Method Article
El tamaño y forma de las partículas de lodos activados son parámetros importantes que se miden utilizando diferentes métodos. Errores surgen de muestreo no representativo, imágenes subóptimas y parámetros de análisis subjetivo. Para minimizar estos errores y facilitar la medición, presentamos un protocolo especificando cada paso, incluyendo un oleoducto de software de código abierto.
Bioreactores experimentales, tales como ésos tratamiento de aguas residuales, contienen partículas cuyo tamaño y forma son parámetros importantes. Por ejemplo, el tamaño y la forma de flóculos de lodo activado pueden indicar las condiciones en la microescala y afectan también directamente cómo el lodo se instala en un clarificador.
Forma y tamaño de las partículas son ambas medidas misleadingly 'simples'. Muchas cuestiones sutiles, a menudo ignoradas en protocolos informales, pueden surgir cuando el muestreo, la proyección de imagen y análisis de partículas. Métodos de muestreo pueden ser sesgados o no proporcionan suficiente poder estadístico. Las muestras se pueden llevar mal o sufren alteración durante la inmovilización. Las imágenes pueden ser de calidad suficiente; superposición de partículas, profundidad de campo, nivel de ampliación y ruidos varios puede todos producir malos resultados. Mal especificado análisis pueden introducir sesgos, como el producido por segmentación y umbral de imagen manual.
Rendimiento y la asequibilidad son deseables junto con reproducibilidad. Un método asequible, de alto rendimiento permite medición de partícula más frecuente, produciendo muchas imágenes que contiene miles de partículas. Un método que utiliza reactivos de bajo costo, un microscopio de disección común y libremente disponibles análisis software libre permite resultados experimentales repetibles, accesibles, reproducibles y parcialmente automatizado. Además, el producto de dicho método puede ser bien formateado, bien definido y fácil de entender por software de análisis de datos, facilitando datos entre laboratorios y análisis en laboratorio.
Presentamos un protocolo que detalla los pasos necesarios para producir un producto, incluyendo: toma de muestras, la muestra preparación e inmovilización en agar, adquisición de imagen digital, análisis digital de imágenes y ejemplos de generación específicos del experimento figura de la resultados del análisis. También hemos incluido un gasoducto de análisis de datos de código abierto para apoyar este protocolo.
El propósito de este método es proporcionar un método bien definido, repetible y parcialmente automatizados para determinar las distribuciones de tamaño y forma de las partículas en biorreactores, especialmente aquellas que contienen los flóculos de lodo activado y gránulos aerobios1 , 2. el fundamento de este método mejorar la accesibilidad, sencillez, rendimiento y repetibilidad de nuestros actuales protocolos internos3,4, facilitar la medición de partículas de otros, facilitar el intercambio y comparación de los datos.
Hay dos categorías generales de análisis de medición de partículas - métodos directo imágenes e inferenciales mediante tales cualidades como la dispersión de la luz5. Aunque métodos inferenciales pueden ser automatizados y tienen gran rendimiento, el equipo es caro. Además, mientras métodos inferenciales pueden determinar con precisión el tamaño equivalente de una partícula6, no proporcionan información de forma detallada7.
Debido a la necesidad de datos de formas, nos hemos basado nuestro método en la proyección de imagen directa. Aunque existen algunos métodos de proyección de imagen de alto rendimiento, ha requerido tradicionalmente caro hardware comercial o soluciones construido8,9. Nuestro método ha sido desarrollado para emplear común y asequible hardware y software que, aunque sufren de una reducción en el rendimiento, produce imágenes de partículas mucho más que el mínimo necesario para muchos análisis10.
No debe especificar los protocolos muestreo importante y los pasos de adquisición de imagen. Otros protocolos pueden especificar pasos manuales que introducen sesgos subjetivos (tales como umbral ad hoc11). Un método bien definido que especifica los pasos de adquisición muestreo, inmovilización e imagen combinados con software de análisis gratuitamente mejorará tanto dentro del laboratorio de imagen análisis y comparaciones entre laboratorios. Un objetivo principal de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo y herramientas que deben conducir a resultados reproducibles de diferentes laboratorios para la misma muestra.
