利用开源软件管道测量琼脂中固定活性污泥颗粒的形状和大小

活性污泥中颗粒的大小和形状是用不同方法测量的重要参数。不具有代表性的采样、次优图像和主观分析参数产生了不准确之处。为了最大限度地减少这些错误并便于测量, 我们提供了一个协议, 指定每个步骤, 包括开源软件管道。

实验生物反应器, 如处理废水的生物反应器, 含有其大小和形状是重要参数的颗粒。例如, 活性污泥絮凝剂的大小和形状可以指示微尺度上的条件, 也直接影响污泥在澄清器中的沉降情况。

粒子大小和形状都是错误的 "简单" 测量。在采样、成像和分析粒子时, 可能会出现许多微妙的问题, 这些问题通常在非正式协议中没有得到解决。采样方法可能有偏差或没有提供足够的统计能力。样品本身可能保存不良或在固定过程中发生改变。图像的质量可能不够;重叠粒子、景深、放大倍率和各种噪声都会产生较差的结果。不明确的分析可能会引入偏差, 例如通过手动图像阈值和分割产生的偏差。

除了可重复性之外, 可负担性和吞吐量也是可取的。一种经济实惠、高吞吐量的方法可以实现更频繁的颗粒测量, 从而产生许多包含数千个粒子的图像。一种使用廉价试剂、通用解剖显微镜和自由可用的开源分析软件的方法允许可重复、可访问、可重复和部分自动化的实验结果。此外, 这种方法的产品可以格式良好, 定义明确, 易于理解的数据分析软件, 方便实验室内分析和实验室之间的数据共享。

我们提出了一个协议, 详细介绍了生产此类产品所需的步骤, 包括: 采样、样品制备和琼脂固定、数字图像采集、数字图像分析, 以及来自分析结果。我们还包括了一个开源数据分析管道来支持这一协议。

该方法的目的是提供一种明确定义的、可重复的和部分自动化的方法, 用于确定生物反应器中颗粒的大小和形状分布, 特别是那些含有活性污泥絮凝剂和好氧颗粒^{的生物反应器中颗粒的}大小和形状分布1^,2. 这种方法背后的理由是提高我们现有的内部协议^3、4 的可负担性、简单性、吞吐量和可重复性, 方便为他人测量颗粒, 并促进共享和数据的比较。

粒子测量分析有两大类--直接成像和使用光散射⁵等特性的推理方法。虽然推理方法可以自动化, 并且具有较大的吞吐量, 但设备成本很高。此外, 虽然推理方法可以准确地确定粒子⁶的等效大小, 但它们没有提供详细的形状信息⁷。

由于需要形状数据, 我们的方法基于直接成像。虽然存在一些高通量的成像方法, 但它们传统上需要昂贵的商业硬件或自定义构建的解决方案^8,9。我们的方法是为了使用通用的、经济实惠的硬件和软件, 这些硬件和软件虽然吞吐量减少, 但产生的粒子图像远远超过许多分析10所需的最小值^.

现有协议可能没有指定重要的采样和图像采集步骤。其他协议可以指定引入主观偏差的手动步骤 (如临时阈值¹¹)。一个明确定义的方法, 指定采样, 固定和图像采集步骤结合免费提供的分析软件将加强实验室内的图像分析和实验室之间的比较。该协议的一个主要目标是提供一个工作流和工具, 该工作流和工具应能为同一样本带来来自不同实验室的可重现结果。

除了对图像分析过程进行规范化外, 此管道生成的数据还记录在一个定义明确、格式良好的文件¹²中, 适合流行的数据分析包^13、14、缓动实验使用特定分析 (如自定义图形生成), 并促进实验室之间的数据共享。

该协议特别适用于需要颗粒形状数据、无法获得推理方法、不希望开发自己的图像分析管道、希望与他人轻松共享数据的研究人员

1. 收集样品进行颗粒分析

1. 确定特定反应器的样品体积, 这些颗粒将产生足够的颗粒用于统计分析¹⁰ (& gt;500), 同时避免颗粒重叠。
   1. 假设每个混合液样品的范围为0.5 至2毫升, 足以用于混合液悬浮固体 (mlss) 在250至 5, 000 mg/l 之间的活性污泥样品。
   2. 否则, 请使用0.5、2和 5 ml 样品 (步骤1.2 至 2.7) 制备三个测试琼脂板。
   3. 直观地估计哪些 (如果有) 样本量最符合步骤1.1 中列出的条件。
   4. 如果 0.5 ml 样品的颗粒仍然重叠, 重复步骤 1.1.2, 并1.1.3 三个 0.5 ml 样品, 再稀释 0.5 ml 的磷酸盐缓冲盐水, 以确定 0.5 ml 样品必须在步骤2.1 之前稀释的程度。
      注: 步骤 1.1 1.1.4 每次实验只需执行一次, 或者如果反应器内容发生变化, 后续测量不再符合步骤1.1 中列出的标准。
2. 从反应器的混合良好的部分获得具有代表性的样品, 方法是在烧杯或50毫升离心管中抓取 ~ 40 ml, 轻轻混合, 并立即将混合良好的抓取的确定样品体积浇注到15毫升的离心管中。根据1.1.4 的步骤确定, 必要时稀释样品。
   注: 协议可以在此暂停, 样品可以在制冷 (4°c) 下存储长达48小时。不要冻结样品。
   注意: 常见的保存介质 (如甲醛/甲酰胺) 不合适。板的大表面积, 加上开放容器, 来自光源的热量, 以及潜在的通风不良的显微镜设置产生不必要的危险条件, 几乎没有提高图像质量。

