Un procedimiento controlado por estimulación para la evaluación de las funciones diastólicas dependientes de la frecuencia cardíaca en modelos murinos de insuficiencia cardíaca

El presente protocolo describe la obtención de la relación presión-volumen a través de la estimulación transesofágica, que sirve como una herramienta valiosa en la evaluación de la función diastólica en modelos murinos de insuficiencia cardíaca.

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) es una afección caracterizada por disfunción diastólica e intolerancia al ejercicio. Si bien las pruebas hemodinámicas estresadas por el ejercicio o la resonancia magnética se pueden utilizar para detectar la disfunción diastólica y diagnosticar la ICFEP en humanos, estas modalidades son limitadas en la investigación básica que utiliza modelos de ratón. Una prueba de ejercicio en cinta rodante se usa comúnmente para este propósito en ratones, pero sus resultados pueden verse influenciados por el peso corporal, la fuerza del músculo esquelético y el estado mental. Aquí, describimos un protocolo de estimulación auricular para detectar cambios dependientes de la frecuencia cardíaca (FC) en el rendimiento diastólico y validar su utilidad en un modelo murino de ICFEP. El método consiste en anestesiar, intubar y realizar análisis de bucle presión-volumen (PV) concomitante con la estimulación auricular. En este trabajo, se insertó un catéter de conductancia a través de un abordaje apical del ventrículo izquierdo y se colocó un catéter de estimulación auricular en el esófago. Se recogieron los bucles de VP basales antes de ralentizar la FC con ivabradina. Los bucles de VP se recogieron y analizaron en incrementos de FC que oscilaron entre 400 lpm y 700 lpm a través de la estimulación auricular. Utilizando este protocolo, demostramos claramente la insuficiencia diastólica dependiente de la FC en un modelo de ICFEP inducida metabólicamente. Tanto la constante de tiempo de relajación (Tau) como la relación presión-volumen diastólico final (EDPVR) empeoraron a medida que aumentaba la FC en comparación con los ratones control. En conclusión, este protocolo controlado por estimulación auricular es útil para detectar disfunciones cardíacas dependientes de la FC. Proporciona una nueva forma de estudiar los mecanismos subyacentes de la disfunción diastólica en modelos de ratón con ICFEP y puede ayudar a desarrollar nuevos tratamientos para esta afección.

La insuficiencia cardíaca representa una de las principales causas de hospitalización y muerte en todo el mundo, y la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) representa alrededor del 50% de todos los diagnósticos de insuficiencia cardíaca. La ICFEP se caracteriza por disfunción diastólica y alteración de la tolerancia al ejercicio, y las anomalías hemodinámicas asociadas, como la disfunción diastólica, pueden detectarse claramente a través de pruebas hemodinámicas sometidas a estrés por ejercicio o resonancias magnéticas ^1,2.

En los modelos experimentales, sin embargo, las modalidades disponibles para evaluar las anomalías fisiológicas relacionadas con la ICFEP son limitadas ^3,4. La prueba de esfuerzo en cinta rodante (TMT) se utiliza para determinar el tiempo y la distancia de carrera, lo que podría reflejar la hemodinámica cardíaca de estrés por ejercicio; Sin embargo, este método es susceptible a la interferencia de variables extrañas como el peso corporal, la fuerza del músculo esquelético y el estado mental.

Para sortear estas limitaciones, hemos ideado un protocolo de estimulación auricular que detecta cambios sutiles pero cruciales en el rendimiento diastólico en función de la frecuencia cardíaca (FC) y hemos validado su utilidad en un modelo murino de ICFEP⁵. Varios factores fisiológicos contribuyen a la función cardíaca relacionada con el ejercicio, incluyendo el nervio simpático y la respuesta catecolamina, la vasodilatación periférica, la respuesta endotelial y la frecuencia cardíaca⁶. Entre estos, sin embargo, la relación FC-presión (también llamada efecto Bowditch) es conocida como un determinante crítico de las características fisiológicas cardíacas ^7,8,9.

