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Presentamos un protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir de dientes humanos. Los organoides son robustamente expandibles y recapitulan las células madre epiteliales del diente, incluida su capacidad de diferenciación de ameloblastos. El modelo organoide único proporciona una herramienta prometedora para estudiar la biología dental humana (células madre) con perspectivas para enfoques regenerativos de dientes.
Los dientes son de importancia clave en la vida no solo para la masticación de los alimentos y el habla, sino también para el bienestar psicológico. El conocimiento sobre el desarrollo de los dientes humanos y la biología es escaso. En particular, no se sabe mucho sobre las células madre epiteliales del diente y su función. Logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido dental humano (es decir, folículo dental, aislado de muelas del juicio extraídas). Los organoides son expandibles de forma robusta y a largo plazo y recapitulan el compartimento de células madre epiteliales del diente humano propuesto en términos de expresión de marcadores, así como de actividad funcional. En particular, los organoides son capaces de desplegar un proceso de diferenciación de ameloblastos como ocurre in vivo durante la amelogénesis. Este modelo organoide único proporcionará una herramienta poderosa para estudiar no solo el desarrollo de los dientes humanos, sino también la patología dental, y puede allanar el camino hacia la terapia regenerativa dental. Reemplazar los dientes perdidos con un diente biológico basado en este nuevo modelo de organoides podría ser una alternativa atractiva a la implantación estándar actual de materiales sintéticos.
Los dientes tienen funciones esenciales en la masticación de los alimentos, el habla y el bienestar psicológico (autoimagen). El diente humano consiste en tejidos altamente mineralizados de densidad y dureza variables1. El esmalte dental, el componente principal de la corona dental, es el tejido mineralizado más alto del cuerpo humano. Durante la formación del esmalte (amelogénesis), cuando se desarrollan los dientes, las células madre epiteliales dentales (DESC) se diferencian en células formadoras de esmalte (ameloblastos). Una vez formado, el esmalte rara vez se repara o renueva debido a la pérdida apoptótica de los ameloblastos al inicio de la erupción dental1. La restauración del tejido del esmalte dañado, causado por un traumatismo o enfermedad bacteriana, se realiza actualmente utilizando materiales sintéticos; sin embargo, estos están preocupados por deficiencias importantes como la microcongestión, la osteointegración y el anclaje inferiores, la vida útil finita y la falta de reparación completamente funcional2. Por lo tanto, un cultivo robusto y confiable de DESC humanos con la capacidad de generar ameloblastos y el potencial de producir tejido mineralizado sería un gran paso adelante en el campo de la regeneración dental.
El conocimiento sobre el fenotipo DELSC humano y la función biológica son escasos 3,4,5. Curiosamente, se ha propuesto que los DESC de los dientes humanos existen en los restos de células epiteliales de Malassez (ERM), grupos celulares presentes dentro del folículo dental (DF), que rodea los dientes no erupcionados y permanece presente en el ligamento periodontal alrededor de la raíz una vez que el diente entra en erupción1. Se ha encontrado que las células ERM cocultivadas con pulpa dental se diferencian en células similares a los ameloblastos y generan tejido similar al esmalte6. Sin embargo, los estudios profundos sobre el papel específico de las células ERM en la (re)generación de esmalte han sido limitados debido a la falta de modelos de estudio confiables7. Los sistemas actuales de cultivo in vitro ERM se ven obstaculizados por la vida útil limitada y la rápida pérdida de fenotipo en las condiciones 2D utilizadas estándarmente 8,9,10,11,12. Por lo tanto, se necesita un sistema in vitro manejable para expandir, estudiar y diferenciar fielmente los DESC humanos.
