El financiamiento fue proporcionado por la NSF CCLI # 0633618 y la Universidad de Ohio. Algunas cepas fueron proporcionados por el Centro de Genética Caenorhabditis. El estudiante de posgrado Reetobrata Basu aparece en el video.

<ol>
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El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

El protocolo de congelación de craqueo es uno de varios métodos para la tinción de anticuerpos en C. elegans. Proporciona una manera relativamente fácil de manchar los gusanos, pero requiere de reactivos específicos y práctica para obtener resultados óptimos. Los pasos críticos (descritos en la Figura 1) son: 1) la preparación de diapositivas (consulte los pasos 1 y 2) la compresión manual de los nematodos (consulte los pasos 2 y 3) de fijación rápida (ver paso 3). En primer lugar, para maximizar la adherencia de los nematodos a las diapositivas, lo mejor es preparar diapositivas de alto peso molecular (polímero de largo) polilisina, en lugar de confiar en muestras preparadas comercialmente. Diapositivas comerciales están recubiertos con polilisina para permitir que las células se adhieran, mientras se desliza por congelación de craqueo están diseñados para adherirse a la cutícula de los nematodos enteras. En segundo lugar, el procedimiento para la compresión correcta de los gusanos entre las diapositivas antes de la congelación es crítico. Se requiere manos y la práctica constantes para presionar las diapositivas juntos utilizando la cantidad correcta dela presión para que los gusanos individuales en contacto los dos carros sin destruir su morfología. Ya sea demasiada o muy poca compresión conduce a una mayor pérdida de gusanos durante la fijación. Se necesita más atención para mover las diapositivas sobre la superficie enfriada con hielo seco para congelar sin mover las diapositivas uno con relación a otro. Cualquier movimiento hará que los gusanos que destruyen o tuercen. En tercer lugar, como con cualquier técnica de fijación, los gusanos congelados deben ser colocados directamente en fijador antes de descongelar. De lo contrario, el antígeno puede difundir, el suministro de información engañosa sobre la localización subcelular. Si estos pasos críticos son todo hecho correctamente, para obtener mejores resultados sigue siendo necesario para escanear varias diapositivas manchadas de encontrar gusanos con la mejor morfología. Un aspecto inevitable de esta técnica es que los gusanos se pueden comprimir en una dimensión. La compresión es más notable en los adultos, en los que el diámetro aparente del cuerpo redondo en el eje Z puede ser sólo uno-cuatroª que se observa en los X e Y-ejes. Esta compresión tiende a disminuir en las larvas más pequeño, y puede ser insignificante en los embriones. Debido a la forma en que los nematodos vivos se mueven durante la preparación de los portaobjetos, los gusanos son teñidas a menudo en sus lados. Esto imita la orientación de gusanos en platos de agar, con la línea media lateral acostado se extiende por el centro del gusano manchado (véanse las Figuras 2-4). Por lo tanto, la compresión es generalmente en la dimensión lateral. Mientras que esto hace en realidad microscopía de fluorescencia estándar más fácil (más de la muestra estará en foco simultáneamente), significa que reconstrucciones 3-D no