El protocolo consiste en realizar un análisis convencional de presión-volumen al inicio del estudio para evaluar la función sistólica y diastólica, incluyendo parámetros como la tasa de desarrollo de la presión (dp/dt), la relación presión-volumen telesistólico (ESPVR) y la relación presión-volumen telediastólica (EDPVR). Sin embargo, hay que tener en cuenta que estos parámetros están influenciados por la FC, que puede variar entre animales debido a las diferencias en su frecuencia cardíaca intrínseca. Además, también se deben considerar los efectos de la anestesia en la FC. Para abordar esto, la FC se estandarizó mediante la administración de estimulación auricular concomitantemente con ivabradina, y se realizaron mediciones de parámetros cardíacos a frecuencias cardíacas incrementales. En particular, la respuesta cardíaca dependiente de la FC distinguió a los ratones con ICFEP de los ratones del grupo control, mientras que no se observaron diferencias significativas en las mediciones basales del bucle de VP (utilizando la frecuencia cardíaca intrínseca)⁵.

Si bien este protocolo de estimulación puede parecer relativamente complicado, su tasa de éxito supera el 90% cuando se comprende bien. Este protocolo proporcionaría una forma útil de estudiar los mecanismos subyacentes de la disfunción diastólica en modelos de ratón con ICFEP y ayudaría en el desarrollo de nuevos tratamientos para esta afección.

Este protocolo con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y siguió las regulaciones para experimentos con animales y actividades relacionadas en la Universidad de Tokio. Para el presente estudio, se utilizaron ratones machos C57/Bl6J de 8-12 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (véase la Tabla de Materiales). Se estableció un modelo de ICFEP mediante la administración de una dieta alta en grasas durante 15 semanas en conjunto con NG-nitro-L-arginina metil éster, como se describió anteriormente¹⁰.

1. Preparación del catéter y calibración de presión/volumen

1. Coloque un catéter de conductancia en solución salina normal y conéctelo a un módulo que consta del PowerLab 8/35 y una unidad de presión-volumen (módulo MPVS, consulte la Tabla de materiales).
2. Calibrar electrónicamente la presión y el volumen mediante el registro de los parámetros predeterminados de presión (0 mmHg y 100 mmHg) y volumen (que varían entre los módulos MPVS) en el módulo MPVS ^3,11 (consulte también las instrucciones del fabricante).

2. Preparación de un animal para el cateterismo

1. Anestesia y ventilación
   1. Administrar una inyección intraperitoneal de 5 mg/kg de etomidato y 500 mg/kg de uretano (ver tabla de materiales) 5-10 min antes de la intubación.
      NOTA: El uretano, aunque es eficaz como agente anestésico en estudios con animales, se sospecha que es cancerígeno para los seres humanos. Por lo tanto, cuando el uretano es necesario para el logro de los objetivos experimentales y no basta con agentes alternativos, debe manipularse con precaución. Se exigen medidas de protección adecuadas, como el uso de guantes y mascarillas y el uso de una campana extractora durante la preparación. Como posible alternativa, se puede emplear ketamina (80 mg/kg, ip).
   2. Colocar al ratón en una cámara de anestesia previamente saturada con isoflurano al 2% y transferir al animal a una almohadilla térmica precalentada mantenida entre 38 °C y 40 °C durante la inducción de la anestesia.
   3. Afeita el área quirúrgica. Luego, desinfecte el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de betadine y alcohol.
   4. Haga una incisión horizontal (1-2 cm) en el cuello, extirpe el músculo traqueal y exponga la tráquea. Pase una sutura quirúrgica de seda 2-0 por debajo de la tráquea, elévela y haga una pequeña incisión (1-2 mm) para abrirla.
   5. Inserte un tubo endotraqueal en la tráquea y conéctelo a un ventilador que suministre una mezcla de 100 % de oxígeno y 2 % de isoflurano (reducida a 0,5 % a 1 % más adelante).
2. Inserción de catéter venoso central (CV) e inyección de líquido
   1. Localice la vena yugular interna debajo del músculo esternocleidomastoideo³.
   2. Inserte el catéter venoso central, que consiste en un tubo silástico de PE-10 (consulte la Tabla de materiales) conectado a una aguja de 30 G, en la vena yugular.
   3. Administrar una perfusión en bolo de 5-6 μL/g de peso corporal de albúmina/NaCl al 10% durante 3 min, seguida de una velocidad de perfusión constante de 5-10 μL/min.
      NOTA: Este paso es crucial para prevenir la hipotensión resultante de la vasodilatación periférica causada por la anestesia. La vena yugular interna se encuentra entre el músculo esternocleidomastoideo y la arteria carótida, y tiene un color más oscuro que la arteria.

