The authors have nothing to disclose.

1. Preparación de C. elegans embriones para Microscopía Time-lapse usando Microbeads <ol><li> Transferencia gusanos adultos grávidas mediante el uso de un pick gusano (alambre de platino) en una gota de tampón M9 y limpiar las bacterias por primera agitando vigorosamente y luego transferir cada gusano a una caída adyacente de M9 utilizando un latigazo del ojo montado en un / punta de la pipeta selección del diente o utilizar un capilar de vidrio con punta. </li><li> Se diluye la dispersión que contiene las 20 micras perlas de poliestireno de diámetro 10 veces en tampón de M9 (1 L de tampón M9 contiene 3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, y, después de tratamiento en autoclave (20 min, 120 ° C), añadir un adicional de 1 ml de una solución 1 M MgSO4). </li><li> Hacer una pipeta de boca de cualquier tipo de capilar de vidrio delgado (por ejemplo, el derretimiento de los capilares de punto o capilares utilizados para tirar de agujas de inyección), una más o menos 0,5 m de largo pedazo de caucho, silicona o tubería material similar (lo ideal es transparente), unos 200 lpunta de la pipeta, la tapa de un tubo de PCR 200 l, un filtro hidrófobo para jeringas pequeñas (por ejemplo., un 0,2 hasta 0,45 micras de tamaño de poro y de 15-50 mm de diámetro de nylon, PTFE o un filtro de material similar) de punta, y una pipeta de 1.000 l . Este tipo de boca pipeta asegura que ningún material biológico puede ponerse en contacto con el experimentador. </li><li> Montar la pipeta mediante la inserción de la punta de pipeta 200 l con la punta primero en el tubo y conectarlo con la tapa de un tubo de PCR que tiene una perforación central que coincide con el diámetro del capilar utilizado. Una aguja punzón o preparación muy puntiaguda se puede utilizar para generar la perforación. </li><li> Dibuja un capilar fino y la inserta en la perforación. Colocar el filtro en el otro extremo del tubo e insertar una punta de pipeta 1.000 l como pieza de la boca (Figura 1). </li><li> Diseccionar adultos grávidas cortando transversalmente gusanos en la vulva con una hoja de afeitar limpia o escalpelo. NOTA: Por lo general, muchos embriones serán correoxpulsed después del corte. Sin embargo, si se necesitan embriones tempranos, que a veces tienen que ser liberado de la canal mediante un latigazo del ojo de la aguja o punta. </li><li> Pipetear una gota de la dispersión diluida perla de poliestireno (~ 4 l) sobre un vidrio de cubierta 24x60 mm y embriones de transferencia en esta caída usando la pipeta de boca. </li><li> Con cuidado, coloque una pequeña (por ejemplo, 18x18 o 20x20 mm) cubierta de cristal en la parte superior de la gota y asegúrese de que la caída se ha extendido totalmente fuera. NOTA: La caída también debe ser lo suficientemente pequeño como para no tocar los bordes de la pequeña cubierta de vidrio. </li><li> Selle el montaje con vaselina licuado. Añadir una gota de aceite de inmersión en el lado de deslizamiento mm cubierta de 24x60 y proceder a la sección &#39;Time-lapse microscopía&#39;. </li></ol> 2. Preparación de adulto C. elegans Animales de Microscopía Time-lapse usando nanobeads NOTA: En general, el protocolo para el montaje de los animales adultos es una adaptación del protocolo de ref. 18.Con este protocolo, es posible llevar a cabo la microscopía confocal de lapso de tiempo a largo plazo de los animales adultos. <ol><li> Preparar un 1,5% (w / v) solución de agarosa en tampón M9, hervir (1 min, 100 ° C en baño de agua o en el microondas). No se recomienda el uso de concentraciones más altas de agarosa ya que esto puede conducir a la extrusión del intestino y / o partes de la gónada. </li><li> Pegue abajo 2-3 capas de cinta en dos portaobjetos cada uno. Coloque una diapositiva sin cinta entre las dos