Durante la última década, una poderosa técnica para cultivar células madre epiteliales in vitro se ha aplicado con éxito a varios tipos de tejidos epiteliales (humanos) para estudiar su biología, así como la enfermedad 13,14,15,16. Esta tecnología permite que las células madre epiteliales tisulares se desarrollen automáticamente en construcciones de células 3D (es decir, organoides) cuando se siembran en un andamio que imita la matriz extracelular (ECM) (típicamente, Matrigel) y se cultivan en un medio definido que replica la señalización del nicho de células madre del tejido y / o la embriogénesis. Los factores de crecimiento típicos necesarios para el desarrollo de organoides incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y los activadores del sitio de integración MMTV (WNT) de tipo sin alas 14,15,16. Los organoides resultantes se caracterizan por una fidelidad duradera en la imitación de las células madre epiteliales originales del tejido, así como una alta capacidad de expansión al tiempo que conservan su fenotipo y propiedades funcionales, superando así la disponibilidad de tejido humano primario a menudo limitada adquirida en la clínica. Para establecer organoides, no se requiere el aislamiento de las células madre epiteliales del tejido heterogéneo (es decir, que comprende otros tipos de células, como las células mesenquimales) antes del cultivo, ya que las células mesenquimales no se adhieren o prosperan en la ECM, lo que eventualmente resulta en organoides puramente epiteliales 13,16,17,18,19 . Esta tecnología prometedora y versátil ha llevado al desarrollo de múltiples modelos organoides a partir de diversos tejidos epiteliales humanos. Sin embargo, los organoides derivados de dientes humanos, valiosos para el estudio profundo del desarrollo, la regeneración y la enfermedad de los dientes, aún no se han establecido20,21. Recientemente logramos desarrollar un nuevo modelo organoide a partir de tejido DF a partir de terceros molares (muelas del juicio) extraídos de pacientes adolescentes19.
Aquí, describimos el protocolo para desarrollar cultivos de organoides epiteliales a partir del diente humano adulto (es decir, a partir del DF de terceros molares) (Figura 1A). Los organoides resultantes expresan marcadores de tallo asociados a ERM mientras que son expandibles a largo plazo. Curiosamente, a diferencia de la mayoría de los otros modelos de organoides, el EGF típicamente necesario es redundante para el desarrollo y crecimiento de organoides robustos. Curiosamente, los organoides del tallo muestran propiedades de diferenciación de ameloblastos, imitando así las características y procesos de ERM / DESC que ocurren in vivo. El nuevo y único modelo organoide descrito aquí permite explorar la biología, la plasticidad y la capacidad de diferenciación de DESC y abre la puerta para dar los primeros pasos hacia enfoques regenerativos de los dientes.
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Ética de Investigación UZ/KU Leuven (13/0104U). Los terceros molares extraídos (muelas del juicio) se obtuvieron después del consentimiento informado de los pacientes.
1. Preparativos
2. Disociación del folículo dental
3. Establecimiento del cultivo de organoides dentales (Figura 1A y Figura 2A)
4. Amplificación y paso a través del cultivo de organoides dentales (Figura 1B y Figura 2B)
5. Criopreservación de organoides dentales
6. Descongelación de organoides dentales criopreservados
7. Fijación e incrustación de parafina de organoides dentales
NOTA: Este procedimiento (incluidas las secciones 8 y 9) también se puede aplicar al tejido primario de DF.
8. Seccionamiento y tinción del microtomo de organoides dentales (Figura 2B y Figura 3A-C)
9. Extracción de ARN y RT-qPCR de organoides dentales (Figura 2B y Figura 3D)
Desarrollo de organoides dentales
Proporcionamos un protocolo detallado para establecer cultivos de organoides a partir de tejido DF humano adquirido después de la extracción de muelas del juicio (Figura 1A). La DF aislada se disocia enzimática y mecánicamente. Las células obtenidas se cultivan dentro de BMM en medios que se definieron empíricamente para el desarrollo y crecimiento óptimo de organoides (medio organoide dental; TOM)19.
Los organoides generalmente se desarrollan dentro de las 2 semanas posteriores a la siembra de células DF (P0; Figura 2A). Los organoides son expandibles a largo plazo (hasta 11 pasajes hasta ahora) (Figura 2B, que se muestra en P4). La siembra de alrededor de 20,000 células por gota de BMM (tanto en P0 como en pasajes posteriores) produce una densidad óptima de organoides (Figura 2C), mientras que la siembra de un mayor número de células conduce a un crecimiento organoide subóptimo (es decir, organoides más pequeños a una densidad demasiado alta) ya que no hay espacio suficiente para crecer (Figura 2D). Las condiciones de cultivo eventualmente optimizadas permiten el desarrollo de organoides a partir de muestras de DF con una eficiencia del 100%19.
