Le financement a été fourni par la NSF CCLI # 0633618 et Université de l&#39;Ohio. Certaines souches ont été fournies par le Centre de Génétique Caenorhabditis. étudiants diplômés Reetobrata Basu apparaît dans la vidéo.

<ol>
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L&#39;auteur déclare qu&#39;elle n&#39;a pas d&#39;intérêts financiers concurrents.

Le protocole de congélation-craquage est l&#39;un de plusieurs procédés pour la coloration des anticorps pour C. elegans. C&#39;est un moyen relativement simple pour colorer les vers, mais ne nécessite réactifs spécifiques et pratique pour des résultats optimaux. Les étapes critiques (décrites dans la figure 1): 1) la préparation des lames (voir les étapes 1 et 2) la compression manuelle des nématodes (voir les étapes 2 et 3) la fixation rapide (voir l&#39;étape 3). Tout d&#39;abord, afin de maximiser l&#39;adhérence des nématodes sur les lames, il est préférable de préparer des diapositives avec un poids moléculaire élevé (long de polymère) de la polylysine, au lieu de s&#39;appuyer sur des lames préparés commercialement. Diapositives commerciales sont revêtues de polylysine pour permettre aux cellules d&#39;adhérer, tandis que les diapositives de gel-fissuration sont conçus pour coller à la cuticule des nématodes entiers. En second lieu, la procédure de compression correcte des vers de terre entre les lames avant la congélation est critique. Il nécessite des mains et de la pratique régulière d&#39;appuyer sur les lames ensemble en utilisant la bonne quantité depression de sorte que chaque ver contact avec les deux lames sans détruire leur morphologie. Trop ou trop peu de compression conduit à une perte accrue des vers lors de la fixation. D&#39;autres soins est nécessaire pour déplacer les diapositives sur la surface glacée de la glace sèche pour la congélation sans déplacer les diapositives rapport à l&#39;autre. Toute motion fera les vers de déchirer ou se tordent. Troisièmement, comme avec n&#39;importe quelle technique de fixation, les vers congelés doivent être placés directement dans le fixateur avant la décongélation. Sinon, l&#39;antigène peut diffuser, fournissant des informations trompeuses sur la localisation subcellulaire. Si ces étapes critiques sont tout fait correctement, pour obtenir les meilleurs résultats, il est toujours nécessaire de numériser plusieurs lames colorées pour trouver des vers avec la meilleure morphologie. Un aspect inévitable de cette technique est que les vers sont compressés dans une dimension. La compression est plus visible chez les adultes, où le diamètre apparent de la ronde du corps dans l&#39;axe z peut être seulement une à quatree que vu dans les x et y axes. Cette compression a tendance à diminuer dans les larves plus petites, et peut être négligeable dans les embryons. En raison de la façon dont les nématodes vivants se déplacent pendant la préparation des lames, les vers sont souvent colorées sur les côtés. Cela imite l&#39;orientation des vers plats sur gélose, avec la ligne médiane latérale allongée s&#39;étendant vers le bas au milieu de la vis sans fin souillé (voir les figures 2-4). Ainsi, la compression est en général dans la dimension latérale. Même si cela rend effectivement la microscopie à fluorescence norme plus facile (plus de l&#39;échantillon seront simultanément mis au point), cela signifie que les reconstructions 3-D ne seront pas précis. Comme avec n&#39;importe quelle coloration d&#39;anticorps, il