diapositivas con cinta. </li><li> Utilice una punta de pipeta y colocar una gota de la solución de agarosa caliente en el centro de la diapositiva medio. Colocar rápidamente otra diapositiva a la caída de manera que con el apoyo de las capas de cinta en cada lado. Esto creará una ronda y la almohadilla de agar plana de alrededor de 10 mm de diámetro. </li><li> Ponga una gota de solución de bolas 100 nm (sin diluir, que es 2,6% (w / v)) en la almohadilla. Traslado 1-10 gusanos adultos limpiados en la gota con un pico gusano. Selle con 18x18 mm cubierta de vidrio y de vaselina como se explica en Protocol 1. </li></ol> Microscopía 3. Time-lapse <ol><li> Ponga una gota de aceite de inmersión sobre el portaobjetos de microscopio o el sándwich de vidrio de cobertura. Use campo claro a bajo aumento (5x o 10x lentes) para localizar la muestra. NOTA: Limite la exposición a la luz azul tanto como sea posible (en particular para C. elegans embriones), por ejemplo, no utilice la microscopía epifluorescencia para encontrar / enfocar la muestra pero el uso de campo claro en su lugar. </li><li> Cambie a mayor aumento (40x o 60x objetivos), llevar la muestra en el foco (ya sea plano central o superior / inferior planos de la muestra, en función del software de adquisición). </li><li> Establecer los intervalos de muestreo a 30 aviones en 1 m distancia registran cada 1 min. En caso de que una etapa xyz xy o automatizado está disponible, múltiples manchas se pueden grabar en una sesión. Cambie a imágenes de fluorescencia y comprobar de nuevo el enfoque. NOTA: Trate de evitar el uso de poderes alta láser, en lugar utilizar tiempos de exposición más largos ligeramentea intensidades muy bajas. Medida adquirió imágenes de inmediato, ya sea en el programa de adquisición de la imagen o en ImageJ para evitar la saturación, que cultivos varían las dinámicas y significa también la exposición excesiva a la radiación. </li><li> Comience a grabar la serie de lapso de tiempo. NOTA: Para excluir el análisis de artefactos, comience con largos intervalos (10/03 min) tiempo entre la exploración de la muestra y aumentar gradualmente muestreo temporal de los intervalos deseados. Calendario de desarrollo, así como puntos finales en ambos casos deben ser similares cuando se realiza un análisis estadístico. Por otra parte, a menudo es necesario para evaluar las tasas de supervivencia y fototoxicidad. Por lo tanto, recuperar la muestra desde el monte después de la microscopía de lapso de tiempo a largo plazo y comprobar si continúan desarrollando / live. </li></ol> 4. La reconstrucción de un modelo celular de la forma 3D con IMOD NOTA: El software IMOD está disponible en la página Web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. La instalación del software es describird allí. Cuando se utiliza el sistema operativo Windows, un conjunto de herramientas de Unix tiene que ser instalado, que también se puede encontrar como un paquete en la página web IMOD. Por otra parte, hay una introducción 3dmod excelente compilado disponible en la página web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html). <ol><li> Abra el shell de Unix y escriba &quot;imod&quot;. La ventana IMOD se abrirá. Seleccione el archivo con los datos en bruto (lo ideal sería un tif apilados o similar) desde el que generar un modelo 3D. </li><li> Busque la parte inferior y superior de los objetos en la ventana de Zap utilizando la ventana de información (arriba y abajo herramienta de desplazamiento). </li><li> Comience trazando las líneas celulares. Es importante destacar que, asegúrese de que cada célula es un objeto. Comience con el plano superior de cada célula y crear el primer contorno allí utilizando la ventana de información. Desplácese hacia abajo en z y crear un nuevo contorno para cada plano z. </li><li> Haga lo