Queremos reconocer el espíritu de cooperación de todos los miembros Caldwell laboratorio. Movimiento de investigación trastornos en el laboratorio ha sido apoyado por la distonía Bachmann-Strauss y la Fundación Parkinson, Reino Parkinson Foundation, American Parkinson Disease Association, Asociación de la Enfermedad de Parkinson de Alabama, la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson, y una investigación de pregrado.

Plásmido de expresión de construcción Dos plásmidos son necesarios: una para la expresión específica de tejido del gen de interés y un segundo como marcador de transformación seleccionables. Experimental plásmido <ol><li> Seleccione un promotor que se expresa en el tipo de tejidos / células de interés, por ejemplo, un nervio o músculo promotor específico. Si se va a expresar múltiples genes dentro del mismo tejido, un cassette promotor plásmido en el sistema de puerta de enlace (Invitrogen) se puede utilizar. Este enfoque permite la inserción de un gen de interés aguas abajo del promotor de 4 clonación de recombinación. En general, 2-5 kb de secuencias de aguas arriba es suficiente para tener una expresión correcta y exacta. </li><li> El cDNA del gen de interés puede ser clonado en dos formas: <ol><li> Clonación convencional con enzimas de restricción. </li><li> Para la clonación de puerta de enlace, que es amplificada por PCR utilizando los cebadores que contienen la puerta de enlace att secuencia B de recombinación. El cDNA amplificado se recombinan en la primera pDONR201 vector de donantes para crear el vector de entrada y luego se transformó en E. coli cepa DH5a. Después de la selección de recombinantes éxito y mini-prep aislamiento de ADN, el vector de entrada se recombina en el vector destino promotor que contiene para crear el plásmido de expresión. Detalles sobre la clonación de recombinación están disponibles, ya sea el manual de Invitrogen Gateway o en Caldwell et al. 5. </li></ol></li></ol> Marcador seleccionable plásmido Ejemplos de plásmidos marcador transgénicos incluyen rol-6 o el uso del promotor de la pared muscular del cuerpo unc-54 para dirigir la expresión de proteínas fluorescentes. Estos plásmidos marcadores suelen estar disponibles dentro de la comunidad de investigación bajo pedido. Microinyección de C. elegans Preparación <ol><li> Realizar el aislamiento del ADN de los dos plásmidos que se van a inyectar. Cuantificar ellos y se mezclan en una proporción de 1:1 de 50 ng / l cada uno. </li><li> Preparar pastillas de agar: <ol><li> Haga una solución al 2% de agarosa en el agua, el calor o en el microondas hasta que se disuelva. </li><li> Establecido varios 22 x 50 mm cubreobjetos en una mesa de trabajo. </li><li> Con una pipeta Pasteur, se coloca una gota de la agarosa derretida en una cubierta de vidrio y colocar inmediatamente una tapa de vidrio segundo a través de la caída en un ángulo de 90 a la primera. Repita este procedimiento para varios vasos de las demás. El diámetro del disco aplanado de agarosa debe estar entre 15-20 mm. </li><li> Después de la agarosa se ha solidificado (esto sólo se tarda un minuto), retire la tapa de vidrio y deje que el cojín de aire seco por completo (varias horas o toda la noche). </li><li> Tienda de las pastillas en una caja cubierta de vidrio a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Hacer cargadores aguja para solución de ADN: Cargadores de aguja son creados a partir de 100 tubos capilares l que se calientan en el centro sobre una llama abierta y rápidamente sacó a sus aproximadamente el doble de longitud. Las dos mitades se rompió además una vez que el tubo capilar se enfría. 10-20 arsenal cargadores de aguja para la inyección. Guárdelo en posición vertical en un bastidor de tubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no atravesar a sí mismo en los puntos. </li><li> Hacen que las agujas de microinyección: La aguja está hecho de un tubo especial capilar que contiene un filamento de vidrio interior, este filamento sirve como mecha para la solución de ADN. Estos se extraen en una máquina de aguja-tirador. Utilizamos un Narishige PP-830 extractor con un ajuste de calor de 24,8. Varias agujas se tiran a la vez y se almacenan en una pequeña caja de plástico. Agujas múltiples pueden ser fácilmente &quot;montado&quot; en una tira de plastilina para almacenamiento a largo plazo. </li><li> Punta de la aguja &quot;interruptores&quot;: La punta de la aguja de microinyección se tira tan bien que en realidad es cerrado a fin, y debe ser rota abierta con pequeños fragmentos de cristal de la cubierta. Estos son preparados por el ajuste de un 18 x 18 mm cubierta de cristal en una toalla de papel y ejerciendo una suave presión hasta que se rompe en varios pedazos. Fragmentos de un tamaño útil es de aproximadamente 3 x 4 mm. </li><li> Crecen de forma silvestre tipo (N2) los gusanos a la etapa adulta temprana para la inyección mediante procedimientos estándar de 6. Preparar adecuadamente organizado cerca de 100 gusanos / construir inyectado. </li></ol> Procedimiento <ol><li> Abra la válvula principal en un tanque de helio que está conectado a un brazo de la aguja de microinyección y el soporte. Cierre la válvula de regulación para permitir que el gas para entrar en la línea, con lo que la presión a 35 psi. Tenga en cuenta que el gas puede ser liberado mediante un pedal. </li><li> Inserte un cargador de aguja en un tubo de la boca pipeteador estándar (que se encuentran en envases de tubos capilares) y la elaboración de una pequeña cantidad de la mezcla de plásmidos (~ 1 l). </li><li> El cargador de la aguja se coloca cuidadosamente en el extremo posterior de una aguja de inyección y se inserta suavemente todo el camino a través de la longitud dela aguja hasta que sienta resistencia. Expulsar a la solución de ADN por soplando suavemente, a continuación, retire el cargador. </li><li> Insertar la aguja en el brazo de la microinyección, teniendo cuidado de colocarla dentro de la junta de goma interno pequeño. </li><li> Coloque un trozo de aguja rotura de cristal de la cubierta en un borde de una plataforma de agar. Cubrir el fragmento, así como toda la superficie de la almohadilla de agar, con aceite de halocarbonos. Coloque la almohadilla de agar en el escenario de un microscopio