será exacta. Como con cualquier tinción de anticuerpos, es importante para comprobar la especificidad de la unión. En la mayoría de las especies, esto se hace mediante controles tales como afinidad agotamiento de su anticuerpo o sin usar primaria. En C. elegans, medios más específicos de la comprobación de la especificidad están a menudo disponibles. Mutantes nulos para el gen y la proteína de interés proporcionanun excelente control de la especificidad de la tinción. Ambas cepas deben fijarse en las mismas condiciones antes de la comparación, ya que la tinción es generalmente la fijación dependiente. Si no hay ningún mutante nulo está disponible, entonces es relativamente fácil en C. elegans para disminuir los niveles de proteína con RNAi (inhibición del ARN 12) y buscar tinción disminuido en gusanos tratados RNAi. Los anticuerpos policlonales a menudo muestran la tinción no específica, incluso si se purificó por afinidad con el antígeno. A menudo, la fijación de luz usando metanol y acetona (el que se fijan las proteínas mediante precipitación de ellos en lugar de reticulación de ellos) da la tinción no específica más baja que el formaldehído o glutaraldehído (que generan más epítopos de variantes debido a la variada reticulación) 1,11. Sin embargo, en C. elegans tinción no específica es muy común en cualquier condición de fijación, especialmente en el intestino. Si el antígeno se expresa en el intestino, a continuación, esta tinción no específica puede enmascarar su staini específicang. Si mutantes nulos están disponibles para su proteína, a continuación, gusanos fijos con este método se pueden utilizar para afinidad agotar su suero. Desde antigenicidad depende de las condiciones de fijación, los gusanos que se utilizan para agotar su anticuerpo deben estar preparados de la misma manera como los gusanos de tipo salvaje está tinción. Después de una ronda de agotamiento de la tinción no específica, mutante y de tipo salvaje gusanos pueden ser manchados en paralelo con el suero agotado para un excelente control. Ronda adicional de agotamiento con mutantes se puede hacer según sea necesario. Esta técnica es muy útil para probar nuevos anticuerpos para la tinción específica bajo una variedad de condiciones. Estos pueden ser anticuerpos generados contra C. elegans proteínas o anticuerpos generados contra las proteínas conservadas de otras especies. Mientras que este método ofrece la mejor morfología con nematodos ligeramente fijos, es relativamente fácil de tratar una gama de fijadores para determinar qué condiciones, en su caso, dar resultado específicos. A diferencia de otros métodos para la fijación del disco utilizando formaldehído o glutaraldehído, enzimática o reducción de los tratamientos no son necesarios para la preparación de la muestra. Dado que estos tratamientos pueden disminuir la antigenicidad, esto aumenta la capacidad de identificar anticuerpos específicos y sus condiciones óptimas de fijación. Si las condiciones de fijación de los discos funcionan mejor, el experimentador puede entonces recurrir a métodos realizados sobre gusanos intactas para obtener una mejor morfología (resumidos en nuestros trabajos anteriores 4). Si la fijación de la luz conserva la antigenicidad, entonces esta técnica se puede utilizar para todas las manchas más para microscopía de luz.