mismo con la mayor cantidad de células, según sea necesario para modelar en 3D. No te olvides de crear un nuevo objeto cuando se parte de una nueva célula. norteNOTA: Hay muchas maneras diferentes para el seguimiento de contorno y varios plugins votos. Por favor, visite la página web IMOD y tutoriales en línea para obtener más información. En el caso que se muestra aquí, la configuración predeterminada se ha utilizado. </li><li> Abra el &quot;Model View&quot; de la ventana para inspeccionar los objetos y sus contornos. </li><li> En el &quot;Model View&quot; barra de herramientas seleccione &quot;Edit&quot; - &quot;Objetos&quot;. La ventana de edición correspondiente se abrirá. </li><li> Para modelar células como objetos llenos y cerrados, elija &quot;Mesh&quot; como &quot;Draw Tipo de datos&quot; y &quot;relleno&quot; como &quot;estilo del dibujo&quot;. Haga clic en &quot;roces&quot; en la selección de desplazamiento en la parte inferior izquierda de la ventana. Compruebe el &quot;Cap&quot; opción en la selección en la parte inferior derecha. Compruebe tantos objetos como sea necesario y haga clic en &quot;Mesh todos&quot;. El programa generará objetos sólidos de las pilas de contornos. El factor z-muestreo se puede ajustar cambiando &quot;Z-escala&quot; en la &quot;Vista&quot; de la ventana. </li><li> Mover / girar el obje 3Dt (&quot;Edit&quot; - &quot;Ver&quot;) y guardar instantáneas o películas (&quot;Archivo&quot; - &quot;Snap Tiff como ...&quot; o &quot;Película / Montaje&quot;). </li></ol> 5. Seguimiento fluorescencia estructuras etiquetadas con Endrov NOTA: Con el fin de realizar un seguimiento de los restos de la división celular, utilizar una cepa con un marcador de membrana nuclear o plasma para la identificación de célula (por ejemplo, H2B, PH-PLC-d1) y un marcador remanente división celular (por ejemplo, NMY-2, ZEN-4 ). El marcador de membrana nuclear o plasma es importante para determinar qué celda hereda el remanente de la división celular. <ol><li> Para una carga rápida y facilidad de uso, los datos en bruto tiene que ser convertido a un archivo TIFF (por ejemplo, en ImageJ). A continuación, abra Endrov y cargar el archivo a ser analizados por la elección de la opción &quot;Cargar archivo&quot; en el menú archivo. Haga clic en el icono de &quot;visor 2D&quot; en la barra de herramientas. </li><li> Ajuste del histograma haciendo clic en el icono de &quot;gama Fit&quot; (el icono azul en la esquina inferior derechade la pantalla Endrov). Ajuste el XYZ resolución por ir a &quot;Datos&quot; - &quot;Nombre de archivo&quot; - &quot;ImageSet&quot; - &quot;Canal&quot; - &quot;Establecer XYZ-resolución&quot;. Llene en los valores para X, Y, y Z, por ejemplo, 5, 5, 1 si X e Y resolución es de 0,2 micras y muestra cada 1 m en Z. </li><li> Para anotar los núcleos, pasar al plano de interés y haga clic en &quot;visor 2D&quot;. Seleccione &quot;Lineage&quot; en el menú desplegable y seleccione &quot;Nueva linaje&quot;. </li><li> Al hacer clic y arrastrar en el núcleo, que puede estar marcado. Para nombrar el núcleo, haga clic derecho y elegir la opción &quot;Cambiar el nombre de partículas&quot; en el menú desplegable. Para aumentar o disminuir el diámetro del círculo, arrastre el icono de la flecha que aparece a la izquierda del círculo marcado. Para marcar el plano central del núcleo, haga clic en el icono de la derecha. Cuando se utiliza un marcador de membrana de plasma, una gran esfera se puede extraer que cubrirá la mayor parte de la célula. </li><li> Para continuar en el tiempo y el plano, elija el &quot;Marco&quot; y &quot;Z&quot;opciones en la barra de herramientas inferior. Después de pasar al siguiente punto del tiempo, ajustar la posición o el tamaño del círculo que marca el núcleo en consecuencia. Repita esto hasta que la célula se