מימון ניתן על ידי NSF CCLI # 0633618 ואוניברסיטת אוהיו. כמה זנים סופקו על ידי המרכז לגנטיקת Caenorhabditis. סטודנט לתואר שני Reetobrata Basu מופיע בסרטון.

<ol>
	<li>Harlow, E., Lane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Transformation.">DNA Transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene+fusions.">Reporter gene fusions.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry.">Immunohistochemistry.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Finney, M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unc-86+gene+product+couples+cell+lineage+and+cell+identity+in+C.+elegans.">The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans.</a> Cell. 63, 895-905 (1990).</li><li>Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+control+the+direction+of+outgrowth,+branching+and+fasciculation+of+the+HSN+axons+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans.</a> Development. 117, 1071-1087 (1993).</li><li>Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+microscopy.">Immunofluorescence microscopy.</a> Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).</li><li>Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLP-1+is+localized+to+the+mitotic+region+of+the+C.+elegans+germ+line.">GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line.</a> Development. 120, 2901-2911 (1994).</li><li>Strome, S., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+visualization+of+germ-line-specific+cytoplasmic+granules+in+embryos,+larvae,+and+adults+of+Caenorhabditis+elegans.">Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).</li><li>Albertson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+first+cleavage+spindle+in+nematode+embryos.">Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos.</a> Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).</li><li>Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).</li><li>Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+Genetics.">Reverse Genetics.</a> WormBook. , (2006).</li></ol>