3. Procedimiento quirúrgico para cateterismo ventricular izquierdo (abordaje a tórax abierto)

1. Afeitar el área quirúrgica del ratón anestesiado. Luego, desinfecte el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de betadine y alcohol.
2. Confirme la profundidad de la anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie. A continuación, haz una incisión horizontal (2-3 cm) por debajo de la apófisis xifoides, y separa la piel de la pared torácica con unas tijeras romas.
3. Cortar lateralmente a través de la pared torácica en ambos lados usando cauterio eléctrico (ver la Tabla de Materiales).
4. Exponga el corazón cortando a través del diafragma y retire el pericardio suavemente del corazón con fórceps.
5. Inserte una aguja de 27 G en el vértice del ventrículo izquierdo (VI) e inserte retrógradamente un catéter de conductancia en el VI a través del orificio de punción.
6. Ajuste la posición del catéter de modo que se obtenga un bucle de presión-volumen de forma cuadrada.
7. Verifique que el catéter no entre en contacto con el músculo papilar cuando se producen cambios en las condiciones de carga comprobando la forma del asa VP durante la oclusión de la vena cava inferior (VCI).
   NOTA: La exposición adecuada del corazón facilita el procedimiento y ayuda a obtener una visión clara.

4. Registro de los datos del bucle fotovoltaico y determinación de la relación presión-volumen telesistólico (ESPVR) y la relación presión-volumen telediastólica (EDPVR)

NOTA: La reducción de la precarga por oclusión de la VCI permite la determinación del ESPVR y el EDPVR.

1. Registre y analice el bucle de presión-volumen (PV) de referencia con el software LabChart (consulte la Tabla de Materiales), PowerLab y el módulo MPVS después de la estabilización de la señal (5-10 minutos después de la canulación).
2. Realice la oclusión de la VCI comprimiendo la VCI con fórceps y registre el asa VP durante al menos 20 ciclos cardíacos durante la oclusión de la VCI. Determine el ESPVR ajustando una línea de regresión lineal a través de los puntos telesistólicos del bucle PV y el EDPVR ajustando una línea curvilínea a través de los puntos telediastólicos del bucle PV utilizando el software LabChart.
   NOTA: Detenga el ventilador durante la oclusión de la VCI para evitar artefactos de movimiento pulmonar. Un agente paralizante como el pancuronio (0,5-1 mg/kg) puede ser útil cuando el movimiento pulmonar es excesivo y debe usarse solo después de que se confirme un plano anestésico estable.

5. Estimulación transesofágica

1. Inserte un catéter de electrodo tetrapolar de 2 Fr en el esófago, conecte el catéter a un estimulador de pulsos (consulte la Tabla de materiales) y determine el umbral de captura auricular (normalmente, la amplitud del estímulo es de 3 mA y el ancho de pulso es de 1 ms).
2. Disminuir la FC por debajo de 400 latidos/min con 20 mg/kg de ivabradina (ver la Tabla de Materiales) administrada por vía intraperitoneal.
3. Después de la estabilización, adquiera 20 ciclos cardíacos continuos de bucles VP a diferentes ritmos de 400 latidos/min a 700 latidos/min, con un incremento de 100 latidos/min; Adquiera los ciclos durante 5 minutos a cada ritmo de ritmo.

6. Calibración salina y calibración del flujo aórtico

1. Inactivar el ventilador y administrar 5-10 μL de suero fisiológico hipertónico por vía intravenosa a través del catéter CV.
2. Documente las fluctuaciones de presión y volumen durante la inyección de solución salina y calcule el valor de Vp utilizando PowerLab ^3,11.
3. Repita la calibración salina para mejorar la precisión y la reproducibilidad.
4. Gire el ratón sobre su lado izquierdo para no perturbar la señal de volumen.
5. Realice una toracotomía lateral entre Th3 y Th5 hacia la columna vertebral y diseccione suavemente una pequeña parte de la aorta descendente con fórceps.
6. Coloque una sonda de flujo vascular (consulte la Tabla de materiales) sobre la aorta para medir el gasto cardíaco.
   NOTA: El cálculo preciso del volumen absoluto requiere el uso de dos tipos de calibración: calibración salina y calibración del flujo aórtico. Es importante reconocer los riesgos potenciales asociados con una infusión de solución salina hipertónica en sujetos animales, ya que la carga excesiva de sal puede resultar en una disminución de la contractilidad.