divide rastreados. </li><li> Cuando hay una división celular, marcar los núcleos hijos y cambiar a &quot;espectador Lineage&quot;. Esto se puede seleccionar haciendo clic en el icono de &quot;Windows&quot; en la barra de herramientas superior. Marcar todos los tres núcleos simultáneamente, ir a la opción &quot;Lineage&quot; en la barra de herramientas superior y seleccione &quot;padre Asociado&quot;. </li><li> Cuando se termina el seguimiento celular, cambiará al canal que marca el resto de la división celular para el seguimiento. Para cambiar de canal, haga clic en el nombre del archivo en la esquina inferior izquierda de la barra de herramientas. El remanente de la división celular (o cualquier otra estructura) pueden ser rastreados como se ha descrito anteriormente para el núcleo. </li><li> Al regresar al software después de cerrar, hay que ir a &quot;Visor 2D&quot; - &quot;Lineage&quot; - &quot;Editar&quot; y hacer clic en el número de linaje que se editará. </li&gt; </ol> 6. Analizar cortical Flujo Actomiosina con PIVlab NOTA: PIVlab es un software disponible gratuitamente en: http://pivlab.blogspot.de/; puede ser invocado desde el entorno de línea de comandos del Matlab tecleando PIVlab_GUI. Cuando se trabaja con PIVlab, se recomienda guardar la serie de imágenes en una carpeta separada. <ol><li> Iniciar una nueva sesión del menú &quot;Archivo&quot;. Cargue los archivos de imagen haciendo clic en el botón &quot;Cargar imágenes&quot;. </li><li> Seleccione el estilo de secuenciación 1-2, 2-3, ... y navegue hasta el directorio que contiene la secuencia de las imágenes deseadas. Seleccione las imágenes y haga clic en el botón &quot;Agregar&quot; y de importación. </li><li> Ir a &quot;Configuración de Análisis&quot; y seleccione &quot;Exclusiones (ROI, Máscara)&quot;. Como alternativa, presione la tecla &quot;Ctrl + E&quot;. Utilice el botón &quot;Draw máscara (s) para el marco actual&quot; para desactivar la parte no deseada de la imagen / s (es decir, la zona de las afueras de embriones). </li><li> Seleccione &quot;Configuración de PIV&quot; from el menú &quot;Ajustes de Análisis&quot;. Como alternativa, presione la tecla &quot;Ctrl + S&quot;. Seleccione la opción &quot;ventana FFT deformación&quot; como el algoritmo PIV deseado. NOTA: la transformación rápida de Fourier (FFT) reduce el coste computacional pero sólo se recomienda la señal es muy por encima de ruido y si el desplazamiento de las partículas estudiadas no exceda de la mitad del área pase analizado (véase 6.5). </li><li> Introduzca los siguientes valores para los tres pasos, que son la zona de interrogación para la correlación cruzada de intensidad entre las imágenes siguientes: Pase 1: Interrogación área de 64 píxeles con un paso de 32. Pass 2: Interrogación superficie de 32 píxeles con un paso de 16 . Seleccione &quot;lineal&quot; de la deformación de la ventana del menú desplegable. Elija el método 2 * 3 puntos de Gauss para el desplazamiento de estimación sub-pixel. </li><li> Seleccione &quot;Analizar!&quot; desde el menú Análisis y utilice el botón &quot;Analizar todos los marcos&quot; para comenzar un análisis. </li><li> Para el procesamiento posterior seleccione &quot;validación vector&quot; de &quot;; Menú y establecer el umbral de filtro de desviación estándar (DESVEST) a 7 y se aplican a todos los marcos Publicar procesamiento &quot;. </li><li> Elija &quot;Derivar parámetros / modificar datos&quot; en el menú &quot;Plot&quot;. Seleccione &quot;Vectors [px / marco]&quot; en el menú desplegable. Ajuste la suavidad de vectores y filtro de paso alto y se aplican a todas las tramas. </li><li> Para calcular los vectores de medias de todos los marcos, establezca los &quot;marcos de segunda mano&quot; a 1: final y haga clic en el botón &quot;Calcular vectores medios&quot;. </li></ol>