2. 准备被染色的固定化颗粒的琼脂板

1. 在每个样品中加入5μl 的 1% (w/v) 亚甲蓝, 然后盖上盖子, 轻轻反转至少3次。在室温下, 样品染色至少 5分钟, 但不超过30分钟。
2. 在去离子水中制备约10毫升的每样品 7.5% (w v) 琼脂。
   注: 如果灭菌, 琼脂可能会提前生产并无限期储存。琼脂糖可以被替换, 但不会显著改善图像。
3. 使用微波炉或水浴融化琼脂, 使用前可以稍微冷却。确保琼脂完全融化, 容易倒。琼脂的固体球体会有不同的染色, 产生质量差的图像。
4. 将足够的琼脂转移到离心管中, 使导管总体积达到 6.5 ~ 9 毫升之间。
5. 重新安装离心管, 轻轻反转至少3次混合。
6. 当把帽子指向远离自己或在引擎盖时, 打开帽子。将管内装物倒进100毫米塑料培养皿中, 同时轻轻摇晃盘中, 以实现充分、光滑的涂层和视觉上均匀的颗粒分布。
   注意: 琼脂产生的热量可能会在管内产生轻微的超压。这往往会产生一个可听到的嘶嘶声, 并有可能驱逐小液滴的热琼脂。
7. 让盘子在室温下冷却至少 5分钟, 直到琼脂凝固。
   注: 协议可能会在此处暂停。将镀存在倒置并密封 (例如, 在密封塑料袋或石蜡膜中) 可在冷藏 (4°c) 下存放长达48小时。

3. 使用立体显微镜和数码相机获取粒子图像

1. 将未覆盖的板朝上放置在能够放大10倍至20x 的立体显微镜的显微镜舞台上。使用 led 照明支架或灯板等设备, 用均匀的漫射光照亮样品。
2. 打开图像捕获软件, 确保显微镜光路设置为"照片", 然后从相机列表中单击相应的相机。
3. 调整显微镜, 使多个粒子出现在具有大的、定义明确的边缘的焦平面上的软件中。使用10-20x 的放大倍率测量粒子, 同时保持相对较深的焦面。
   1. 暂时取下琼脂板, 将千分尺放置在舞台上。调整精细对焦, 直到千分尺上的刻度在图像捕获软件中出现急剧对焦。
   2. 如果以前未校准, 请记录当前放大倍率的像素与微比率。
      1. 通过单击 "缩放 > 实际大小" 将缩放设置为 100%, 然后选择"选项 > 校准",然后沿千分尺长轴对齐主视口中的红色校准条, 垂直条的中心位置为0和200μm 刻度。在 "校准" 对话框中, 输入当前放大级别和200微米的实际长度。
   3. 如果已校准, 请从菜单栏中选择"放大倍率", 然后选择当前放大级别并确认校准。
      1. 选择 "测量 >" 线 ">" 任意行"。单击千分尺的0刻度和长轴的交点。再次单击200处的交叉点和长轴。正确的校准应显示大约 200μm. 通过单击该行, 按下删除, 然后在确认框上按"是", 将其删除。
         注: 所提供的相机和校准说明特定于此硬件使用的软件。其他成像软件中也应提供类似的功能。目标是确定图像的像素与微米的比率, 以实现精确的粒径测量。
4. 更换琼脂板并调整精细对焦, 以实现成像软件中的最大细节。
5. 调整成像软件, 以实现最大的图像质量。
   1. 通过在"相机" 边栏的"位深度" 面板中选择单选按钮, 将位深度增加到允许的最大值。通过在 "相机" 边栏的color-grae 面板中选择相应的单选按钮, 设置软件以获取灰度图像。
   2. 折叠曝光和直方图之间的任何开放侧边板。将增益减少到 1.0, 并增加曝光, 直到清晰的图像出现在视口中, 直到直方图显示为不被直方图框的任一端裁剪的分布。
   3. 调整直方图, 避免过度和不足曝光。在相机侧栏的直方图面板中, 将直方图的左边界滑动到最低值之外, 向右边界滑动到最高值之外。
6. 将图像另存为未压缩的 tiff, 包括图像元数据中的放大信息, 使用"文件 > 另存为" 对话框, 选择 tiff 格式, 并确保 "使用校准保存" 信息框已选中。
   注: 保存图像元数据 (包括空间校准) 可能因采集程序而异。fiji¹⁵是管道使用的基础软件, 它了解最常见的变体。要记录的重要信息是像素高度、宽度和关联的单位。
7. 使用移动阶段或手动移动板本身, 选择另一个区域, 该区域不与以前的图像重叠, 遵循在从左到右到左移动时在面板上移动时交替出现的路径;也被称为 "割草机搜索模式"。重复步骤 3.6, 直到产生足够的图像来捕获至少500个视觉估计的粒子, 更多的是更好的。
   注: 替代模式 (例如,圆形、随机) 是可以接受的, 但应该报告。通过数字拼接将多个重叠图像提取为马赛克组合会产生所产生的文件大小, 这极大地阻碍了下游处理和工件拼接, 目前不建议使用。
8. 保留板, 直到图像分析后, 潜在的后续成像。在最后成像后, 丢弃适当的生物废物。