7. Eutanasia

1. Después del estudio, se sacrificó a los ratones bajo una sobredosis de anestesia a través de la luxación cervical.
   NOTA: Para asegurar el cese completo de la función vital, se emplea un método secundario de eutanasia, como la exanguinación bajo anestesia con posterior extracción de tejido cardíaco.

Los datos de referencia del bucle fotovoltaico se muestran en la Figura 1 y en la Tabla 1. Al inicio del estudio (en ausencia de estimulación), no hubo diferencias significativas en los parámetros diastólicos, como la constante de tiempo de relajación (Tau), la tasa mínima de cambio de presión (dP/dt min) y EDPVR entre los ratones control y los ratones con HFpEF. Sin embargo, los ratones HFpEF exhibieron una presión arterial y una elastancia arterial (Ea) más altas, como se muestra en la Figura 1, y demostraron un bucle PV típico en forma de montaña durante la sístole ventricular. Esto debe distinguirse de un pico causado por el contacto directo del músculo ventricular con el transductor de presión (Figura 2). Es importante destacar que, mediante la estimulación auricular, la función diastólica pudo distinguirse claramente entre los ratones control y los ratones con ICFEP⁵ (Figura 3 y Figura 4). En el grupo control, tanto la Tau como la EDPVR mejoraron a medida que aumentaba la frecuencia de estimulación, mientras que, en el grupo de ICFEP, tanto la Tau como la EDPVR empeoraron a medida que aumentaba la FC con la estimulación auricular.

Figura 1: Relación representativa de presión-volumen en la línea de base en ausencia de estimulación, representada en una captura de pantalla. Los resultados mostraron que los ratones HFpEF exhibieron una mayor elastancia arterial y presión ventricular en comparación con los ratones de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Una imagen representativa de un bucle fotovoltaico en forma de espiga. Este tipo de forma de bucle fotovoltaico es el resultado de la compresión directa del transductor de presión por el músculo ventricular (mostrado por la punta de flecha naranja) y debe excluirse del análisis para mantener la precisión en los resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Gráfico representativo que ilustra las diferencias en los parámetros hemodinámicos en respuesta a la estimulación auricular entre los ratones modelo de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF) y los ratones control. La tabla distingue claramente entre los dos grupos, con una frecuencia cardíaca que oscila entre 400 latidos por minuto y 700 latidos por minuto. Abreviaturas: LVP = presión ventricular izquierda; dP/dt = primera derivada de LVP; EDPVR = relación presión-volumen al final de la diastólica; VIV = volumen del ventrículo izquierdo; Tau = constante de tiempo de relajación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Respuesta hemodinámica de los parámetros diastólicos a partir del análisis del bucle presión-volumen representado en términos de frecuencia cardíaca (FC). En los ratones modelo HFpEF, la función diastólica (Tau y EDPVR) se deterioró a medida que aumentaba la frecuencia cardíaca durante la estimulación auricular. El análisis de ANOVA de dos vías mostró un efecto principal significativo de la ICFEP (F = 28,95, p < 0,001) y la FC (F = 3,035, p = 0,08644) sobre el EDPVR, así como un efecto de interacción significativo entre el grupo y la frecuencia cardíaca (F = 3,938, p = 0,02454). Para Tau, hubo un efecto significativo del grupo (F = 25,56, p < 0,001) y la FC (F = 0,1088, p = 0,7425), así como un efecto de interacción significativo entre el grupo y la frecuencia cardíaca (F = 3,461, p = 0,03759). Los datos se muestran como la media ± error estándar. n = 6 ratones/grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ilustración representativa del procedimiento de calibración salina. La infusión de solución salina hipertónica altera la conductividad eléctrica de la sangre, lo que permite calcular el componente señal atribuido al tejido cardíaco circundante. La presión arterial debe permanecer estable durante la inyección, con un ligero aumento de volumen (que se muestra en la flecha naranja). Abreviaturas: LVP = presión ventricular izquierda; VIV = volumen ventricular izquierdo Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Ilustración representativa de la colocación adecuada del catéter de estimulación transesofágica. La colocación adecuada del catéter de estimulación transesofágica permite un ritmo QRS estrecho. Las flechas azules representan un ritmo sinusal normal y las flechas rojas muestran el ritmo de estimulación auricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Imagen representativa de una amplitud de estímulo ajustada incorrectamente en la estimulación auricular, lo que da lugar a un bucle de presión-volumen distorsionado. La intensidad de la estimulación indujo artefactos de movimiento no deseados en la señal de conductancia, representada como el bucle PV con una línea de agitación (indicada por las flechas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Parámetros cardiacos basales en ratones control e ICFEP. Los datos se muestran como la media ± error estándar; *p < 0,05 frente al control mediante la prueba t.