המחבר מצהיר שאין לה אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול פיצוח ההקפאה הוא אחת מכמה שיטות למכתים נוגדן בג elegans. הוא מספק דרך פשוטה יחסית להכתים תולעים, אבל דורש חומרים כימיים מסוימים ולתרגל לתוצאות מיטביות. שלבים קריטיים (שמתוארים באיור 1) כוללים: 1) הכנת שקופיות (ראה שלבים 1 ו 2) דחיסה ידנית של נמטודות (ראה שלבים 2 ו -3) קיבעון מהיר (ראה שלב 3). ראשית, על מנת למקסם את ההידבקות של נמטודות לשקופיות, עדיף להכין שקופיות עם משקל מולקולרי גבוה (פולימר ארוך) polylysine, במקום להסתמך על שקופיות מוכנות מסחרי. שקופיות מסחריות מצופות בpolylysine כדי לאפשר לתאים לדבוק, בעוד שקופיות פיצוח הקפאה נועדו להיצמד לציפורן של כל נמטודות. שנית, את ההליך לדחיסה הנכונה של התולעים בין השקופיות לפני ההקפאה הוא קריטי. זה דורש ידיים ותרגול יציבים ללחוץ שקופיות יחד באמצעות הסכום הנכון שללחץ, כך שתולעים בודדים לפנות שני השקופיות מבלי להרוס המורפולוגיה שלהם. או יותר מדי או מעט מדי דחיסה מובילה לאובדן מוגבר של תולעים בקיבעון. יש צורך בטיפול נוסף כדי להעביר שקופיות על גבי המשטח המקורר בקרח היבש להקפאה מבלי להזיז את השקופיות יחסי אחד לשני. כל תנועה כזאת תגרום לתולעים לדמעה או לעוות. שלישית, כמו בכל טכניקת קיבעון, יש להציב את התולעים הקפואים ישירות לתוך מקבע לפני ההפשרה. אחרת, עלול לנטרל אנטיגן, מתן מידע מטעה על לוקליזציה subcellular. אם צעדים אלה קריטיים כולם נעשו כראוי, לקבלת התוצאות הטובות ביותר הוא עדיין נחוץ כדי לסרוק כמה שקופיות צבעוניות למצוא תולעים עם המורפולוגיה הטובה ביותר. היבט בלתי נמנע אחד של טכניקה זו הוא שהתולעים יהיו דחוסים בממד אחד. הדחיסה היא בולטת ביותר במבוגרים, שבו לכאורה בקוטר של הגוף העגול בZ-הציר עשוי להיות 1-4 בלבדה שראה בx ו-y הצירים. דחיסה זו נוטה להפחית בזחלים קטנים יותר, והוא יכול להיות זניח בעוברים. בשל אופן שבי נמטודות החיים לעבור במהלך הכנת שקופיות, התולעים המוכתמים הם לעתים קרובות על צדם. זה מחקה את הכיוון של תולעים על צלחות אגר, עם קו האמצע לרוחב שוכב הארכה למטה באמצע של התולעת המוכתמת (ראה איורים 2-4). לפיכך, הדחיסה היא בדרך כלל בממד הרוחב. אמנם זה בעצם עושה מיקרוסקופ פלואורסצנטי הסטנדרטי קל יותר (יותר של הדגימה יהיה בפוקוס בו זמנית), זה אומר ששחזורי 3-D לא יהיו מדויקים. כמו בכל מכתים נוגדן, חשוב לבדוק הספציפיות של כריכה. ברוב המינים, זה נעשה על ידי פקדים כגון זיקה מדלדלת הנוגדנים שלך או אי שימוש ראשוני. בג elegans, אמצעים ספציפיים יותר של בדיקה ספציפיות הם לעתים קרובות זמינים. מוטציות Null לגן והחלבון של עניין לספקשליטה מצוינת עבור סגוליות מכתים. שני הזנים צריכים להיות קבועים בתנאים זהים לפני ההשוואה, שכן צביעה היא בדרך כלל קיבוע תלויה. אם לא מוטציה null זמינה, אז זה קל יחסית בג elegans לירידה ברמות חלבון עם RNAi (RNA עיכוב 12) ולחפש כתמים ירדו בתולעים שטופלו RNAi. נוגדני polyclonal לעתים קרובות להראות מכתים שאינו ספציפי, גם אם מטוהר זיקה לאנטיגן. לעתים קרובות, קיבעון אור באמצעות מתנול ואצטון (אשר לתקן את החלבונים על ידי מזרזם ולא crosslinking) נותן צביעה שאינה ספציפית נמוכה יותר מאשר פורמלדהיד או glutaraldehyde (אשר יוצרים יותר אפיטופים גרסה בשל cross-linking המגוון) 1,11. עם זאת, בג הצביעה שאינה ספציפית elegans היא נפוצה מאוד בשום תנאי קיבוע, בעיקר במעיים. אם אנטיגן שלך בא לידי ביטוי בבטן, ולאחר מכן צביעה שאינה ספציפית זה עשויה להסוות staini הספציפי שלךng. אם מוטציות null זמינות לחלבון שלך, אז תולעים קבועים בשיטה זו ניתן להשתמש בזיקה לרוקן בסרום שלך. מאז antigenicity תלוי תנאי קיבעון, התולעים המשמשים לרוקן הנוגדנים שלך צריכים להיות מוכנים באותה הצורה כמו wild-type תולעים אתה מכתים. אחרי סיבוב של דלדול של מכתים שאינו ספציפי, מוטציה ותולעים פראי מסוג אחד יכול להיות מוכתם במקביל עם הסרום המדולדל לשליטה מצוינת. סיבוב של דלדול עם מוטנטים נוספים יכול להיעשות בהתאם לצורך. טכניקה זו שימושית מאוד לבדיקת נוגדנים חדשים עבור מכתים ספציפי תחת מגוון רחב של תנאים. אלה עשויים להיות נוגדנים שנוצרו נגד ג elegans חלבונים או נוגדנים שנוצרו נגד חלבונים נשמרים ממינים אחרים. בעוד ששיטה זו נותנת את המורפולוגיה הטובה ביותר עם נמטודות קבועה באורח קל, זה פשוט יחסית כדי לנסות מגוון של fixatives כדי לקבוע אילו תנאים, אם בכלל, נותן תוצאה מסוימתs. בניגוד לשיטות אחרות לקיבוע קשיח באמצעות פורמלדהיד או glutaraldehyde, אנזימטי או צמצום טיפולים לא נחוצים להכנת מדגם. מאז טיפולים אלה עלולים להפחית antigenicity, זה מגדיל את היכולת לזהות נוגדנים ספציפיים ותנאי הקיבוע האופטימליים שלהם. אם תנאי קיבעון קשים עבודה הטובה ביותר, הנסיין אז יכול לפנות לשיטות מבוצעות על תולעים בשלמותה כדי להשיג מורפולוגיה טובה יותר (סיכמה בעבודה הקודמת שלנו 4). אם קיבוע אור משמר antigenicity, אז טכניקה זו עשויה לשמש לכל מכתים נוסף למיקרוסקופ אור.