est important de vérifier la spécificité de la liaison. Dans la plupart des espèces, ceci est réalisé par des commandes telles que l&#39;affinité appauvrissant votre anticorps ou n&#39;utilisant pas de primaire. Dans C. elegans, un moyen plus précis de la vérification de la spécificité sont souvent disponibles. Mutants nuls pour le gène et la protéine d&#39;intérêt fournissentun excellent contrôle de la spécificité de la coloration. Les deux souches doivent être fixés dans des conditions identiques avant la comparaison, car la coloration est généralement fixation dépend. Si aucun mutant nul n&#39;est disponible, il est relativement facile de C. elegans de diminuer les niveaux de protéines avec l&#39;ARNi (ARN de l&#39;inhibition de la 12) et rechercher diminué coloration dans ARNi vers traités. Des anticorps polyclonaux présentent souvent une coloration non-spécifique, même si l&#39;affinité avec l&#39;antigène purifié. Souvent, la fixation de lumière en utilisant du methanol et de l&#39;acétone (qui fixent les protéines en les précipitant au lieu de les réticuler) donne une coloration non spécifique plus faible que le formaldehyde ou le glutaraldéhyde (qui génèrent plusieurs variantes dues à divers épitopes de reticulation) 1,11. Cependant, dans C. elegans coloration non-spécifique est très commun dans toutes les conditions de fixation, en particulier dans l&#39;intestin. Si votre antigène est exprimé dans l&#39;intestin, cette coloration non spécifique peut masquer votre staini spécifiqueng. Si mutants nuls sont disponibles pour votre protéine, puis vers fixes avec cette méthode peuvent être utilisés pour affinité épuiser votre sérum. Depuis antigénicité dépend des conditions de fixation, les vers que vous utilisez pour épuiser votre anticorps doivent être préparés de la même manière que les vers de type sauvage vous coloration. Après un tour de l&#39;épuisement de la coloration non-spécifique, et les vers mutant de type sauvage peut être teinté en parallèle avec le sérum appauvri pour un bon contrôle. Série supplémentaire de l&#39;épuisement avec des mutants peut être fait tant que de besoin. Cette technique est très utile pour tester de nouveaux anticorps pour la coloration spécifique et sous une variété de conditions. Ceux-ci peuvent être des anticorps générés contre C. elegans des protéines ou des anticorps générés contre les protéines conservées provenant d&#39;autres espèces. Bien que cette méthode donne la meilleure morphologie des nématodes légèrement fixes, il est relativement simple d&#39;essayer une gamme de fixateurs pour déterminer quelles conditions, le cas échéant, donner des résultats spécifiquess. Contrairement à d&#39;autres méthodes de fixation disque utilisant le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde, enzymatique ou réduire les traitements ne sont pas nécessaires pour la préparation des échantillons. Étant donné que ces traitements peuvent diminuer l&#39;antigénicité, ce qui augmente la capacité d&#39;identifier des anticorps spécifiques et de leurs conditions de fixation optimums. Si les conditions de fixation des disques qui fonctionnent le mieux, l&#39;expérimentateur peut alors se tourner vers des méthodes effectuées sur des vers intacts pour obtenir une meilleure morphologie (résumées dans nos travaux précédents 4). Si la fixation lumière préserve l &#39;antigénicité, cette technique peut être utilisée pour tous renseignements coloration pour la microscopie optique.