invertido. </li><li> Posición de la aguja en el centro del campo de visión con el objetivo de 4X y la iluminación de campo claro, pero aún no se baja en el aceite. Además, la posición del borde interior de la astilla de cristal de la cubierta en el centro, a continuación, centrarse en él (aún con el objetivo 4X). Bajar la aguja en el aceite, con lo que en el mismo plano focal que el trozo de cubierta de vidrio. Levante la ampliación por el cambio con el objetivo de 40X. Centrarse en el borde del casco y la posición de la punta de la aguja, si es necesario. </li><li> La apertura de la punta de la aguja de inyección, suavemente empujar la aguja en el borde de la tapa de vidrio fragmento, mientras que al mismo tiempo la aplicación de un pulso corto de gas a través del pedal. La aguja se rompe lo suficientemente abierta cuando pequeñas gotas de líquido escapar del extremo de la aguja. Exceso de flujo de líquido debido a una abertura muy grande no es deseable, ya que matar a los animales. </li><li> Retire la almohadilla de agar a partir de la etapa de aumento de la aguja hacia arriba, pero no cambiar la posición de X o Y-eje. Deslice la etapa de debajo de la aguja, retire la almohadilla agar y colocarlo en un microscopio de disección. La transferencia de un gusano en la almohadilla, debajo de la superficie del aceite. Si el gusano se retuerce, frotar suavemente hasta que haga contacto con la almohadilla de agar. El gusano húmedos deben adherirse a los secos de agarosa. </li><li> Inyección <ol><li> Coloque rápidamente la parte de atrás pad agar en el escenario, centrando el gusano en el campo de visión. </li><li> Baje la aguja en el mismo plano de enfoque como el gusano. </li><li> Cambie el filtro de Hoffman Iluminación (un tipo de filtro de contraste). Esto permite que los detalles morfológicos del gusano a ser visible. Si Nomarski / DIC óptica están disponibles en el ámbito invertida que funciona tan bien. Utilizando el objetivo 40X, se centran en el &quot;grano&quot; centro sincitial de las gónadas del gusano, por debajo del &quot;nido de abeja&quot;, patrón de los núcleos germinales (elegir la gónada se coloca en el lado de la lombriz frente a la aguja). </li><li> Afinar la posición de la aguja hasta que la punta está también en el foco (el mismo plano que la gónada &quot;grano&quot;). </li><li> Suavemente inserte la aguja en el centro de la gónada y aplicar un breve pulso de la presión del gas para expulsar a una gota o dos de ADN en el brazo de las gónadas. Usted debe observar una ola de expansión de líquido a través de la gónada distal. No asuma más líquido es mejor, ya que un exceso de líquido puede fluir en la curva proximal del brazo de las gónadas, lo que puede detener la producción de ovocitos. Si es posible, dependiendo de la posición del gusano, se inyecta el brazo gonadal otros de la misma manera. </li><li> Es importante trabajar con rapidez, mientras que la inyección de un gusano, ya que puede secarse. La decisión de inyectar el brazo gonadal segundo depende de la rapidez con que puede volver a la posición de la aguja y el gusano. Todo el proceso lo ideal sería que en menos de 1-2 minutos. </li></ol></li><li> Quite la cubierta de vidrio desde el escenario y colóquelo en una microscopio de disección. Aplicar 1μl de buffer M9 (22 mm de KH 2 PO 4, 42 mm de Na 2 HPO 4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO 4) directamente sobre el gusano inyecta (esto podría implicar sumergir la punta de la pipeta por debajo de la superficie del aceite de halocarbonos). El tampón debe rehidratar el gusano, sino que se va a flotar fuera de la superficie de la placa de agarosa. La transferencia de la lombriz en un plato normal con un pico del gusano. La almohadilla de agarosa puede ser reutilizado varias veces más hasta que se ha convertido en demasiado saturado con tampón y los gusanos ya no se adhieren. </li></ol> Selección de transgénicos <ol><li> Gusanos se inyecta, la generación P 0, se transfieren a platos individuales fresco, sin semillas con bacterias (60 mm) y les permite reproducirse. Por lo general, los animales inyectados se incuban a 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen. </li><li> La F 1 se observa la evidencia del marcador de transgénicos (como la fluorescencia), utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Cada portador fluorescentes, F 1, los animales clonados por separado en un plato nuevo (ya que la descendencia de cada F 1 se considera una línea distinta). La F 1 hermafroditas se les permite reproducirse. De nuevo, esto se realiza normalmente en menos de 20 ° C durante 2-3 días hasta que las crías aparecen. </li><li> La generación F 2 se observa en los animales transgénicos así. F 2 animales que han heredado y expresan la variedad transgénica se consideran &quot;estable&quot; de línea. NOTA: En la F 1 deedad, puede haber muchos animales transgénicos, pero no son estables. La mayoría de los animales transgénicos F 1 no se propagarán en F 2 líneas estables. NOTA: Para el control de la variabilidad en el número de copias del gen, generar un mínimo de tres líneas independientes estables por la construcción de inyección. </li><li> Cada línea estable independiente debe mantenerse como una línea separada de los gusanos. Cada línea se puede propagar mediante la transferencia de varios animales transgénicos para una nueva placa en cada generación, lo que debe llevarse a cabo utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente si el marcador de selección es fluorescente. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar lo siguiente: - Inyectar directamente en el centro de la gónada - No inyectar demasiado líquido - Trabajar con rapidez para evitar la desecación. Si llegas a tener problemas con la aguja, como se rompe demasiado grande, lo mejor es rehacer una aguja nueva, en lugar de tratar de inyectar con una aguja de menos de ideal. La generación de gusanos transgénicos tiene muchas aplicaciones, tales como: - La identificación de genes mutantes, en el método llamado de rescate de transformación - Asignación de dominios de la proteína a través de la expresión de proteínas truncadas - Caracterización de la función de un gen en los procesos celulares y de enfermedades.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