Caracterización y validación de organoides dentales
Los organoides desarrollados muestran una apariencia densa y contienen células que muestran una alta relación nucleo-citoplasmática, como se observa de manera similar en las células ERM7 (Figura 3A). Además, y en una analogía adicional, los organoides expresan el marcador ERM citoqueratina 14 (CK14)22, confirmando así su origen epitelial (Figura 3B), así como otros marcadores ERM propuestos (como P63, CD44 e ITGα6 12,22,23 (Figura 3B). Además, los organoides expresan SOX2, un conocido marcador DESC en ratones y también presente en el epitelio de los dientes humanos en desarrollo (Figura 3B)1. Curiosamente, la amelogenina (AMELX), el componente principal de la matriz del esmalte, que también se encuentra expresado en los organoides, también se detecta en el ERM24 (Figura 3C). La expresión de otros marcadores de ERM/stemness se describe en nuestro estudio reciente19 y se puede utilizar para certificar aún más los organoides obtenidos. Además, los organoides conservan su fenotipo ERM/stemness durante el pasaje, entre otros mostrados por la expresión estable de marcadores ERM/células madre (Figura 3D). Finalmente, los organoides derivados de dientes muestran capacidad de diferenciación a las células ameloblastos(-like), que también se pueden aplicar para validar los cultivos organoides obtenidos, mostrando expresión de marcadores maduros de ameloblastos como la proteína asociada a ameloblastos odontogénicos (ODAM) y la amelotina (AMTN) después de la transferencia al medio de diferenciación (ver19).
Figura 1: Flujo de trabajo esquemático del desarrollo, caracterización y aplicaciones de organoides dentales. (A) Desarrollo de organoides dentales a partir de tejido de folículo dental (DF) aislado de terceros molares no erupcionados. (B) Amplificación, caracterización y potencial de aplicación de organoides dentales. d, día; P, pasaje. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Desarrollo de organoides dentales. (A) Desarrollo de organoides a partir de tejido DF. Imágenes representativas de campos brillantes mostradas en diferentes días (d) después de la siembra (P0; P, pasaje; 2.5x). (B) Imágenes de Campo Brillante que muestran una pasabilidad robusta de una línea organoide dental (2.5x). (C) Imágenes de campo brillante que muestran una línea organoide dental inmediatamente al pasar (d0; izquierda; 2.5x) sembrada a una densidad de 20,000 células por pozo, y el cultivo organoide confluente resultante listo para ser pasado (d14; derecha; 2.5x). (D) Imágenes de campo brillante que muestran una línea organoide dental, que había sido sembrada a una densidad de >20,000 células, lo que lleva a organoides más pequeños a una densidad demasiado alta a d14 (2.5x). Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Caracterización de organoides dentales. (A) Imágenes de campo brillante de cultivos organoides derivados de DF a diferentes aumentos que muestran estructuras densas desarrolladas a los 14 días en TOM (P4; 5-20x)). Tinción de hematoxilina y eosina de un organoide (P1, día 11). La caja se amplía. Las flechas indican células con una alta relación nucleo-citoplasmática. (B) Tinción inmunofluorescente para marcadores epiteliales/ERM/stemness en organoides cultivados con TOM (20x). (C) Tinción inmunofluorescente para amelogenina (AMELX) en organoides cultivados con TOM (20x). Se utilizó DAPI (azul) para etiquetar núcleos. (D) Niveles de expresión génica (en relación con GAPDH) de marcadores ERM/stemness en organoides cultivados con P1 y P5 TOM en el día 14 del cultivo (media ± SEM; n = 3 réplicas biológicas). Barras de escala: 50 μm, a menos que se indique lo contrario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Medio de recolección de folículos dentales (DF) | |
Nombre | Concentración |
Águila media esencial mínima (αMEM) | |
Suero fetal bovino (FBS) | 10% |
Anfotericina B | 0.5% |
Penicilina-estreptomicina (Pen/Strep) | 1% |
Tabla 1: Medio de recolección de folículos dentales (DF). La tabla enumera los componentes del medio de recolección DF.