Para determinar la localización celular y subcelular de las proteínas, los científicos han denominado tradicionalmente tejidos con anticuerpos seleccionados para reconocer específicamente las proteínas particulares 1. En algunos organismos modelo como C. elegans, tinción de anticuerpos a menudo ha sido sustituido por técnicas genéticas moleculares, que dan resultados más rápidamente. Estos incluyen los organismos de transformación con constructos que consisten en fusiones de genes entre el promotor y las regiones codificantes del gen de interés y la proteína fluorescente verde. Sin embargo, las técnicas moleculares están sujetas a una serie de artefactos, incluyendo problemas con conocer la verdadera promotor y cambios en la expresión de los constructos en el número de copias alto (las técnicas habituales en C. elegans) 2,3. Por lo tanto, la tinción con anticuerpos sigue siendo un objetivo para muchos científicos que estudian la función de proteínas in vivo. La tinción con anticuerpos tejidos puede ser difícil, ya que untibodies sólo podrán reconocer su antígeno en una determinada conformación 1. Por ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer sólo antígeno desnaturalizado o intactos fija de una manera particular y pueden no reconocer el antígeno in situ. El problema de la tinción de anticuerpos en los nematodos se ve agravada por el hecho de que la cutícula del nematodo forma una barrera relativamente impermeable, bloqueando el acceso de los anticuerpos a los tejidos. Hay varios métodos diferentes utilizados para la tinción de anticuerpos en C. elegans (revisado en nuestros trabajos anteriores 4). Para la tinción intactas &quot;gusanos, &#39;se desarrollaron métodos para congelar y descongelar en un fijador relativamente duro (formaldehído o glutaraldehído), los ciclos de congelación-descongelación ayudan a romper la cutícula para permitir una rápida penetración del fijador 5. Después de la fijación, la cutícula se permeabilizaron para permitir la penetración del anticuerpo; métodos incluyen el tratamiento con agentes, colagenasa, o tanto la reducción de 5-7. Estos treatments conservan la morfología, pero a menudo reducen o destruyen el reconocimiento de anticuerpos. Los métodos alternativos incluyen la disección 8 para permitir la penetración de anticuerpos. &quot;Freeze-cracking&quot; es una forma de obtener acceso al interior del gusano semi-intacta para permitir la tinción de anticuerpos 9-10. Freeze-craqueo se puede realizar con una variedad de condiciones de fijación, evitando tratamientos de colagenasa y de reducción. Los nematodos se colocan entre dos adhesivos diapositivas, congeladas, y luego las diapositivas se separan, dejando la mayor parte del nematodo en el portaobjetos inferior y gran parte de la cutícula en la diapositiva superior. La corredera inferior se puede colocar en fijador y toda la diapositiva con nematodos adheridas se transfiere a través del procedimiento de tinción de anticuerpos. El método no presentan dos dificultades principales. En primer lugar, es difícil aplicar la cantidad correcta de presión necesaria para dividir los nematodos sin deformar gravemente ellos. En segundo lugar, muchos de los gusanos no se smarque a cualquiera de diapositivas, y se perderá en el fijador o enjuagues. Sin embargo, con los portaobjetos y la práctica adecuados, el método producirá rápidamente nematodos con morfología razonable que se puede utilizar con una amplia variedad de fijadores y anticuerpos. El método se puede variar ligeramente, dependiendo de la meta del experimentador. Si se desea tinción de los nematodos individuales (por ejemplo, para determinar si un único transformante ha alterado la tinción de anticuerpos), a continuación, se desliza con la adhesión máxima (pero mayor tinción de fondo) se puede utilizar, tales como diapositivas preparadas en el laboratorio con polilisina adicional (ver más abajo). Para formaldehído o glutaraldehído fijación, toboganes más altos de adhesión (diapositivas polylysine preparadas en el laboratorio) deben ser usados, ya que los nematodos se adhieren más mal a la polilisina después de estas fijaciones. Si los nematodos de tipo salvaje se fijaron con metanol y / o acetona, y luego se desliza con una menor adherencia y la tinción de fondo más baja se debe utilizar (comercial o de ldiapositivas aboratory preparados). Si una variedad de anticuerpos y fijadores están siendo utilizados en el laboratorio, una selección de diapositivas se puede preparar con anticipación y se almacena hasta que se necesita. Después de acceso al tejido nematodo se ha adquirido, los procedimientos de tinción de anticuerpos siguen métodos estándar (con incubaciones más largas característicos de los tejidos en lugar de células de 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Para la tinción de C. elegans con anticuerpos, la cutícula relativamente impermeable deben ser anuladas por métodos químicos o mecánicos. &quot;Freeze-cracking&quot; es un método utilizado para extraer físicamente la cutícula de los nematodos mediante la compresión de nematodos entre dos diapositivas adherentes, la congelación, y tirando de las diapositivas aparte. Freeze-craqueo proporciona una manera simple y rápida para obtener acceso a los tejidos sin tratamiento químico y se puede utilizar con una variedad de fijadores. Sin embargo, conduce a la pérdida de muchas de las muestras y la compresión requerida distorsiona mecánicamente la muestra. Se requiere práctica para maximizar la recuperación de muestras con buena morfología. Freeze-craqueo puede ser optimizado para condiciones específicas de fijación, de recuperación de muestras, o bajo la tinción no específica, pero no para todos los parámetros a la vez. Para los anticuerpos que requieren fijación de condiciones muy duras y toleran los tratamientos químicos necesarios para permeabilizar químicamente la cutícula, treatmenpuede ser preferido t de nematodos intactas en solución. Si el anticuerpo requiere una solución más ligero o si las condiciones óptimas de fijación son desconocidos, congelar-craqueo proporciona una manera muy útil para ensayar rápidamente el anticuerpo y puede proporcionar información específica de localización subcelular y celular para el antígeno de interés.