Transgénicos Caenorhabditis elegans pueden ser fácilmente creados a través de la microinyección de una solución de ADN plásmido en la gónada 1. El ADN del plásmido se reorganiza para formar concatamers extracromosómico que son heredados de forma estable, aunque no con la misma eficacia que los cromosomas actual 2. Un gen de interés es co-inyectados con un marcador fenotípico obvias, tales como rol-6 o las buenas prácticas agrarias, para permitir la selección de animales transgénicos con un microscopio de disección. El gen exógeno se puede expresar a partir de su promotor nativo para los estudios de localización celular. Por otra parte, el transgén puede ser impulsado por un promotor de diferentes tejidos específicos para evaluar la función del producto del gen en esa célula o tejido en particular. Esta técnica de manera eficiente las unidades de la expresión génica en todos los tejidos de C. elegans, excepto para el embrión o principios de la línea germinal 3. La creación de animales transgénicos es ampliamente utilizado para una variedad de paradigmas experimentales. Este video muestra el procedimiento de microinyección para generar gusanos transgénicos. Además, la selección y mantenimiento de líneas transgénicas estables C. elegans se describe.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection at JoVE.com

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Generación de transgénicos estable C. elegans con microinyección

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

52.8K vistas.  University of Alabama. Este video muestra la técnica de microinyección en la gónada de C. elegans para crear animales transgénicos.

Video: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Investigación

Biología

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Tinción de anticuerpos en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso de &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generación de transgénicos<em&gt; Hydra</em&gt; Por microinyección de embriones

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...