Presentamos una metodología para evaluar la relación presión-volumen con la aplicación de estimulación transesofágica. La intolerancia al ejercicio es una de las características clave de la ICFEP, sin embargo, no existen técnicas disponibles para la evaluación de la función cardíaca en ratones durante el ejercicio. Nuestro protocolo de estimulación ofrece una herramienta valiosa para detectar la disfunción diastólica, que puede no ser evidente en condiciones de reposo.

Para lograr un bucle fotovoltaico de calidad precisa y constante, se deben ejecutar meticulosamente los siguientes pasos 3,4,5,7,8,11,12,13,14: (1) los animales deben anestesiarse cuidadosamente y se debe mantener una temperatura corporal constante de 37-37,5 °C con una almohadilla térmica; (2) los animales deben ser intubados apropiadamente, y la ventilación debe ser controlada de manera efectiva; (3) debe garantizarse la colocación adecuada del acceso intravenoso; (4) el catéter de conductancia debe estar correctamente colocado dentro del VI; (5) el catéter transesofágico debe colocarse juiciosamente y se debe asegurar una estimulación adecuada; 6) el sistema de adquisición de datos debe estar conectado con cuidado, y los valores de ganancia y compensación deben ajustarse adecuadamente; (7) las señales de conductancia deben calibrarse utilizando solución salina hipertónica; (8) se debe verificar la medición adecuada del flujo aórtico con una sonda de flujo; (9) El bienestar de los animales debe ser objeto de un seguimiento continuo durante todo el procedimiento para reducir al mínimo cualquier artefacto inducido por el estrés o el movimiento.

La optimización de la dosis de anestesia es crucial para obtener un bucle de PV reproducible y de alta calidad en ratones. Normalmente, se administra una dosis de 800 mg/kg de uretano y 5-10 mg/kg de etomidato. Sin embargo, en casos de insuficiencia cardíaca patológica, es recomendable administrar una dosis menor de anestésico. Durante el procedimiento, es esencial mantener una temperatura corporal caliente de 37-38 °C colocando suavemente al animal anestesiado sobre una almohadilla térmica. Esto es especialmente importante para los ratones porque una caída en la temperatura corporal puede causar una disminución significativa en la FC. Además, la exposición adecuada del corazón es crucial para obtener una visión clara y facilitar el procedimiento. En algunos casos, cortar las costillas 12 a 11 puede ser útil para exponer el corazón.

El proceso de intubación debe realizarse con precaución para evitar daños en las arterias carótidas y los nervios vagos cerca de la tráquea. La configuración del ventilador debe ajustarse en función del peso corporal del animal utilizando las fórmulas proporcionadas³:

Volumen corriente (Vt, mL) = 6,2 × W^1,01 (W = peso corporal, kg)
Frecuencia respiratoria (RR, ^mín-1) = 53,5 × W^−0,26
Por ejemplo, Vt = 149,4 μL, RR = 140/min en un ratón de 25 g.

