Los péptidos RAN son una característica de los trastornos neurodegenerativos de expansión repetida como la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia frontotemporal. Estos protocolos proporcionan un enfoque estandarizado importante para cuantificar la toxicidad del péptido RAN en el sistema modelo C.elegans. Las técnicas descritas son fáciles de aprender y económicas, se pueden realizar rápidamente y aprovechan las características reproducibles del sistema C.elegans, como el movimiento y la reproducción.
Al intentar este protocolo, el principal desafío es obtener toxicidad y expresión constantes de péptidos RAN. Los principales factores a controlar incluyen la temperatura de las drogas, el momento de los cambios de temperatura y la preparación de las placas de ensayo. Es importante que los experimentadores clasiquen constantemente los fenotipos de los animales en este ensayo de proceso dependiente de la edad.
La demostración visual de esta técnica muestra sus criterios de clasificación. Comience por verter el medio de crecimiento de nematodos estándar con un IPTG milimotor y 25 microgramos por mililitro de carbenicillina en placas de 24 pozos. Estratete los clones de alimentación de ARNi en bacterias HT115 en el agar lb carbenicillina y creció a 37 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, escoge una sola colonia en un mililitro de medios líquidos de carbenicillina LB y haz crecer las bacterias durante 18 horas a 37 grados centígrados mientras tiemblas a 250 rpm. Detecte cuatro pozos individuales de la placa NGM RNAi de 24 pozos con 20 microlitros de cultivos bacterianos durante la noche como se describe en el manuscrito de texto y permita que las bacterias RNAi induzcan la producción de ARN de doble cadena durante la noche. Utilice el método estándar de hipoclorito para aislar los óvulos del primer día C.elegans adultos que expresan el transgén péptido RAN integrado.
Luego sembra unos 30 huevos en cada pozo de la placa de 24 pozos e incubar el plato a 20 grados Celsius durante siete días. Para realizar análisis de velocidad de vídeo, adquiera dos vídeos de dos pozos separados para cada condición de ARNi utilizando un microscopio de disección estéreo equipado con una cámara monocroma. Asegúrese de utilizar la configuración de adquisición coherente entre pozos.
Para cada vídeo, establezca la duración de 10 segundos y el intervalo de tiempo en 76 milisegundos. Establezca el tiempo de exposición de la imagen en cuatro milisegundos y utilice el ajuste de zoom 1.49. A continuación, seleccione dos por dos binning.
Compruebe que la resolución es de 800 por 600 píxeles e inicie la grabación. Después de la adquisición, etiqueta cada video inmediatamente con la cepa, la condición de ARNi y el número de pozo. A continuación, medir la distancia recorrida y la longitud de cada animal para 20 animales diferentes por vídeo, examinando un total de unos 40 gusanos para cada condición de ARNi.
En el software, seleccione el botón de herramientas de anotación. A continuación, la herramienta de dibujo de texto. Haga clic en un punto en el centro del gusano que se mide en el primer fotograma del vídeo y márquelo con un número.
Avance el vídeo hasta el final mientras rastrea visualmente el gusano. A continuación, haga clic en él y márquelo con el siguiente número correspondiente. Utilice la herramienta de barra de escala de dibujo para dibujar una línea desde el primer número hasta el segundo número y registrar la distancia recorrida en una hoja de cálculo.
Repita esta medición para otros 19 gusanos en el vídeo conservando cada medida individual en la ventana de análisis. Una vez completadas las mediciones, tome una instantánea del marco de vídeo final que ilustra todas las líneas de medición para que los datos puedan rastrearse hasta el animal del que se originaron. A continuación, analice los datos utilizando una hoja de cálculo de cuatro columnas donde la columna uno es el identificador de gusano y la columna dos es la velocidad.
La hora de cada vídeo se puede encontrar haciendo clic con el botón derecho en el vídeo bajo el experimento yendo a las propiedades. Para normalizar la medición de velocidad, encuentre la longitud de cada animal. Utilice la herramienta de polilínea de dibujo para trazar libremente los C.elegans desde la punta de la cabeza hasta la punta de la cola.
A continuación, tome una instantánea del fotograma de vídeo final que ilustra todas las polilíneas. La longitud de las líneas se registrará en las estadísticas. Agregue dos columnas a la hoja de cálculo, una para la longitud del animal y otra para la velocidad normalizada.