Medio organoide dental (TOM) | |
Nombre | Concentración |
Medio definido sin suero (SFDM) | Véase la composición en el cuadro 3 |
A83-01 | 0,5 μM |
B27 (sin vitamina A) | 2% |
Toxina del cólera | 100 ng/ml |
FGF2 (= FGF básico) | 20 ng/ml |
FGF8 | 200 ng/ml |
FGF10 | 100 ng/ml |
L-glutamina | 2 mM |
IGF-1 | 100 ng/ml |
N2 | 1% |
N-acetil L-cisteína | 1,25 mM |
Nicotinamida | 10 mM |
Cabeza | 100 ng/ml |
RSPO1 | 200 ng/ml |
SB202190 (p38i) | 10 μM |
Chito | 100 ng/ml |
WNT3a | 200 ng/ml |
Tabla 2: Medio organoide dental (TOM). La tabla enumera los componentes y sus respectivas concentraciones requeridas para preparar el medio organoide dental.
Medio definido sin suero (SFDM) (pH 7.3) | |
Nombre | Concentración |
Estéril H2O | |
DMEM 1:1 F12 sin Fe | 16,8 g/L |
Transferrina | 5 mg/L |
Insulina del páncreas bovino | 5 mg/L |
Sal sódica de penicilina G | 35 mg/L |
Sal de sulfato de estreptomicina | 50 mg/L |
Etanol absoluto, ≥99,8% (EtOH) | 600 μL/L |
Catalasa del hígado bovino | 50 μL/L |
Carbonato de hidrógeno sódico (NaHCO3) | 1 g/L |
Albúmina bovina (grado de cultivo celular) | 5 g/L |
Tabla 3: Medio definido sin suero (SFDM) (pH 7.3). La tabla enumera la composición del medio definido sin suero.
Medio de disociación | |
Nombre | Concentración |
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | |
Colagenasa IV | 3 mg/ml |
Dispasa II | 4 mg/ml |
Tabla 4: Medio de disociación. Lista de componentes y sus concentraciones requeridas para preparar el medio de disociación.
Medio A (pH 7.3) | |
Nombre | Concentración |
Estéril H2O | |
DMEM polvo alto glucosa | 13,38 g/L |
HEPES | 5,958 g/L |
Piruvato de sodio (C3H3NaO3) | 110 mg/L |
Sal sódica de penicilina G | 35 mg/L |
Sal de sulfato de estreptomicina | 50 mg/L |
Cloruro de sodio (NaCl) | 0,5 g/L |
Carbonato de hidrógeno sódico (NaHCO3) | 1 g/L |
Albúmina bovina (grado de cultivo celular) | 3 g/L |
Dnase* | 0,2 mg/ml |
*añadir cuando se menciona |
Tabla 5: Medio A (pH 7.3). La tabla enumera la concentración de los componentes utilizados para preparar el Medio A.
Anticuerpos primarios | ||
Nombre | Anfitrión | Concentración |
AMELX | ratón | 1:100 |
CD44 | ratón | 1:200 |
CK14 | ratón | 1:200 |
ITGA6 | conejo | 1:200 |
P63 | conejo | 1:1000 |
SOX2 | conejo | 1:2000 |
Anticuerpos secundarios | ||
Nombre | Anfitrión | Concentración |
ratón IgG (Alexa 555) | burro | 1:1000 |
conejo IgG (Alexa 488) | burro | 1:1000 |
Tabla 6: Lista de anticuerpos y sus diluciones. La tabla enumera los anticuerpos y sus respectivas diluciones utilizadas en este estudio.
Imprimaciones | ||
Gen | Imprimación delantera | Imprimación inversa |
GAPDH | GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC | ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG |
P63 | CAACGCAGTAGACACCATTTCC | CCCAAAACCTTCTCGCTTGTT |
ITGA6 | GGCGGTGTTATGTCCTGAGTC | AATCGCCCATCACAAAAGCTC |
SOX2 | GCTGGGACATGTGAAGTCTG | CCCTGTGGTTACCTCTTCCT |
PITX2 | CAGCGGACTCACTTTACCAG | ATTCTTGAACCAAACCCGGAC |
Tabla 7: Lista de cebadores. La tabla enumera los cebadores de GAPDH, P63, ITGA6, SOX2 y PITX2 utilizados en este estudio.
Este protocolo describe la generación eficiente y reproducible de organoides a partir del diente humano. Hasta donde sabemos, esta es la primera metodología para establecer organoides de concepto actual (epitelial) a partir de tejido dental humano. Los organoides son expandibles a largo plazo y muestran un fenotipo de tallo epitelial dental, duplicando los DESC previamente reportados en el compartimiento ERM del DF7. Además, los organoides replican las características funcionales de DESC/ERM, incluyendo el despliegue de un proceso de diferenciación de ameloblastos 7,25,26. Los hallazgos son sólidos ya que se encontraron resultados comparables con líneas organoides de pacientes independientes19.