Además de normalizar el proceso de análisis de imagen, los datos producidos por este gasoducto se registran en un archivo bien definidos y bien formateado,12 adecuado para uso popular datos análisis paquetes13,14, experimento de relajación análisis específicos (como la generación de la figura de encargo) y facilitar información entre laboratorios.
Este protocolo se recomienda especialmente para los investigadores que requieren datos de forma de partícula, no tienen acceso a los métodos inferenciales, desea desarrollar su propia tubería de análisis de imagen y desea compartir sus datos fácilmente con otros
1. recolectar muestras para análisis de partículas
2. preparar las placas de agar de partículas teñidas, inmovilizadas
3. adquisición de imágenes de partículas usando un estereomicroscopio y cámara digital
4. medir y analizar las siluetas de la partícula
Archivos generados
El proceso ilustrado en la figura 1 produce dos archivos por imagen analizada. El primer archivo es una coma separa el archivo de texto de valores (CSV) donde cada fila corresponde a una partícula individual y las columnas describen varios indicadores de partículas tales como área, circularidad y solidez y definidos en el manual de ImageJ17. Archivos CSV de ejemplo se incluyen como información complementaria y en el directorio de ejemplos y datos.
Figura 1: Flujo de trabajo gráfico que describe los cuatro pasos principales del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El segundo archivo está diseñado para uso en control de calidad (QC) y es una imagen GIF archivo que sobrepone las partículas originales de imagen con regiones semi opacas que representa identificar, como en la figura 2. La calidad de la identificación de la partícula y segmentación luego puede ser evaluada rápidamente manualmente. Aunque ningún método de umbralización de la partícula es perfecto18, figura 2 se presenta como un ejemplo de un resultado aceptable. Imágenes de mala calidad pueden ser retomados, o si hay datos suficientes, simplemente extraídos de la transformación posterior.
Figura 2: Ejemplo de un gif de Control de calidad (QC), generado por la tubería de análisis de imagen. Ampliación de imagen principal 15 x. Extracto se haga zoom digital para mostrar los números de identificación de las partículas individuales de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Al evaluar imágenes de control de calidad, hay tres errores comunes encontrados:
1. Si no se ajustan exactamente a los límites de partículas
2. falta de identificar las partículas
3. inclusión de artefacto debido a: no partícula componentes (por ejemplo, burbujas), o errores en el umbral
Ejemplos de estos errores se ilustran en la figura 3. Pobre de la partícula límite identificación y segmentación entre partículas a menudo es el resultado de morir demasiado, como se ve en la figura 3a. Iluminación deficiente puede llevar a tanto fracaso para identificar partículas (figura 3b, círculo azul sólida) y artefacto falso (figura 3b, círculo discontinuo rojo). Partícula no importa, como burbujas, hongos, protozoos y metazoos, tales como el tardígrado en figura 3 c también puede identificarse cifra como partículas.
Figura 3: Errores comunes detectados durante el análisis de control de calidad. (a) detección de límite de partículas pobres. (b) partículas espurias (elipse discontinua roja) y no segmentados (elipse azul sólida). (c) extranjeros no partícula objeto. Aumento 15 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Es más fácil rechazar toda la imagen. Sin embargo, es posible utilizar el identificador de partículas en la imagen de control de calidad (figura 2, encarte) para rechazar las partículas individuales. Este enfoque es particularmente útil cuando hay un puñado de temas en una imagen si no útil (como la inclusión de partículas no) c Figura 3. De hacer tan de una manera reproducible y reportable se incluyen ejemplos en el directorio ejemplos/censura del repositorio de github.