Por último, analice los datos de velocidad normalizados utilizando un ANOVA unidireccional con pruebas post-hoc frente a RNI vectoriales vacíos. Coloque de cuatro a seis L4 C.elegans transgénicos que expresen la GFP de péptido RAN en una placa GFP RNAi de seis centímetros y los escríen a 20 grados centígrados. Si el experimento utiliza ARNi para detectar efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, mueva 10 adultos gravídicos transgénicos a cada uno de dos vectores vacíos RNAi RNAi o placas RNAi específicas del gen.
Si se utilizan mutantes para analizar los efectos genéticos sobre la toxicidad del péptido RAN, coloque 10 animales salvajes gravidos o animales mutantes que expresen el mismo transgén RAN en cada una de las dos placas vectoriales vacías RNAi o RNAi GFP. Cultivarlos a 20 grados centígrados durante 48 horas. Escoja 10 juegos de 10 L4 transgénicos de las placas RNAi y coloque cada juego en una placa de ARNi de tres centímetros.
Asegúrese de que todos los gusanos seleccionados para el ensayo tengan motilidad superficialmente normal. Coloque las placas en una bolsa de plástico para retener la humedad e incubarlas a 25 grados centígrados. Después de 24 horas, analice los animales para la movilidad tocando las placas en el microscopio de disección y comprobando si hay movimiento.
Si un gusano se mueve más de una longitud corporal, cuéntalo como móvil y transfiéralo a una nueva placa RNAi de tres centímetros. Utilice una selección de platino para tocar los gusanos restantes en la cabeza y la cola. Si el animal se mueve más de una longitud corporal, cuente el animal como móvil y transfiéralo a una nueva placa de ARNi de tres centímetros.
Si no se observa una parálisis significativa en el control vectorial vacío para el día dos, termine el ensayo y comience de nuevo. Agrupe todos los gusanos no de movimiento para que el movimiento de más de una longitud corporal pueda detectarse fácilmente. Cuente todos los gusanos paralizantes, embolsados o muertos y deseche la placa.
Continúe anotando a los animales para la parálisis todos los días durante cinco a siete días. El ensayo de crecimiento se utilizó para medir el efecto de las inhibiciones genéticas en la toxicidad de los dipéptidos RAN que se encuentran en pacientes con ELA con una expansión de repetición de G4C2. La expresión de PR50 GFP por sí sola resultó en un arresto de crecimiento completo, pero la eliminación de varios genes suprimió la toxicidad del desarrollo.
El efecto de los derribos genéticos específicos en la motilidad del desarrollo de los animales que expresan PR50 se midió utilizando el método de análisis de la velocidad del vídeo. Como era de esperar, la inhibición de la expresión de PR50 GFP dio lugar a un gran aumento de la motilidad en comparación con el vector vacío RNAi. Además, el ARNi contra la subunidad proteasoma RPN7 dio lugar al aumento significativo de la motilidad PR50.
Cuando se analizaron los fenotipos adultos con el ensayo de parálisis dependiente de la edad, pr50 GFP exhibió hasta un 80% de parálisis a los cinco días de edad. Sin embargo, el ARNi se dirigió al gen cul-6 de la parálisis significativamente retrasada, lo que sugiere que se requiere cul-6 para la toxicidad de la PFN PR50. Para determinar si las proteínas RAN causan neuropatología cuando se expresan en las neuronas C.elegans, se examinó la toxicidad específica de la neurona utilizando el ensayo de commissure.
En el día dos adultos, PR50 GFP expresión en las neuronas motoras condujo a un aumento significativo en el sangrado de la neurona motora. Esta neuropatología fue suprimida significativamente por una mutación en el gen receptor de insulina IGF homólogo DAF-2 que retrasa las propiedades tóxicas de varias proteínas neurodegenerativas. Para el ensayo conductual, es importante que los péptidos RAN produzcan un fenotipo altamente penetrante.
Estos genes o fármacos podrían proporcionar nuevos biomarcadores u opciones terapéuticas para las enfermedades de los péptidos RAN. Utilizando estos ensayos, hemos realizado una pantalla de ARNI en todo el genoma para los supresores del péptido RAN asociado C9ORF72 prolina-arginina. Los genes identificados en esta pantalla incluyen muchos genes nuevos y conservados que serán objeto de futuros estudios mecánicos.