Al ejecutar este protocolo de organoides dentales, se deben tener en cuenta varios puntos críticos. En primer lugar, la adición del inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 en la siembra inicial e inmediatamente después de cada pasaje es esencial para evitar que las células individuales se sometan a anoikis27. Además, se requiere anfotericina B en todos los refrescos de medios durante P0 para evitar el crecimiento fúngico (oral). En segundo lugar, se recomienda procesar inmediatamente los tejidos DF recién aislados para la formación óptima de organoides y la eficiencia del crecimiento, en lugar de comenzar a partir del tejido criopreservado, lo que resulta en una menor eficiencia. En tercer lugar, al descongelar una línea organoide criopreservada para el cultivo, realice los pasos lo más rápido posible y evite el tiempo de descongelación demasiado largo, así como los intervalos demasiado largos entre los pasos, ya que la prolongación del tiempo disminuye la supervivencia celular. En cuarto lugar, debe tenerse en cuenta que el número de organoides en el paso temprano (P0-P3) puede seguir siendo limitado, también porque solo un número limitado de células ERM (madre) pueden estar presentes en las muestras específicas aisladas de tejido DF. Por lo tanto, los cultivos de organoides en el paso temprano deben manejarse con cuidado y consideración. Por lo tanto, se recomienda (i) evitar la expansión rápida del cultivo de organoides (es decir, solo comenzar a dividirse a 1: 3 o más a partir de P3-4, y antes a 1: 0.5 o 1: 1); (ii) utilizar el método de división apropiado (paso bajo - pasaje más alto) como se describe. En este contexto, se aconseja recolectar muelas del juicio no erupcionadas de pacientes adolescentes jóvenes (15 a 19 años) ya que las células ERM disminuyen en número con el desarrollo de los dientes y la edadde 28 años. En quinto lugar, los fragmentos de tejido duro no dispersos restantes del tejido DF en la suspensión celular (incluso después del filtrado) hacen que la caída de BMM sea menos estable y más probable que se desaloje durante el cultivo. Se recomienda un mayor porcentaje de BMM (como el 80%) si se observan múltiples fragmentos de tejido duro no dispersos en la suspensión disociada de células DF. En sexto lugar, se recomienda encarecidamente pasar los organoides entre el día 10 y el día 14 de cultivo, ya que un cultivo más largo afectará negativamente la capacidad de expansión de los organoides debido a una disociación menos óptima. Si por una u otra razón, los organoides se cultivan más de 14 días, la cantidad de TryplE Express y el tiempo de incubación para la disociación organoide podrían extenderse para una disociación eficiente, aunque no se deben superar los 15 minutos de exposición enzimática. Dentro del mismo contexto, el medio de cultivo debe actualizarse cada 2-3 días para evitar el agotamiento de nutrientes y factores de crecimiento. En caso de que los organoides no se expandan adecuadamente, independientemente de los puntos críticos mencionados anteriormente, uno debe centrarse en mantener todas las herramientas (BMM, SFDM helado para la punta de pre-recubrimiento, tubos de microcentrífuga) utilizadas durante el paso en hielo. Además, es crucial aplicar correctamente los distintos métodos de paso (paso bajo y método de paso más alto) para un paso eficiente de los organoides.
Antes, otros grupos han reportado crecimiento in vitro de tejido PRIMARIO humano DESC/ERM 8,9,10,11,12,21. Sin embargo, los cultivos fueron principalmente 2D (monocapas) y no 3D, como este modelo organoide, además solo mostrando crecimiento a corto plazo y retención de fenotipos. Alternativamente, a menudo (espontáneamente) se utilizaron células inmortalizadas, que, sin embargo, no son fisiológicas y muestran solo un parecido limitado con el tejido o las células de origen. Además, estas líneas celulares se derivaron de tejido embrionario y/o de animales. Además, la diferenciación de ameloblastos no se describe o solo se documenta de manera limitada. Así, el modelo organoide aquí presentado ofrece varias ventajas, siendo (i) recapitulación fiel del tejido/células de origen, (ii) expandible a largo plazo, (iii) cultivado en 3D representando más de cerca la configuración in vivo, (iv) de origen humano y edad postnatal, y (v) capaz de diferenciarse en células dentales maduras (tipo de célula ameloblasto) (ver19).