Cuando se especifica un diámetro mínimo (< 10 píxeles), ruido de imagen puede identificarse cifra como una partícula. En esos casos, la imagen puede ser todavía ser aceptado una vez más río abajo análisis elimina su presencia. Como pauta, datos de la forma deben tratarse con escepticismo cuando las partículas se componen de menos de ~ 200 píxeles19.
Generación de la figura
Los archivos CSV resultante de los análisis de la imagen son ordenado12 y pueden fácilmente combinar y analizados en el paquete de software recomendado: el investigador (por ejemplo, pandas20 con seaborn21 en Python o dplyr22 con ggplot223 en R). Sin embargo, el tipo de figura exacta requerido necesariamente variará de preguntas de investigación y resultado. Un ejemplo de una posible figura se incluye a continuación (figura 4) y el código correspondiente a la generación de los archivos CSV está disponible en github16.
Figura 4: Ejemplo de figura de experimento específicos generado a partir de datos CSV producidos por la tubería de la imagen. En este ejemplo, la distribución de partículas entre dos reactores experimentales, con el tiempo se muestran y se combina con metadatos cualitativas observadas por el investigador. Ver ejemplos/figuras/R para la generación de código y datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aunque el sistema de análisis de imagen es bastante robusto y pasos de control de calidad se toman para asegurar imágenes pobres se retiran, la atención adecuada a problemas específicos en la adquisición de la imagen, muestreo y preparación de las placas puede mejorar tanto la precisión de los datos y la proporción de imágenes pasando del control de calidad.
Concentración de muestras
Suponiendo que se ha tomado una muestra representativa, es el paso más importante asegurar que suficientes partículas están presentes para representante9 y análisis eficiente aunque no tan concentradas que las partículas se superponen.
Esto ha correspondido a aproximadamente 0.5 a 2 mL de licor mezcla sobre una amplia gama de sólidos suspendidos totales y específicos del experimento de determinación puede ser necesaria. Ejemplos de demasiado concentrado, demasiado - diluyen, y las concentraciones de partículas correspondientes se muestran en la figura 5 como una referencia. La coloración también es afectada por la concentración de partículas. Dilución excesiva puede resultar en partículas excesivamente manchadas, borrosas mientras que debajo-dilución no puede producir partículas con suficiente contraste de umbral óptimo.
Figura 5: Referencia de imágenes mostrando concentraciones de partículas que son demasiado concentrado, aceptable y demasiado diluido. Aumento 15 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Concentración de colorante
La cantidad de colorante añadido a la muestra es crucial y la cantidad correcta puede variar entre lodos. Aproximadamente 5 μl de azul de metileno 1% (p/v) por 0.5 a 2 mL de la muestra proporciona suficiente contraste para umbral sin causar 'sangrado' y oscurecimiento de la forma de la partícula.
No hay solo concentración ideal; debe elegirse un balance entre el contraste y la claridad. La figura 6 ilustra esta compensación en tres muestras teñidas con 5, 25 y 50 μl de azul de metileno 1% por cada 2 mL de lodo. Cuando este equilibrio de peso, la partícula mal contraste ocasional (Figura 6a) se prefiere sobre mal solución gotas (figura 6 c).