Pour déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire des protéines, les scientifiques ont toujours marqué les tissus avec des anticorps sélectionnés de reconnaître spécifiquement des protéines particulières 1. Dans certains organismes modèles tels que C. elegans, la coloration des anticorps a souvent été remplacé par des techniques génétiques moléculaires, qui donnent des résultats plus rapidement. Ceux-ci comprennent les organismes transformants avec des constructions, comprenant des fusions de gène entre le promoteur et les régions codantes du gène d&#39;intérêt et la protéine fluorescente verte. Cependant, les techniques moléculaires sont soumis à un certain nombre d&#39;objets, y compris les problèmes de connaître le véritable promoteur et changements dans l&#39;expression des constructions à grand nombre de copies (les techniques habituelles chez C. elegans) 2,3. Par conséquent, la coloration avec des anticorps demeure un objectif pour de nombreux scientifiques étudient la fonction des protéines in vivo. La coloration des tissus avec des anticorps peut être difficile, car untibodies ne peuvent reconnaître leur antigène dans une conformation particulière 1. Par exemple, les anticorps peuvent reconnaître que l&#39;antigène dénaturé ou intact fixe d&#39;une manière particulière et peuvent ne pas reconnaître l&#39;antigène in situ. Le problème de la coloration des anticorps chez les nématodes est exacerbé par le fait que la cuticule du nématode forme une barrière relativement imperméable, le blocage de l&#39;accès des anticorps aux tissus. Il existe plusieurs méthodes différentes utilisées pour la coloration des anticorps à C. elegans (revue dans nos travaux précédents 4). Pour colorer intactes »vers,« méthodes ont été développées pour geler et dégeler dans un fixateur relativement dur (formaldéhyde ou glutaraldéhyde), les cycles de gel-dégel contribuent à fissurer la cuticule pour permettre la pénétration rapide du fixateur 5. Après fixation, la cuticule a été perméabilisées pour permettre la pénétration de l&#39;anticorps; méthodes comprenaient le traitement avec des agents, la collagénase, ou les deux 5-7 réduire. Ces Treatments conservés morphologie, mais souvent réduites ou détruites reconnaissance d&#39;anticorps. Méthodes alternatives incluent dissection 8 pour permettre la pénétration d&#39;anticorps. &quot;Freeze-craquage&quot; est un moyen d&#39;accéder à l&#39;intérieur de la semi-ver intact pour permettre anticorps coloration 9-10. Cryo-craquage peut être effectuée avec une variété de conditions de fixation, tout en évitant des traitements de la collagénase et de réduction. Les nématodes sont placés entre deux lames d&#39;adhésifs, congelés, puis les lames sont séparées, laissant la plupart des nématodes sur la lame de fond et beaucoup de la cuticule sur la lame supérieure. La glissière inférieure peut être placée dans un fixateur et le coulisseau avec l&#39;ensemble de nématodes adhéré est transférée à travers la procédure de coloration à l&#39;anticorps. La méthode ne présentent deux difficultés majeures. Premièrement, il est difficile d&#39;appliquer la bonne quantité de pression nécessaire pour séparer les nématodes sans les déformer sérieusement. Deuxièmement, bon nombre des vers ne sera pas scocher soit diapositive, et sera perdu dans le fixateur ou rinçages. Cependant, avec les diapositives et les pratiques appropriées, la méthode donnera rapidement nématodes morphologie raisonnable qui peut être utilisé avec une grande variété de fixateurs et des anticorps. Le procédé peut faire varier légèrement, en fonction de l&#39;objectif de l&#39;expérimentateur. Si la coloration des nématodes est désirée (par exemple, pour déterminer si un seul transformant a modifié la coloration des anticorps), puis glisse avec une adhérence maximale (mais supérieur coloration de fond) peut être utilisé, par exemple sous forme de diapositives préparés en laboratoire avec polylysine supplémentaire (voir ci-dessous). Pour le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde fixation, les lames d&#39;adhésion plus élevés (diapositives polylysine préparés en laboratoire) doivent être utilisés, car les nématodes adhèrent plus mal à la polylysine après ces fixations. Si les nématodes de type sauvage sont fixées avec du méthanol et / ou de l&#39;acétone, puis glisse avec une adhérence plus en plus bas bruit de fond doit être utilisé (commercial ou ldiapositives aboratory préparé). Si une variété d&#39;anticorps et fixateurs sont utilisés dans le laboratoire, une sélection de diapositives peut être préparé à l&#39;avance et stocké jusqu&#39;à son utilisation. Après avoir accès au tissu de nématodes a été gagné, les procédures de coloration anticorps suivent des méthodes standard (avec de plus longues incubations caractéristiques des tissus plutôt que des cellules 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Pour colorer C. elegans avec des anticorps, la cuticule relativement imperméable doivent être contournés par des méthodes chimiques ou mécaniques. &quot;Freeze-craquage&quot; est une méthode utilisée pour tirer physiquement la cuticule de nématodes en comprimant les nématodes entre deux lames adhérentes, les congeler, et en tirant les diapositives en dehors. Cryo-craquage fournit un moyen simple et rapide pour accéder à des tissus, sans traitement chimique et peut être utilisé avec une variété de fixateurs. Toutefois, elle conduit à la perte d&#39;un grand nombre de spécimens et la compression requise déforme mécaniquement l&#39;échantillon. La pratique est nécessaire pour maximiser la récupération d&#39;échantillons avec une bonne morphologie. Cryo-craquage peut être optimisée pour les conditions spécifiques de fixation, la récupération d&#39;échantillons, ou faible coloration non-spécifique, mais pas pour tous les paramètres à la fois. Pour les anticorps qui requièrent des conditions de fixation très durs et tolèrent les traitements chimiques nécessaires pour perméabiliser chimiquement la cuticule, traitement de nématodes intactes en solution peut être préférée. Si l&#39;anticorps nécessite une solution claire ou plus si les conditions optimales de fixation ne sont pas connus, de gel-craquage est un moyen très utile pour doser rapidement l&#39;anticorps et peuvent donner des informations spécifiques de localisation subcellulaire et cellulaire de l&#39;antigène d&#39;intérêt.