כדי לקבוע את הלוקליזציה הסלולר וsubcellular של חלבונים, מדענים שכותרתו מסורתי רקמות עם נוגדנים שנבחרו להכיר באופן ספציפי חלבונים מסוימים 1. בחלק מאורגניזמים מודל כגון ג elegans, מכתים נוגדן הוחלף לעתים קרובות על ידי טכניקות גנטיות מולקולריות, אשר יניבו תוצאות במהירות רבות יותר. אלה כוללים אורגניזמים הפיכה עם מבנים בהיקף של התכה גנים בין האמרגן ואזורי קידוד של הגן של עניין וחלבון פלואורסצנטי ירוק. עם זאת, טכניקות מולקולריות כפופות למספר החפצים, ובם בעיות עם ידיעת האמרגן ושינויים בביטוי של מבנים במספר גבוה עותק (טכניקות הרגילות ב C. elegans) 2,3 האמיתיים. לכן, צביעה עם נוגדנים נשארת מטרה של מדענים רבים בחקר תפקוד חלבון in vivo. מכתים את הרקמות עם נוגדנים יכולים להיות קשה, שכןtibodies רק יכול לזהות אנטיגן בקונפורמציה מסוימת 1. לדוגמא, נוגדנים יכולים לזהות רק אנטיגן מפוגל או בשלמותה הקבוע בדרך מסוימת ואולי לא מזהים את האנטיגן באתרם. הבעיה של מכתים נוגדן בנמטודות מחריפה בשל העובדה שהציפורן של נמטודות יוצרת מחסום בלתי חדיר יחסית, החוסם את הגישה של נוגדנים לרקמות. ישנן מספר שיטות שונות המשמשות למכתים נוגדן בג elegans (שנסקר בעבודה הקודמת שלנו 4). כדי להכתים שלמים &#39;תולעים&#39;, שיטות פותחו כדי להקפיא ולהפשיר במקבע קשה יחסית (פורמלדהיד או glutaraldehyde); להקפיא להפשיר מחזורים לעזור לפצח את הציפורן כדי לאפשר חדירה מהירה של המקבע 5. לאחר קיבוע, הציפורן הייתה permeabilized כדי לאפשר חדירה של הנוגדן; שיטות כללו טיפול עם צמצום סוכנים, collagenase, או שניהם 5-7. לא אלהreatments השתמר מורפולוגיה, אך לעתים קרובות מופחת או נהרס הכרת נוגדן. שיטות אלטרנטיביים כוללות לנתיחה 8 כדי לאפשר חדירת נוגדן. &quot;להקפיא-פיצוח&quot; הוא אחת דרכים כדי לקבל גישה לחלק הפנימי של התולעת חצי השלמה כדי לאפשר נוגדן מכתים 9-10. הקפאת פיצוח יכול להתבצע עם מגוון רחב של תנאי קיבעון תוך הימנעות טיפולי collagenase וצמצום. נמטודות ממוקמות בין שתי שקופיות דבקים, קפואות, ולאחר מכן השקופיות מופרדות, ומשאירות את רוב נמטודות בשקופית התחתונה וחלק גדול מציפורן בשקופית העליונה. השקופית התחתונה יכולה להיות ממוקמת במקבעת וכל השקופית עם נמטודות דבקה מועברת בהליך מכתים נוגדן. השיטה עושה שני קשיים עיקריים כיום. ראשית, קשה להחיל את הסכום הנכון של לחץ דרוש כדי לפצל את נמטודות בלי לעוות אותם ברצינות. שנית, רבים של התולעים לא יהיה שלסמן לאו שקופיות, ויאבד במקבע או שטיפות. עם זאת, עם השקופיות ותרגול הנכונים, השיטה תהיה במהירות להניב נמטודות עם מורפולוגיה סבירה שבו ניתן להשתמש במגוון רחב של fixatives ונוגדנים. השיטה עשויה להיות מגוונת במקצת, בהתאם למטרה של הנסיין. אם הכתמה של נמטודות אחת היא רצויה (למשל כדי לקבוע אם transformant אחת שינה מכתים נוגדן), ואז מחליק עם הידבקות מקסימלי (אבל מכתים רקע גבוה יותר) יכול לשמש, כמו שקופיות שהוכנה במעבדה עם polylysine נוסף (ראה בהמשך). לפורמלדהיד או קיבעון glutaraldehyde, יש להשתמש בשקופיות הידבקות גבוהות יותר (שקופיות polylysine הכנה מעבדה), שכן נמטודות לדבוק יותר גרועה לpolylysine לאחר הקיבעונות האלה. אם נמטודות פראית מהסוג שמתבצעת קבועה עם מתנול ו / או אצטון, ולאחר מכן שקופיות עם הידבקות נמוכה יותר ויש להשתמש בי מכתים רקע נמוך יותר (מסחרי או laboratory הכנה שקופיות). אם מגוון רחב של נוגדנים וfixatives נמצאים בשימוש במעבדה, מבחר השקופיות עשוי להיות מוכן מבעוד מועד ומאוחסן עד צורך. לאחר הגישה לרקמות נמטודות כבר צברה, נהלי מכתים הנוגדן פעלו בשיטות סטנדרטיות (עם incubations יותר אופייני לרקמות ולא תאים 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