Así, generamos una valiosa herramienta de investigación, no reportada antes, con varias aplicaciones interesantes (Figura 1B). Los organoides se pueden aplicar para estudiar el tallo y la plasticidad del DESC / ERM humano. Brinda la oportunidad de obtener más información sobre la biología de la aún enigmática población de células ERM por medio de análisis inmunofluorescentes, de expresión génica y transcriptómicos (de una sola célula). Además, los organoides son particularmente adecuados para el modelado de enfermedades humanas para descifrar mecanismos patogénicos, identificar (nuevas) dianas terapéuticas y generar herramientas de descubrimiento y detección de fármacos29. Más específicamente, este modelo se puede aplicar a quistes odontogénicos (para los cuales no se dispone de un modelo de investigación confiable), que se puede comparar con organoides derivados de dientes sanos. Además, este enfoque organoide dental puede aprovecharse para modelar y estudiar enfermedades dentales que van desde el impacto de las bacterias hasta las mutaciones genéticas asociadas con anomalías dentales (como las mutaciones en P63, que podrían introducirse utilizando métodos de edición de genes de vanguardia como CRISPR-Cas)30, lo que eventualmente conducirá a objetivos terapéuticos y tratamientos potenciales y novedosos. Otras aplicaciones del protocolo de organoides dentales pueden incluir biobancos (actualmente ya disponibles para la pulpa dental, como el Future Health Biobank)31 para recolectar líneas organoides de múltiples personas y enfermedades (por ejemplo, para investigación básica y traslacional, como la detección de drogas). Además, recientemente se han publicado varios informes sobre modelos organoides compuestos que contienen no solo epiteliales sino también otros tipos celulares del tejido de origen32,33. Como la composición dental es bastante compleja, acomodando células mesenquimales, inmunes y endoteliales, aplicar este modelo organoide epitelial en combinación con estos tipos de células para representar más detalladamente su contraparte in vivo es una perspectiva atractiva. Además, este sistema permite explorar la amelogénesis en el diente humano, en la actualidad solo poco conocida, pero ciertamente confiando en las interacciones epitelial-mesenquimal. Se espera que descifrar el desarrollo de ameloblastos represente un importante salto adelante en el mundo científico y clínico dental, ya que la producción de esmalte, el componente por excelencia de nuestros dientes, es un objetivo muy perseguido en la reparación del tejido dental. Además, el modelado de organoides detallado en este estudio puede significar el comienzo hacia la formación de tejidos mineralizados in vitro y allanar el camino hacia el desarrollo de un diente de bioingeniería (o al menos partes) para la terapia de reemplazo.
Una de las limitaciones del modelo organoide es que representa únicamente el componente epitelial del tejido. Sin embargo, como se describió en detalle anteriormente, esta deficiencia podría resolverse mediante la adición de otros tipos de células / tejidos, como el mesénquima dental19. Otro aspecto que puede reconocerse como una limitación es el origen del BMM utilizado aquí (Matrigel). Este BMM se deriva de un sarcoma (Engelbrecht-Holm-Swarm) de un ratón y, por lo tanto, debe reemplazarse antes de traducir el enfoque organoide a la clínica. Recientemente, se han realizado varios esfuerzos para reemplazar Matrigel con hidrogeles sintéticos34,35. Sin embargo, se necesita más investigación para cultivar con éxito organoides en tales geles no naturales. Aunque la tecnología de organoides proporciona un enfoque interesante para la futura terapia regenerativa dental, por ejemplo, el desarrollo de un diente de bioingeniería, se deben plantear preguntas éticas con respecto a la privacidad de los donantes de células, así como la comercialización de organoides humanos y tejidos derivados de los mismos. Hasta el momento, no se han llegado a conclusiones sobre la comercialización de organoides con fines regenerativos36. Los biobancos de pulpa dental han ido en aumento31, así como los biobancos de organoides de varios tejidos, principalmente cancerosos, con fines de detección de drogas. Dado que los organoides no se pueden clasificar como células, gametos, tejidos u órganos (que todos están regulados por la ley), existe una necesidad urgente de representar su estado jurídico para su uso en entornos clínicos, científicos o comerciales. A pesar de que los organoides han demostrado depositar tejido mineralizado cuando se trasplantan por vía subcutánea in vivo19, se requieren más estudios para analizar su potencial para depositar esmalte similar al de un diente humano natural.
