de longitud completa myristoylated Gag-YFP para la visualización de la mordaza sobre las membranas GUV 24. A continuación se describe el protocolo con el que el VIH-1 Gag unión a PI (4,5) P2 -Con membranas GUV puede ser examinado sin un procesamiento más largo subsecuente siguiendo reacciones de unión y proponer que este método complementa preexistente Gag-membrana ensayos de unión y puede ser extendido para comprender mejor el VIH-1 Gag-membrana de unión.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digital Multimeter</td>
			<td>Meterman</td>
			<td>30XR</td>
			<td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Instek</td>
			<td>GFG-8216A</td>
			<td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO coated glass slides</td>
			<td>Delta Technologies, Loveland, CO</td>
			<td>CG-90IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td></td>
			<td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>21516-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80400</td>
			<td>Gauge 22S, Syringe number 702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td>
			<td>Sylgard, 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td>
			<td>BiotechRabbit, 
			Berlin, Germany</td>
			<td>BR1401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA&#160;</td>
			<td>D7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&#160;</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPS</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840034C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700041P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain-PI(4,5)P2&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

La proteína estructural de VIH-1, Pr55 Gag (o Gag), se une a la membrana plasmática en las células durante el proceso de ensamblaje del virus. unión de la mordaza de la membrana es un paso esencial para la formación de partículas de virus, ya que un defecto en los resultados de unión a membrana de la mordaza de deterioro severo de la producción de partículas virales. Para obtener detalles mecanicistas de la membrana interacciones Gag-lípidos, los métodos in vitro basados ​​en RMN, la huella de la proteína, resonancia de plasmones superficiales, centrifugación liposoma de flotación, o perla de lípidos de fluorescencia unión se han desarrollado hasta el momento. Sin embargo, cada uno de estos métodos in vitro tiene sus limitaciones. Para superar algunas de estas limitaciones y proporcionar un enfoque complementario a los métodos previamente establecidos, se desarrolló un ensayo in vitro en el que las interacciones entre el VIH-1 Gag y las membranas de lípidos tienen lugar en un entorno de &quot;célula como&quot;. En este ensayo, la mordaza de la unión a las membranas lipídicas se analiza visualmente utilizando YFP-Tagged Gag sintetizado en un germen de trigo-basa en el sistema de traducción in vitro y GUVs preparados por una técnica electroformation. Aquí se describen los antecedentes y los protocolos para obtener proteínas Gag de larga duración myristoylated y membranas GUV necesarios para el ensayo y para detectar la unión mediante microscopía Gag-GUV.

<html> Utilizando el protocolo anterior, hemos preparado GUVs compuestos de POPC + POPS + Chol (relación molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composición fue elegida para representar aproximadamente las concentraciones de colesterol y PS de la PM. Robusto y eficiente de unión de Gag se observó sólo cuando el cerebro-PI (4,5) P2 se incluyó en la mezcla de POPC + + POPS Chol-PI cerebro (4,5) P2 [relación molar (POPC + POPS + + Chol : 4: 2: 3: 1] en este ejemplo) (Figura 4, compare paneles B y D con a y C). La unión a GUVs compuestos de POPC + Gag-YFP POPS + Chol + cerebro-PI (4,5) P 2 es evidente por el aumento en la intensidad de fluorescencia en la superficie de la membrana. Este aumento puede ser visto también en los perfiles de intensidad de fluorescencia (Figura 4, abajo) a lo largo de la línea que cruza la frontera GUV (XX &#39;en la Figura 4C y D). carga / 54293 / 54293fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: la mordaza se une al cerebro-PI (4,5) P 2 -contianing GUVs Una sección transversal confocal de POPC + POPS + Chol (A y C) y POPC + POPS + Chol + PI (4,5) P 2. GUVs (B y D). Distribución de Gag-YFP se muestra en verde. imágenes ampliadas de los GUVs seleccionados (cajas amarillas) se muestran en los paneles C y D. intensidad de fluorescencia perfiles a lo largo de líneas elegidas al azar de forma que corte los lados opuestos de GUVs (X a X &#39;) se muestran debajo de las imágenes. Barra = 5 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54293/54293fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K vistas.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

Video: Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Predicción del VIH-1 usos correceptor (tropismo) por análisis de secuencia utilizando un enfoque genotípica

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Medida de<em&gt; In Vitro</em&gt; Integración Actividad del VIH-1 preintegration Complejos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.