Figura 6: Manchas de mayor concentración mejora el contraste de la partícula, pero también distorsiona el límite observado. Aumento 15 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Almacenamiento de la placa
Después de la inmovilización, las placas pueden almacenarse bajo refrigeración (4 ° C) durante al menos 3 días. Se trata de un período conservador, durante el cual es probable que se presente contaminación de difusión del crecimiento y del tinte. Las placas no muestra ninguna de las cuestiones que se describen a continuación pueden ser reflejadas todavía después de 3 días. Cuando se almacena durante demasiado tiempo, partículas existentes pueden seguir creciendo y va aparecer en el plano focal de otras partículas conservando la tonalidad de la mancha, como puede verse en la Figura 7a. Contaminantes de la superficie, como las esporas de hongos, también pueden crecer después de largos períodos de almacenamiento. Estos generalmente no tomará el color de la mancha y aparecen en un plano focal diferente, como puede verse en la figura 7b. En algunos casos, es confuso si se ha producido crecimiento excesivo o difusión de la mancha, como en la parte inferior de la figura 7b y centro de la Figura 7c. Independientemente de la causa, manchas como las que indican que la placa ha envejecido más allá de su vida útil
Figura 7: Imágenes de referencia que ilustra el crecimiento excesivo de señalización que se ha almacenado una placa más allá de su vida útil. Aumento 15 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Preparación de las placas
Hay dos problemas asociados con la preparación física de las placas de agar - agar demasiado espesa y excesiva agitación. En el primer caso (figura 8), las partículas a ser suspendidas en varias profundidades, dificultando la adquisición de imágenes con la mayoría de las partículas en foco.
Figura 8: Usar cantidades excesivas de agar producirá una muestra más gruesa que el plano focal, resultando en partículas borrosas. Aumento 15 x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En el segundo caso, se arremolinan produce una distribución no uniforme de las partículas (Figura 9a), sesgar los resultados de las diferentes secciones de la placa (Figura 9b, c. Generalmente, no más de 7 mL de agar es necesaria para cubrir un plato de Petri de 100 mm y sólo movimientos de la mano suave se necesitan para cubrir uniformemente el plato.
Figura 9: Agitación demasiado vigorosa durante la preparación de las placas aparecerá como no uniforme distribución de partículas (una), las secciones de la placa más grande (b) y distribución de partículas más pequeñas (c) de polarización. Placa de 100 mm de diámetro, micrografías magnificado x 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La proyección de imagen microscópica
Hay dos temas de adquisición de imagen principales que afectan a la calidad. La primera cuestión es asegurar que la mayoría de las partículas son en el plano focal. Incluso en la ampliación baja, el tamaño de muchas partículas de lodo activado es tal que sin ajustes menores a macrométrica, muchas partículas será ligeramente fuera de foco, introducir medida inexacta de la partícula. Ninguna imagen contendrá partículas 100% perfectamente centrado; Figura 8 y figura 5b son ejemplos respectivos de foco aceptable y pobre.
Los niveles de exposición constituyen la segunda cuestión importante. Mal expuestos resultan imágenes en pérdida de datos y segmentación pobres11. Además, el alto contraste de colorante puede producir un histograma estrecho, reducir el rango dinámico efectivo de los datos. Los límites superiores e inferiores del histograma pueden ajustarse antes de capturar una imagen para evitar la exposición de los pobres y aumentar el rango dinámico. Ejemplos de sobre, debajo y aceptable exposiciones se incluyen a continuación en la figura 10.
Figura 10: Imágenes de referencia que muestran exposiciones de imagen mala y aceptable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ventajas de este método están que proporciona criterios específicos que abarca todo el proceso. Además, hemos incluido una tubería software facilitando el análisis en el laboratorio y la promoción de datos comparables entre lab. La principal limitación de este método es que el requisito de mantener todas las partículas se centró impide grandes aumentos, limitando su utilidad para las partículas con dimensiones menores pequeñas - en particular las estructuras filamentosas. Direcciones futuras de este método pueden incorporar técnicas de análisis de imágenes avanzado (específicamente de24,de reducción de ruido25, proyección de imagen de alto rango dinámico, enfoque apilamiento26,27y aprender de máquina asistida por umbralización, segmentación y clasificación28. La mejora de adquisición de imagen principales incorpora software para controlar las etapas mecánicas8 y producir archivos de mosaico 'placa entera'.
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue financiado por una subvención de la nacional Science Foundation CBET 1336544.
Los logotipos de FIJI, R y Python se utilizan con el de acuerdo con las siguientes políticas de marca registrada:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , según la licencia CC-BY-SA 4.0 en: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
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