כדי להכתים ג elegans עם נוגדנים, הציפורן יחסית בלתי חדירה חייבת לעקוף בשיטות כימיות או מכאניות. &quot;להקפיא-פיצוח&quot; הוא אחת שיטות המשמשות למשוך פיזי לציפורן מנמטודות ידי דחיסת נמטודות בין שתי שקופיות חסיד, להקפיא אותם, ומושך את השקופיות לגזרים. הקפאת פיצוח מספק דרך פשוטה ומהירה כדי לקבל גישה לרקמות ללא טיפול כימי והוא יכול לשמש במגוון רחב של fixatives. עם זאת, זה מוביל לאובדן רבים של הדגימות והדחיסה הנדרשות מכאנית מעוות את המדגם. בפועל נדרש על מנת למקסם את ההתאוששות של דגימות עם מורפולוגיה טובה. הקפאת פיצוח יכול להיות מותאם לתנאים ספציפיים קיבוע, התאוששות של דגימות, או כתמים שאינם ספציפיים נמוכים, אך לא לכל הפרמטרים ובעונה אחת. לנוגדנים שדורשים תנאי קיבעון קשים מאוד ולסבול את הטיפולים הכימיים הדרושים כדי permeabilize הציפורן כימי, treatment של נמטודות השלמה בפתרון עשוי להיות מועדף. אם הנוגדן דורש תיקון קל או אם תנאי הקיבעון האופטימליים אינם ידועים, בהקפאה פיצוח מספק דרך שימושית מאוד לassay במהירות נוגדנים ויכול להניב מידע לוקליזציה subcellular והסלולרי ספציפי לאנטיגן של עניין.