Lorsque les vers sont bien compressés, fissuré, et légèrement fixés, la quasi-totalité ver peut être accessible à la coloration des anticorps (voir la figure 2). La localisation des noyaux, comme indiqué par la coloration DAPI indique quelles parties de la vis sans fin sont intacts Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur, tel que le formaldehyde, la morphologie de la vis sans fin peut être déformée (comme montré par l&#39;apparition anormalement ondulé de l&#39; muscles dans les figures 3A-D). Un autre problème commun est inégale fixation ou la pénétration de tissus particuliers. Un exemple de ceci est illustré sur les figures 3E-H, lorsque le muscle est coloré seulement dans une partie de la vis sans fin, en dépit du fait que la présence d&#39;autres taches, y compris coloration de l&#39;ADN, indique qu&#39;au moins une partie du corps était présent ( c&#39;est à dire, pas éliminée lors de congélation-fissuration). Le motif résultant de la coloration partielle peut être aisément identifiée à la pratique, de sorte que l&#39;ensemble du DISTRIBUTIsur la coloration peut être déterminé même si un seul ver montre une coloration inégale. Problèmes fréquemment rencontrés avec le gel de craquage en utilisant n&#39;importe quel état ​​de fixation sont illustrés dans la figure finale (figure 4). Le problème le plus fréquent est la torsion de l&#39;échantillon en raison du mouvement relatif des deux lames lors de la compression. Le fait que le corps de la vis sans fin est tordu juste en arrière du pharynx peut être vu par la morphologie des tissus colorés. Cette image montre également le problème de coloration de fond, en raison de l&#39;anticorps coller à la poly-lysine revêtement de la diapositive. Notez, cependant, que toutes ces images ont été recueillies à l&#39;aide de diapositives réalisées au cours des premières tentatives anticorps de coloration de premier cycle dans un cours de laboratoire de biologie cellulaire. Même avec la pratique, beaucoup de vers individuels montrer les problèmes rencontrés dans la figure 4. Cependant, sur une diapositive, vers comme ceux vus sur les figures 2 et 3 peuvent être fond et examiné. <img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig1.jpg" /> Figure 1. Description des procédures. Diagramme indiquant les étapes à effectuer la procédure complète de gel-fissuration. Alternatives pour les conditions et les numéros de vers fixation variées sont indiqués. <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig2.jpg" /> Figure 2. Légèrement fixes, vers le bien-colorées chefs de deux hermaphrodites adultes fixes avec du méthanol et d&#39;acétone et étiquetés avec plusieurs anticorps et colorants:. A) anticorps primaire de Chat (choline acétyltransférase) et anticorps secondaire conjugué à Cy3, B) DAPI (ADN bleu) , C) Mineraigon Green 488 anti-GFP (protéine fluorescente verte), D) montre la superposition (avec deux marqueurs cholinergiques, Cy3 anti-Chat et Cy5-anti-VAChT (de transporteur vésiculaire de l&#39;acétylcholine) représenté en rouge). Cette souche transgénique (PS4657) exprime une fusion de traduction entre la GFP et AJM-1, qui se trouve au pharynx jonctions apicales. Les images sont des projections maximales de série d&#39;images confocale; barre d&#39;échelle est de 50 um. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50664/50664fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig3.jpg" /> Figure 3. images distorsions de formaldéhyde associée. formaldéhyde adultes fixes colorées avec Cy3 phalloidin (lie l&#39;actine filamenteuse), DAPI (ADN bleu), et de l&#39;Oregon Green 488 anti-GFP. J.-C.) Fours du corps juste en arrière de la vulve (à gauche) dans le même nématode, montrant une morphologie anormalement ondulé en raison de la distorsion dansproduit par fixation. A) Red-phalloidin montre légèrement irrégulière morphologie musculaire. B) Les noyaux (bleu) sont bien réparties sur le ver. C) vert montre la distribution d&#39;un DEC-1 protéine :: GFP de fusion dans la membrane plasmique de la cellule de gaine gonadique, entraîné par le lim-7 promoteur (souche MD701). D) Affiche la superposition de ces trois colorants. EH) étiquetage peut varier avec différents colorants sur le même nématode. E) phalloïdine (rouge) étiquettes seulement une partie de le muscle d&#39;un côté de la vis sans fin. F) des noyaux (bleu) sont présents tout au long de la vis sans fin (bien que teinté avec une intensité inégale). G) La OG488-anti-GFP étiquettes de collagène-19 :: GFP dans la cuticule d&#39;un côté de la vis sans fin qui manque de coloration du tissu musculaire plus central, indiquant que le muscle est présente, mais pas de coloration sur une surface. H) Cela montre la superposition des trois colorants. Les images sont maxprojections de iMAL de série d&#39;images confocale; barres d&#39;échelle sont de 50 um. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50664/50664fig4.jpg" /> Figure 4. larve distorsions de compression associée. formaldéhyde fixe colorées avec A) Cy3-phalloïdine (lie l&#39;actine filamenteuse), B) au DAPI (bleu de l&#39;ADN), C), Oregon-Green-488 anti-GFP, D) superposition. La torsion du corps juste en arrière du pharynx est évident, que la cellule d&#39;excrétion vert et chaîne nerveuse ventrale croix sur le reste du corps. Coloration de fond élevée est également apparente avec Cy3 phallodin. Cette souche exprime un VHA-8 :: protéine de fusion GFP, situés principalement dans la cellule excréteur. Les images sont des projections maximales de série d&#39;images confocale qui s&#39;étendait à la surface de la lame (conduisant à coloration de fond élevée); barre d&#39;échelle est de 50 um.

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Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

&quot;Freeze-fissuration,&quot; une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

antibody-staining-in-c-elegans-using-freeze-cracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

22.6K vues.  Ohio University.  "Freeze-fissuration," une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée. 

Vidéo: Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

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The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagerie C. elegans Les embryons en utilisant un microscope à épifluorescence et de logiciels Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Détermination des profils d&#39;expression génétique dans les C. elegans Utilisation microréseaux et PCR en temps réel

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un procédé de culture embryonnaire<em&gt; C. elegans</em&gt; Cellules

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modèle anoxie-faim pour ischémie / reperfusion dans<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Méthodes pour Blessant Peau et Essais pour les réponses de blessure dans<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...