En conjunto, el nuevo modelo organoide desarrollado presenta una herramienta prometedora y valiosa para estudiar la biología de los dientes humanos (células madre) y la amelogénesis, ambas en la actualidad poco exploradas, con perspectivas futuras hacia el modelado de enfermedades dentales y las terapias regenerativas.
El autor correspondiente se asegura de que todos los autores hayan revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses.
Agradecemos a todos los miembros del personal de Cirugía Oral y Maxilofacial (MKA) de UZ Leuven, así como a los pacientes, por su inestimable ayuda en la recolección de terceros molares recién extraídos. También nos gustaría agradecer a la Dra. Reinhilde Jacobs y a la Dra. Elisabeth Tijskens por su ayuda con la recolección de muestras. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de KU Leuven (BOF) y FWO-Flanders (G061819N). L.H. es un FWO Ph.D. Fellow (1S84718N).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120.086 | |
15 mL Centrifuge tube | Corning | 430052 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-6250 | |
48-well flat bottom plates | Corning | 3548 | |
50 mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330.03 | |
AMELX antibody | Santa Cruz | sc-365284 | |
Amphotericin B | Gibco | 15200018 | |
B27 (without vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Cassette | VWR | 7202191 | |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C100 | |
CD44 antibody | Abcam | ab34485 | |
Cell strainer, 40 µm | Falcon | 352340 | |
Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
Citric acid | Sigma-Aldrich | C0759 | |
CK14 antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-11599 | |
Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
Cover glass | VWR | 6310146 | |
Cryobox | Thermo Scientific | 5100-0001 | |
Cryovial | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693 | |
DMEM 1:1 F12 without Fe | Invitrogen | 074-90715A | |
DMEM powder high glucose | Gibco | 52100039 | |
Dnase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 - 10ML | |
Embedding workstation, 220 to 240 Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH) | Fisher Chemical | E/0650DF/15 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
FGF2 (= basic FGF) | R&D Systems | 234-FSE-025 | |
FGF8 | Peprotech | AF-100-25 | |
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT | Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer |
Glass Pasteur pipette | Niko Mechanisms | 170-40050 | |
Glycine | VWR | 101194M | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
IGF-1 | PeproTech | 100-11 | |
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI) | Sigma-Aldrich | 688001 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
ITGA6 antibody | Sigma-Aldrich | HPA012696 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030024 | |
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free) | Corning | 15505739 | |
Microscope slide | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SLGV033R | |
Minimum essential medium eagle (αMEM) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-31570 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
N-acetyl L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | PeproTech | 120-10C | |
P63 antibody | Abcam | ab124762 | |
Pap Pen | Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | Marking pen |
Paraformaldehyde (PFA), 16% | Merck | 8.18715 | |
Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
Petri dish | Corning | 353002 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
Pipette (P20, P200, P1000) | Eppendorf or others | 2231300006 | |
Plastic transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.001 | |
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
RSPO1 | PeproTech | 120-38 | |
SB202190 (p38i) | Biotechne (Tocris) | 1264 | |
Scalpel (surgical blade) | Swann-Morton | 207 | |
SHH | R&D Systems | 464-SH-200 | |
Silicone molds (Heating block) | VWR | 720-1918 | |
Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P-5280 | |
SOX2 antibody | Abcam | ab92494 | |
StepOnePlus | Thermo Fisher Scientific | Real-Time PCR System | |
Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
Sterile 1000 μL pipette tips with filter | Greiner | 740288 | |
Sterile 20 μL pipette tips with filter | Greiner | 774288 | |
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter | Greiner | 739288 | |
Sterile H2O | Fresenius | B230531 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Superscript III first-strand synthesis supermix | Invitrogen | 11752-050 | Reverse transcription kit |
Tissue processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
Transferrin | Serva | 36760.01 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE express | Gibco | 12605-010 | |
Vectashield mounting medium+DAPI | Labconsult NV | H-1200 | Antifade mounting medium with DAPI |
WNT3a | Biotechne (Tocris) | 5036-WN-500 | |
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology | VWR | 2,89,75,325 |
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