כאשר תולעים הם דחוסים כמו שצריך, סדוקים, וקלילות קבועה, כמעט את כל התולעת יכולה להיות נגישה למכתים נוגדן (ראה איור 2). המיקום של הגרעינים כפי שצוין על ידי מכתים DAPI מציין איזה חלקים של התולעת הם שלמים כאשר התולעים חשופים למקבעים קשה יותר, כגון פורמלדהיד, המורפולוגיה של התולעת עלולה להיות מעוותת (כפי שניתן לראות על ידי הופעתו בצורה לא טבעית הגלי של שרירים באיורים 3A-D). בעיה נוספת נפוצה היא קיבעון או חדירה של רקמות מסוימות לא אחידים. דוגמא לכך היא מוצגת איורים 3E-H, שבו השריר מוכתם רק בחלק של התולעת, למרות שנוכחותם של כתמים אחרים, כוללים צביעת ה-DNA, עולה כי לפחות חלק מהגוף היה נוכח ( כלומר, לא יוסר במהלך הקפאת פיצוח). הדפוס של מכתים חלקי וכתוצאה מכך יכול להיות מזוהה בקלות עם תרגול, כך שכל חלוקהעל של מכתים ניתן לקבוע גם אם כל תולעת אחת תערוכות מכתים לא אחיד. בעיות נפוצות נתקלו בשימוש בכל מצב קיבעון פיצוח ההקפאה באות לידי ביטוי בדמות הסופית (איור 4). הבעיה הנפוצה ביותר היא מתפתלת מהמדגם בשל תנועה היחסית של שתי השקופיות במהלך דחיסה. העובדה שהגוף של התולעת הוא מעוות רק אחורי של הלוע ניתן לראות על ידי המורפולוגיה של הרקמות המוכתמות. תמונה זו מראה גם את הבעיה עם מכתים רקע, בשל נוגדני דבק poly-ליזין ציפוי השקופיות. שים לב, עם זאת, שכל התמונות הללו נאספו באמצעות שקופיות שנעשו במהלך ניסיונות מכתים הנוגדן הראשונים של סטודנטים לתואר ראשון בקורס מעבדה בביולוגיה של תא. אפילו עם בפועל, רבים תולעים בודדים יציגו את הבעיות לראות באיור 4. עם זאת, על כל שקופית אחת, תולעים כמו אלה שראו באיורים 2 ו -3 יכולים להיות founד ונבדק. <img alt="איור 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig1.jpg" /> איור 1. קווי המתאר של נהלים. תרשים זרימה המצביע על צעדים כדי לבצע את הליך פיצוח הקפאה המוחלט. חלופות לתנאי קיבעון מגוונים ומספרים של תולעים מצוינות. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig2.jpg" /> איור 2. תולעים קבועים באורח קל, צבעוניים גם ראשי שני הרמפרודיטים מבוגר קבועים עם מתנול אצטון ומסומן עם נוגדנים מרובים וצבעים:.) נוגדן ראשוני לשוחח (acetyltransferase כולין) ונוגדנים משני Cy3 מצומדות, לינה) DAPI (DNA הכחול) , C) בצרגון 488-אנטי-GFP גרין (חלבון פלואורסצנטי ירוק), ד &#39;) מראה את הכיסוי (עם שני סמנים הכולינרגית, Cy3-אנטי צ&#39;אט וCy5-אנטי VAChT (טרנספורטר ועי אצטילכולין) כפי שמוצג אדום). זן זה מהונדס (PS4657) מבטא שילוב תרגום בין ה-GFP וAJM-1, שנמצא בצמתים פסגת בלוע. התמונות הן תחזיות מקסימליים של סדרה של תמונות confocal; סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig3.jpg" /> איור 3. תמונות המבוגרים קבועים העיוותים הקשורים פורמלדהיד. פורמלדהיד המוכתם בCy3-phalloidin (נקשר אקטין פילמנטיות), DAPI (DNA הכחול), ואורגון גרין 488-אנטי-GFP. הספירה) רביעיות של הגוף רק אחוריות של הפות (שמאל קיצוני) באותו נמטודות, מראה מורפולוגיה לא טבעי גלית כתוצאה מעיוות באין לשכפל ידי קיבעון.) Red-phalloidin מציג מורפולוגיה שרירים מעט לא סדירה. ב &#39;) גרעינים (כחול) מפוזר באופן שווה לאורך כל התולעת. C) ירוק מציג את ההתפלגות של חלבון :: GFP היתוך CED-1 בקרום הפלזמה של תא נדן האשכים, מונע על ידי אמרגן Lim-7 (MD701 זן). ד &#39;) מציג את הכיסוי של שלושת הצבעים הללו תיוג. EH) יכול להשתנות עם צבעים שונים באותו נמטודות. E) Phalloidin (אדום) תוויות רק חלק השרירים בצד אחד של התולעת. F) הגרעינים (כחול) מצויים כעת בכל התולעת (למרות מוכתמים בעוצמה לא אחידה). G) OG488-אנטי-GFP תוויות קולגן-19 :: ה-GFP בציפורן בצד שני של התולעת שאין כתמים של רקמת השריר המרכזית יותר, המצביע על השריר שנמצאה אך לא מכתים על משטח אחד. H) מציג את הכיסוי של שלושה הצבעים. התמונות הן מקסימוםתחזיות imal של סדרה של תמונות confocal; ברים בקנה מידה הן 50 מיקרומטר. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig4.jpg" /> איור 4. זחל קבוע העיוותים הקשורים לדחיסה. פורמלדהיד מוכתם) Cy3-phalloidin (נקשר אקטין פילמנטיות) כיסוי, B) DAPI (DNA הכחול), C) אורגון ירוקה 488-אנטי-GFP, ד &#39;). טוויסט בגוף רק אחורי של הלוע הוא נראה לעין, כמו התא הירוק הפרשה וצלב חוט עצב הגחון על שאר הגוף. מכתים רקע גבוה באו לידי הביטוי גם בCy3-phallodin. מתח זה מבטא :: חלבון GFP היתוך VHA-8, הממוקם בעיקר בתא ההפרשה. התמונות הן תחזיות מקסימליים של סדרה של תמונות confocal שהשתרעו על פני השטח של השקופית (שמוביל למכתים רקע גבוה); סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking" at JoVE.com

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

&quot;פיצוח להקפיא&quot;, שיטה לחשיפת הרקמות הפנימיות של ג נמטודות elegans לנוגדנים ללוקליזציה חלבון, בא לידי ביטוי.

נוגדן מכתים ב<em&gt; ג Elegans</em&gt; שימוש &quot;Freeze-פיצוח&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

22.6K Views.  Ohio University.  "פיצוח להקפיא", שיטה לחשיפת הרקמות הפנימיות של ג נמטודות elegans לנוגדנים ללוקליזציה חלבון, בא לידי ביטוי. 

Video: Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

נוגדן מכתים ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ'יק

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

Assay Chemotaxis סי אלגנס

שיטה לCulturing עוברי

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב

שיטות לעור פציעה ומבחנים לתגובות פצע ב