Cuando los gusanos se comprimen correctamente, agrietados, y ligeramente fijos, prácticamente todo el gusano puede ser accesible para la tinción de anticuerpos (ver Figura 2). La ubicación de los núcleos, como se indica por la tinción DAPI indica qué partes del gusano están intactos Cuando los gusanos se someten a un fijador más duro, tal como formaldehído, la morfología del gusano puede distorsionarse (como se ve por la aparición no natural ondulado de la músculos de las figuras 3A-D). Otro problema común es la fijación irregular o la penetración de tejidos particulares. Un ejemplo de esto se muestra en las Figuras 3E-H, donde el músculo se tiñe sólo en una parte del tornillo sin fin, a pesar del hecho de que la presencia de otra tinción, incluyendo la tinción de ADN, indica que al menos parte del cuerpo estaba presente ( es decir, no se elimina durante la congelación-cracking). El patrón resultante de tinción parcial se puede identificar fácilmente con la práctica, de modo que toda la DISTRIBUCIel de la tinción se puede determinar aún si un solo gusano muestra la tinción desigual. Los problemas más comunes encontrados con la congelación de craqueo utilizando cualquier condición de fijación se ilustran en la figura final (Figura 4). El problema más común es la torsión de la muestra debido al movimiento relativo de las dos correderas durante la compresión. El hecho de que el cuerpo del gusano se tuerce justo posterior de la faringe puede ser visto por la morfología de los tejidos teñidos. Esta imagen también muestra el problema con la tinción de fondo, debido a anticuerpo se pegue a la poli-lisina recubrimiento de la diapositiva. Tenga en cuenta, sin embargo, que todas estas imágenes fueron obtenidos mediante diapositivas realizadas durante los primeros intentos de tinción de anticuerpos de estudiantes en un curso de laboratorio de biología celular. Incluso con la práctica, muchos gusanos individuales mostrar los problemas observados en la Figura 4. Sin embargo, en cualquier una diapositiva, gusanos como los que se observan en las Figuras 2 y 3 pueden ser fundacionesD y examinado. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de los procedimientos. Diagrama de flujo que indica los pasos para llevar a cabo el procedimiento de congelación y el agrietamiento completo. Alternativas para variadas condiciones de fijación y el número de gusanos se indican. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig2.jpg" /> Figura 2. Ligeramente fijos, gusanos y teñidos con los jefes de dos adultos hermafroditas fijadas con metanol-acetona y marcadas con anticuerpos múltiples y colorantes:. A) de anticuerpos primaria para hablar (colina acetiltransferasa) y anticuerpo secundario conjugado con Cy3, B) DAPI (ADN azul) , C) mineralgon Verde 488-anti-GFP (proteína verde fluorescente), D) muestra la superposición (con dos marcadores colinérgicos, Cy3 anti-chat y Cy5-anti-VAChT (transportador vesicular de acetilcolina) que se muestra en rojo). Esta cepa transgénica (PS4657) expresa una fusión de traducción entre GFP y AJM-1, que se encuentra en la faringe uniones apicales. Las imágenes son proyecciones máximas de serie de imágenes de confocal, barra de escala es de 50 micras. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes fijas adultos distorsiones de formaldehído-asociado. Formaldehído teñidas con Cy3-phalloidin (une actina filamentosa), DAPI (ADN azul), y Oregon Green 488-anti-GFP. AD) Fours del cuerpo justo por detrás de la vulva (a la izquierda) en el mismo nematodo, que muestra una morfología poco natural ondulado debido a la distorsión enproducido por la fijación. a) Rojo-faloidina muestra la morfología del músculo ligeramente irregular. B) Los núcleos (azul) se distribuyen uniformemente a lo largo del tornillo sin fin. C) verde muestra la distribución de una proteína de fusión GFP :: CED-1 en la membrana plasmática de la célula gonadal vaina, dirigido por el promotor Lim-7 (cepa MD701). d) muestra la superposición de estos tres colorantes. EH) Etiquetado puede variar con diferentes colorantes en el mismo nematodo. E) faloidina (rojo) Etiquetas de sólo una parte de el músculo en un lado del gusano. F) Los núcleos (azul) están presentes en todo el gusano (aunque se tiñeron con intensidad desigual). G) El OG488-anti-GFP etiquetas 19 de colágeno :: GFP en la cutícula en un lado de el gusano que carece de tinción del tejido muscular más central, lo que indica que el músculo está presente pero no la tinción en una superficie. H) Muestra la superposición de los tres colorantes. Las imágenes son maxproyecciones IMAL de serie de imágenes de confocal, barras de escala son 50 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig4.jpg" /> Figura 4. Larva distorsiones de compresión asociada. Formaldehído fijo manchada con A) Cy3-phalloidin (se une actina filamentosa), B) DAPI (ADN azul), C) Oregon-Green 488-anti-GFP, D) de superposición. El giro en el cuerpo justo posterior de la faringe es aparente, como la célula excretora verde y transversal cordón nervioso ventral sobre el resto del cuerpo. Alta tinción de fondo también es evidente con Cy3-phallodin. Esta cepa expresa una proteína :: VHA-8 de fusión GFP, que se encuentra predominantemente en la célula excretora. Las imágenes son proyecciones máximas de serie de imágenes confocal que se extendía a la superficie de la diapositiva (que conduce a alta tinción de fondo); barra de escala es de 50 micras.

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Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

&quot;Freeze-craqueo,&quot; un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

22.6K vistas.  Ohio University.  "Freeze-craqueo," un método para exponer los tejidos internos del nematodo C. elegans a anticuerpos para la localización de proteínas, se demuestra. 

Video: Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

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Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para la tinción de anticuerpos enteros en el monte del polluelo

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

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The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

La determinación de perfiles genéticos de expresión en C. elegans Utilización de microarrays y PCR en tiempo real

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un Modelo Anoxia inanición por isquemia / reperfusión en el<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Los métodos para la piel Heridas y ensayos para Respuestas de heridas en<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...