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	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish.">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li><li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage.">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li><li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy.">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis.">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li><li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data.">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li><li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li><li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rotational+cortical+flow,+asymmetric+midbody+positioning,+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans.">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li><li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning.">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., B&#252;rglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endrov:+an+integrated+platform+for+image+analysis.">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li><li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIVlab+-+Towards+User-friendly,+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB.">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos.">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li><li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans.">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li><li>Naganathan, S. R., F&#252;rthauer, S., Nishikawa, M., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking.">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165 (2014).</li><li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans.">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation.">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li><li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans.">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li></ol>

Research in the lab of CP is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) and the LOEWE Research Cluster Ubiquitin Networks. CP is further supported by the European Union Framework Program 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

A través de seguimiento de objetos en el desarrollo, en particular, de seguimiento nuclear, ha sido posible dilucidar los mecanismos centrales de modelado de C. elegans embriogénesis 1,23,24. Ampliando esta estrategia para un mayor rendimiento, ha sido recientemente posible descubrir reglas de modelado adicionales y proponer un método de cómo deducir patrones gobierna de novo 10. Para muchos mutantes, sin embargo, los defectos de modelado precisas son todavía desconocidos. Los métodos descritos aquí son herramientas que pueden ser fundamentales para su esclarecimiento. Es importante destacar que se ha hecho evidente en los últimos años que, aunque muchos otros sistemas de modelos no siguen un desarrollo invariante como C. elegans, seguimiento de objetos y análisis de los datos de seguimiento cuantitativo es una herramienta crucial para identificar los mecanismos y mecanismos de la enfermedad de desarrollo. Los métodos que se muestran aquí son especialmente adecuados en la situación en que sería o bien ser demasiadodifícil de implementar soluciones de software más complejas y / o auto-generados, o simplemente demasiado costoso de implementar herramientas de software comercial, respectivamente. Es importante destacar que las herramientas discutidas aquí permiten al investigador para cargar y analizar los datos de forma independiente en la que instrumento que se han registrado. Por otra parte, si se utiliza el software de adquisición de imágenes de propiedad, ImageJ ofrece el plugin Bio-formatos que se pueden cargar los datos en formatos propietarios y guardarlos en formatos estándar (JPEG, TIFF). Un paso crítico en todos los protocolos que se basan en la microscopía de lapso de tiempo es para elegir las condiciones de derecho a obtener suficiente contraste en imágenes de microscopía, y, al mismo tiempo, para reducir la exposición a la radiación de la muestra. Esto depende en gran medida del tipo de microscopio utilizado y por lo general se recomienda el uso de técnicas de exploración rápida como disco giratorio o microscopía de iluminación solo plano. En concreto, para PIV de la dinámica de la corteza, las versiones anteriores de punto de exploraciónmicroscopios podría ser demasiado lenta para permitir la captura de señales corticales a una resolución y velocidad para realizar análisis válidos suficiente. Por tanto, es siempre crucial para evaluar cuidadosamente la exposición a la radiación y probar la viabilidad de la muestra. Además, aunque los protocolos que se utilizan aquí micobeads montar embriones, también es posible usar almohadillas de agarosa, que sólo toma un poco más tiempo para prepararse, pero es menos caro y con un poco de experiencia igualmente reproducible. Sin embargo, debe señalarse que la combinación de la almohadilla de agarosa y nanobeads es el método superior para la inmovilización a largo plazo de gusanos adultos ya que evita el uso de cualquier agente paralizante, por ejemplo, levamisol. Cabe señalar que las herramientas discutidos aquí tienen sus limitaciones, ya que no realizan análisis de datos totalmente automatizado. Sin embargo, para estructuras como restos de división celular, a menudo es difícil identificar un marcador molecular que sólo escontiene esta estructura, que es crucial para el seguimiento fiable. Por tanto, un importante reto de futuro radica en que incluye características como el aprendizaje automático y algoritmos de detección / segmentación adaptables en el software de acceso de fácil uso y abierto que discutimos aquí. Algunas de estas características se pueden encontrar en otros módulos de software, en particular software que puede tratar con seguimiento repetido en intervalos de tiempo más largos, o que se pueda comparar grandes conjuntos de datos de seguimiento (por ejemplo, StarryNite / AceTree 25 o Nucleitracker4D 26, que están diseñados para núcleos de pista utilizando proteínas histonas-fusión o husillos 27, o Simi BioCell 28). Estas herramientas pueden ser más complejos de implementar cuando el objetivo de seguimiento de las estructuras distintas de los núcleos. A pesar de la estructura particular que debe ser rastreado, estos programas son en general muy útil cuando se analizarán grandes cantidades de datos de imagen. Es importante destacar que existe compatibilidad entre el modulo de software mencionado anteriormentees. Cuando se trabaja con otros sistemas modelo (por ejemplo, mosca embriones, células cultivadas de mamíferos, etc.), los métodos presentados aquí también son muy adecuados para realizar un seguimiento de las estructuras ortólogos como se describe anteriormente. Más importante aún, independientemente del modelo de sistema bajo investigación, diferentes estructuras subcelulares, por ejemplo, los centrosomas, nucleolos, micropartículas, vesículas, etc. puede ser rastreado fácilmente, solamente los parámetros de adquisición tienen que ser ajustada para asegurar la captura completa de pistas de objeto.