Antes de la canulación, el catéter venoso (con una aguja de 30 G) debe cebarse completamente con albúmina al 10% e insertarse en la vena en un ángulo poco profundo para evitar el desgarro de las frágiles paredes de la vena. La colocación adecuada del catéter de conductancia dentro del ventrículo izquierdo (VI) es primordial para obtener resultados precisos. El catéter debe estar alineado con el eje longitudinal del VI, con todos los electrodos colocados entre el tracto de salida del VI y el borde endocárdico apical. Se debe obtener un asa VP estable sin muescas durante todo el procedimiento, incluso durante la oclusión intravenosa, la calibración hipertónica de solución salina y la estimulación transesofágica. En la calibración salina, las presiones del VI deben ser estables durante la inyección hipertónica de solución salina, y se utilizan los latidos durante la fase inicial de lavado de las señales de volumen ascendente (Figura 5). Hay que tener cuidado de no inyectar volúmenes de solución salina hipertónica superiores a 20 μL, ya que la solución salina hipertónica podría deprimir fácilmente la función cardíaca por sobrecarga de volumen. Se debe confirmar que el catéter de estimulación introducido a través del esófago está en la posición adecuada a través de la captura auricular (Figura 6), y la amplitud del estímulo debe ajustarse adecuadamente (generalmente 3 mA, con un ancho de pulso de 1 ms). Una estimulación más fuerte afectaría al catéter de conductancia y provocaría un bucle PV en forma de temblor (Figura 7).

El cálculo preciso del volumen absoluto requiere la utilización de dos tipos de calibración: calibración salina y calibración del flujo aórtico. La técnica del catéter de conductancia requiere una evaluación del desplazamiento de la conductancia paralela (Vp) para tener en cuenta la conductancia medida no solo de la acumulación de sangre dentro de la cavidad ventricular, sino también de las estructuras circundantes. Esta evaluación se puede lograr mediante la administración de una infusión de bolo salino hipertónico. La calibración del flujo aórtico permite la medición directa del flujo aórtico, lo que, a su vez, permite determinar el volumen sistólico absoluto. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta calibración proporciona solo el volumen sistólico absoluto y no el volumen ventricular absoluto. Para obtener el volumen ventricular absoluto, se debe realizar tanto la calibración salina como la calibración aórtica.

Este método tiene algunas limitaciones. En primer lugar, se empleó un abordaje transapical al introducir el catéter de conductancia. Para acceder al ápice del VI, es necesario extirpar el pericardio. Esto podría afectar a los parámetros diastólicos, especialmente a los pediátricos. En segundo lugar, es posible que se pierda algo de sangre durante el largo tiempo del procedimiento, lo que también podría afectar los parámetros funcionales cardíacos, pero estos problemas pueden evitarse si se vuelve más competente en los procedimientos. Cabe destacar que el modelo de ICFEP utilizado en este protocolo no replica completamente la ICFEP humana, que es un síndrome con varios fenotipos en función de las comorbilidades asociadas, como obesidad, diabetes mellitus, hipertensión, fibrilación auricular o fallo multiorgánico. No existe un modelo de ratón disponible que imite todas estas comorbilidades. Sin embargo, el modelo de ratones con HFpEF de doble impacto es más relevante para la HFpEF humana con comorbilidades metabólicas¹⁰. Los antecedentes genéticos de los ratones podrían afectar a la función diastólica. Si bien se ha informado que los ratones C57BL/6J muestran respuestas diferenciales al estrés cardiovascular y un fenotipo de enfermedad potencialmente más leve en comparación con los ratones C57BL/6N, este protocolo ha detectado deterioro diastólico en el modelo de dos golpes incluso en el fondo C57BL/6J⁵, lo que podría ser difícil con otras modalidades generalmente empleadas en ratones.

Este manuscrito tiene como objetivo proporcionar una guía para realizar los procedimientos de bucle VP asociados a la estimulación de manera efectiva, lo que puede ser útil para evaluar la función cardíaca asociada a la FC y avanzar en la investigación sobre la insuficiencia cardíaca.

No hay intereses financieros contrapuestos.

Este trabajo contó con el apoyo de becas de investigación de la Fundación Fukuda para la Tecnología Médica (a E.T. y G.N.) y la Beca de Investigación Científica JSPS KAKENHI 21K08047 (a E.T.).