Con las mejoras constantes de las proteínas fluorescentes, la ingeniería del genoma, microscopía óptica y soft y hardware, ahora es posible grabar el desarrollo de muchos organismos modelo con resolución espacio-temporal sin precedentes. Esto permite a los investigadores hacen preguntas que no podían ser abordadas con anterioridad o para revisitar los procesos de desarrollo conocidos con el fin de buscar los aspectos pasados ​​por alto. Este progreso ha despertado el campo de la biología del desarrollo cuantitativo, cuyo objetivo es la transformación de los modelos cualitativos e informales en los modelos cuantitativos mediante mediciones exhaustivas y análisis estadísticos. Seguimiento células y estructuras subcelulares ha hecho posible obtener modelos cuantitativos del desarrollo embrionario, la actividad del sistema nervioso, o división celular 1-12. Mediante el seguimiento de los restos de la división celular durante el desarrollo temprano de la C. elegans embrión, podríamos recientemente revelan que siguen un estéreoruta escrito y constituyen importantes factores de polarización 13,14. Aquí, los protocolos se presentan que hacen biología cuantitativa del desarrollo se acerca accesible para los no expertos. La atención se centra en tres herramientas recta hacia adelante, libremente disponibles que son implementables en cualquier laboratorio que tiene acceso a la microscopía confocal estándar y computadoras. Estos incluyen un protocolo para generar formas de células en 3D, un protocolo para realizar un seguimiento de los restos de la división celular, y un protocolo para describir cuantitativamente la dinámica actomyosin corticales. El nematodo C. elegans se utiliza como un caso ejemplar, sin embargo, los métodos y herramientas descritos aquí son adecuados para una variedad de preguntas en otros modelos biológicos, por ejemplo, células cultivadas, explantes de tejido, organoides o esferoides, otros embriones, etc. En general, algunos de los análisis que se muestran aquí también se puede realizar con el popular herramienta ImageJ código abierto (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; o FIJI, las &quot;baterías incluidas&quot; versión de ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) para los que se dispone de muchos plugins para diferentes análisis cuantitativos. Sin embargo, los programas aquí descritos están diseñados para hacer frente a problemas específicos. En primer lugar, IMOD, el procesamiento de imágenes, el modelado y la suite de pantalla puede ser utilizado para reconstrucciones en 3D de secciones seriadas de electrones o microscopía de luz 15. IMOD también contiene herramientas para la visualización de los datos 3D a partir de cualquier orientación. En segundo lugar, Endrov, un programa Java diseñado para realizar análisis de imágenes, procesamiento de datos, y la anotación de las redes o pistas (entre otros) sobre la base de una arquitectura de plugin extendida, con ImageJ compatibilidad plug-in 16. Contiene más de 140 operaciones de procesamiento de imágenes y una interfaz de usuario extensible en el que el modelo y los datos brutos se muestran por separado. Su código fuente se puede encontrar en https://github.com/mahogny/Endrov. En tercer lugar, PIVlab, un MHerramienta MATLAB para partículas digital de imagen velocimetría que permite al usuario analizar cuantitativa y cualitativamente campos de flujo de partículas 17. El uso de estos programas requiere una licencia de MATLAB que incluye la Imagen Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab es un programa diseñado para describir cuantitativamente el flujo. Se calcula la distribución de velocidad, magnitud, vorticidad, divergencia o cizalla dentro de pares de imágenes o series. Para esto, es cruzada correlaciona áreas pequeñas de las imágenes (llamados &#39;pases&#39; en la sección de protocolo) de un par de imágenes para derivar el desplazamiento de partículas más probable. Esta correlación cruzada se obtiene una matriz de correlación que se puede analizar en el dominio del espacio o de la frecuencia usando cualquiera de correlación cruzada directo o una transformación rápida de Fourier (FFT), respectivamente. El equipo utilizado aquí es un microscopio invertido equipado con un Nipkow (&#39;hilar&#39;) del disco, un EMCCD, 488 y 561 nm sólido-estándarláseres de estado, y 20x o 40x o aire 60x / plan apochromat objetivos inmersión en aceite o agua. Sin embargo, también es posible realizar formación de imágenes de lapso de tiempo con otras modalidades de imagen, por ejemplo, punto-, de línea o microscopía de barrido de hoja basado en láser, microscopía multi-fotón, así como microscopía de epi-fluorescencia combinado con deconvolución o estructurada iluminación. La ventaja de usar un sistema de disco de Nipkow es la adquisición de imágenes extremadamente rápido, especialmente si un modo de transmisión (movimiento continuo y de exploración del objeto en la dimensión z) está disponible. Además, para mejorar la resolución, un extensor de aumento 1,5 veces en la parte delantera de la EMCCD se puede utilizar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:71px;">Motic/VWR</td>
			<td style="width:119px;">OT4005S</td>
			<td style="width:167px;">Stereo microscope for dissection and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polybead Polystyrene Microspheres,&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">18329</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Embryo mounting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">20 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polybead Polystyrene Microspheres,&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Polysciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">876</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">Adult animal mounting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">0.1 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0902</td>
			<td style="width:167px;">Adult animal mounting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Cover glass 18x18 mm</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-1331</td>
			<td style="width:167px;">Embryo/adult mounting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Cover glass 24x60 mm</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-1339</td>
			<td style="width:167px;">Embryo mounting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Scalpel</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">233-5455</td>
			<td style="width:167px;">Embryo dissection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Silicone tubing</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">228-1501</td>
			<td style="width:167px;">Tubing for mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">30 mm PTFE membrane filter</td>
			<td style="width:71px;">NeoLab</td>
			<td style="width:119px;">Jul-01</td>
			<td style="width:167px;">Filter for mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Capillary tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">621-0003</td>
			<td style="width:167px;">Pipette tip for mouth pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Vaseline</td>
			<td style="width:71px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">E746.1</td>
			<td style="width:167px;">Embryo/adult mounting</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:71px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">5210.5</td>
			<td style="width:167px;">Adult animal mounting</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Potassium-di-hydrogenphosphate</td>
			<td style="width:71px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">P018.2</td>
			<td style="width:167px;">M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Di-sodium- hydrogenphosphate</td>
			<td style="width:71px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">P030.2</td>
			<td style="width:167px;">M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:71px;">Roth</td>
			<td style="width:119px;">3957.1</td>
			<td style="width:167px;">M9 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">VisiScope Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:71px;">Visitron Systems</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking and quantifying developmental processes in c. elegans using open-source tools

Cuantitativamente capturar los procesos de desarrollo es crucial para derivar modelos mecanicistas y clave para identificar y describir los fenotipos mutantes. Aquí se presentan los protocolos para la preparación de los embriones y de adultos C. elegans animales para microscopía de lapso de tiempo corto y largo plazo y los métodos para el seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo. Los métodos presentados se basan en C. cepas disponibles desde el Caenorhabditis Centro de Genética y en software de código abierto elegans que se pueden implementar fácilmente en cualquier laboratorio independiente del sistema de microscopía utilizado. Una reconstrucción de un modelo de células en forma de 3D usando el IMOD software de modelado, seguimiento manual de las estructuras subcelulares marcadas con fluorescencia utilizando el polivalente programa de análisis de imágenes Endrov, y un análisis de flujo contráctil cortical usando PIVlab (Resuelta en el Tiempo Digital por imágenes de partículas Velocimetría Herramienta para MATLAB) se muestran. Se discute cómo estos métodos también se pueden implementar to cuantitativamente capturar otros procesos de desarrollo en diferentes modelos, por ejemplo, el seguimiento de la célula y del linaje de rastreo, seguimiento del flujo de vesículas.

Mediante el uso de protocolos de 2, 3 y 4, time-lapse de las gónadas de tipo salvaje C. elegans adultos se realiza (OD58 cepa (UNC-119 (ed3) III; ltIs38 [PAA1; pastel-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)]), que expresa un marcador de membrana de un promotor de la línea germinal ). Centrándose en el turno de la gónada, un modelo 3D de las células germinales se genera a partir de los datos de microscopía (Figura 2). Este modelo permite analizar los cambios en el tamaño celular, mientras que el tránsito células forman el distal al brazo proximal, revela que la organización del raquis y el tamaño de los contactos de las células individuales a los raquis (véase también http: //www.wormatlas. org /% 20line hermafrodita / germen / Germframeset.html). A continuación, los protocolos 1, 3 y 5 se utilizan para realizar la microscopía de lapso de tiempo a largo plazo de C. elegans embriones (CHP52 cepa que es un cruce de RW10226 cepa (UNC-119 (ed3) III; itIs37 [pastel-1p :: mCherry :: H2B :: pastel-1 3&#39;UTR + UNC-119 (+)]; stIs10226 [su-72 promotorSU-24 :: mCherry fusión traduccional con let-858 3 &#39;UTR + (+)]) y LP162 cepa 119 unc (Nmy-2 (CP13 [Nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). En esta cepa, es posible seguir ambos núcleos (a través de las proteínas de fusión mCherry-histonas) y los restos de la división celular (a través de la genómicamente modificado no músculo miosina locus II donde un GFP se ha integrado en el bastidor a través de la CRISPR / tecnología Cas9 19 ) paneles simultáneamente cuando se utiliza de dos colores microscopía de lapso de tiempo (Figura 3, izquierda). Los modelos obtenidos por lineaging de ambas estructuras en Endrov muestran el patrón estereotipado descrito previamente de la división celular herencia remanente 13,14. Por otra parte, de los datos lineaging, las pistas para cada célula y la división celular remanente (Figura 3, paneles de la derecha) y el tiempo de persistencia de la división celular remanente (basado en el NMY-2 GFP -signal), así como la correlación a la célula división de temporización se puede obtener (&lt;strong&gt; Figura 4, se muestra sólo el linaje ABA). Cuando se utiliza un marcador de membrana de plasma Además, también es posible observar el punto de división celular internalización remanente tiempo. Por último, mediante el uso de protocolos de 1, 3 y 6, microscopía de lapso de tiempo a corto plazo con alta resolución temporal (intervalos 5s entre la grabación de un z-stack) de la miosina no muscular cortical II (NMY-2 GFP) se realiza. El foco aquí está en las diferencias en la dinámica del flujo de polarización cortical mediante la comparación de este flujo entre el tipo salvaje y embriones RNAi-agotadas para la proteína de activación de Rho GTPasa RGA-3 20,21. Similar a las observaciones recientes 22, el flujo en embriones de tipo salvaje es predominantemente a lo largo del eje largo del embrión (Figura 5, paneles de la izquierda), mientras que el flujo en el RGA-3 RNAi embrión es ortogonal a este eje. Esta es la superposición de manifiesto a partir de puntos de tiempo consecutivos o de los analys PIVes (Figura 5, paneles inferiores). Para observar estas diferencias, es importante elegir un intervalo de muestreo de modo que las partículas de flujo corticales se pueden resolver sin ambigüedades de interpretación precisa de los datos. Se recomiendan intervalos de tiempo más pequeños (≤5 seg) para evitar grandes desplazamientos y vectores desaparecidos. La ventana de interrogación debe ser lo suficientemente grande como para acomodar el tamaño de las partículas a analizar (gránulos corticales). La superposición entre ventanas de interrogación vecinos permite reducir el espaciado de vector y por lo tanto aumenta el número de vectores en la cuadrícula. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig1.jpg" /> Figura 1. Montaje de una pipeta de boca Izquierda:. Piezas necesarias para montar una pipeta de boca con filtro. Derecha:. La pipeta montada <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig1large.jpg" target="_blank">favor</a>haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig2.jpg" /> Figura 2. Modelo 3D de la región a su vez gónada Arriba a la izquierda:. Proyección en 3D de un solo punto de tiempo a partir de datos de microscopía de lapso de tiempo. Top centro y derecha: modelos 3D de los datos de microscopía. Conclusión:. Los detalles de los contactos célula-raquis <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig3.jpg" /> Figura 3. Seguimiento de los núcleos y los restos de la división celular Izquierda:. Proyecciones en 3D a partir de datos de microscopía de lapso de tiempo. Secundaria: Instantáneas del modelo adquirido de seguimiento de ambos núcleos (esferas de colores) y los restos de la división celular (esferas grises). Derecha: Snapshotsde la división celular de seguimiento remanente. Los caminos de los restos también se muestran. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig3large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig4.jpg" /> Se muestran Figura 4. celular y la división celular linajes remanente para el sublinaje ABA. Linajes de un embrión representativo. Divisiones celulares están marcados por cuadrados. Cada marca de graduación corresponde a 1 min. Los restos de la división celular fueron nombrados después de las hijas que surgen de la división en la que se genera el remanente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig4large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig5.jpg" /><br/&gt; Figura 5. Análisis de flujo contráctil cortical con PIV Top:. Alambiques de proyección en 3D de la microscopía de lapso de tiempo que representan el inicio (primera fila) y el final (segunda fila) de la ventana de tiempo utilizado para calcular el campo vectorial con PIVlab. La tercera fila de paneles muestra la superposición de todos los puntos de tiempo de la ventana de tiempo. Conclusión:. Campos vectoriales obtenidos por PIVlab <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Película 1" src="/files/ftp_upload/53469/53469movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/movie_3dmod_annotated.mp4">Video 1</a> -. Relacionados a la Figura 2. Modelo 3D de la región a su vez gónada El vídeo comienza con el desplazamiento a través de toda la pila de aviones utilizados para segmentar las células. Después una proyección máxima 3D de la pila<html> se muestra, seguido por el modelo segementation 3D que gira alrededor de los ejes x e Y (con y sin raquis de la gónada segmentado). <img alt="Película 2" src="/files/ftp_upload/53469/53469movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/Max_projection_Endrov_data_annotated_for_movie.mp4">Video 2</a> - relacionado con la figura 3. Seguimiento de los núcleos y los restos de la división celular Izquierda: proyecciones en 3D a partir de datos de microscopía de lapso de tiempo.. Medio: El modelo obtenido de seguimiento de ambos núcleos (esferas de colores) y los restos de la división celular (esferas grises). Derecha: restos división celular y sus trayectorias. La barra de escala = 10 micras. <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53469/53469movie3.jpg" />_for_movie_with_PIV_data.mp4 &quot;&gt; Video 3 - relacionado a la Figura 5. Análisis de flujo contráctil cortical con PIV grabaciones con lapso de tiempo máximo de proyección en 3D de un tipo silvestre representativa y RGA-3 RNAi embrión utilizado para calcular el campo vectorial con PIVlab barra de escala.. = 10 micras.

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Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en<em&gt; C. elegans</em&gt; Uso de las herramientas de código abierto

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

8.8K vistas.  Goethe University. Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Video: Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) para desarrollar herramientas de diagnóstico

Investigación

Biología

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source de análisis de contenidos de alta Utilizando microscopía de fluorescencia automatizado de imágenes por vida

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

El seguimiento y cuantificación de los procesos de desarrollo en

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