4. 测量和分析颗粒轮廓

1. 安装所需的图像分析软件包
   1. 按照以下说明安装 fiji (国家卫生研究院 imagej v1.52 e 的增强版: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. 安装 git (如果尚未存在), 请按照以下说明进行操作: https://git-scm.com/downloads
   3. 通过克隆 git 存储库¹⁶获取粒子分析代码。
      1. 在命令行中, 通过键入以下内容来检索代码的最新版本:
         git 克隆 https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. 按照克隆存储库的顶级目录中的 readme. md 文本文件中的说明安装分析代码。
            注: 最好使用 git, 因为它会自动检索最新版本的代码。如果 git 不可用, 也可以在发布页面上下载代码作为 zip 文件: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. 编辑列出要处理的目录以及可选参数的文本文件。有关参数和示例的列表, 请参阅示例分析子目录。
2. 通过键入以下命令行运行分析:
   < fijpath > \ imagej-win64--控制台-宏 spmoria-sludgeet幽灵 _ 形态学 _ image _ 分析 < 参数文件 >
   其中 < fiji 路径 > 是 imagej-win64. exe 所在的目录, 并 < 参数文件 > 描述分析设置的文本文件的位置
   注: 可执行文件的名称可能会有所不同, 具体取决于安装在哪个操作系统的 fiji。根据图像的数量和大小, 分析可能需要几分钟到几小时的时间, 并将自动运行。
3. 执行质量控制检查
   1. 检查位于指定输出目录的覆盖子目录中的质量控制文件。注意具有虚假、错过和捕获不良的粒子的图像, 这些粒子都明显为与背景不匹配的阴影轮廓。有关此类示例, 请参见图 3 。粒子数据现在已准备好进行实验特定的分析图生成。
4. 通过在分析代码中指定要忽略的已记下的文件和/或粒子 id, 拒绝整个板或单个粒子。有关 r 和 python 代码, 请参阅存储库中的示例审查。
5. 使用每个图像的图像分析结果生成特定于实验的图形, 存储在指定输出目录的结果子目录中的 tidy¹²逗号分隔文本文件中。有关如何读取结果文件的示例, 请参阅示例/figuresr 和示例/figures/python 子目录。

生成的文件
图 1所示的过程将在分析的每个图像中生成两个文件。第一个文件是一个逗号分隔值 (csv) 文本文件, 其中每一行对应于单个粒子, 列描述各种粒子度量, 如面积、循环和固体, 并在 imagej 手册¹⁷中定义。示例 csv 文件作为补充信息和示例数据目录中包含。

图 1:描述协议四个主要步骤的图形工作流。请点击这里查看此图的较大版本.

第二个文件用于质量控制 (qc), 是 gif 图像文件, 它将原始图像覆盖为表示已识别粒子的半不透明区域, 如图 2所示。然后可以快速手动评估粒子识别和分割的质量。虽然没有粒子阈值法是^{完美的 18},但图 2是一个可接受结果的例子。质量差的图像可以重新拍摄, 或者在有足够数据的情况下, 简单地从进一步处理中删除。

图 2:由图像分析管道生成的质量控制 (qc) gif 示例。主图像的放大倍率15x。摘录以数字方式进行缩放, 以显示标识图像中单个粒子的数字。请点击这里查看此图的较大版本.

在评估 qc 图像时, 发现了三个常见错误:
1. 未能准确地符合粒子边界
2. 未能识别颗粒
3. 由于: 非粒子成分 (例如气泡) 或阈值错误而导致的工件包含

这些错误的示例如图 3所示。粒子之间的粒子边界识别和分割不良通常是过度死亡的结果, 如图3a 所示。光照不良可能导致无法识别粒子 (图 3b, 蓝色固体圆) 和人工制品假粒子 (图 3b, 红色虚线圆)。非颗粒物质, 如气泡、原生动物、真菌和元氮类, 如图 3c中的迟发性分级, 也可以被紧急识别为颗粒。

图 3:在质量控制分析过程中检测到常见错误。(a) 粒子边界检测不良。(b) 虚假粒子 (红色虚线椭圆) 和未分割粒子 (蓝色固体椭圆)。(c) 外国非粒子物体。放大 15 x。请点击这里查看此图的较大版本.

拒绝整个图像是最容易的。但是, 可以使用 qc 图像中的粒子标识符 (图 2, 插入) 来拒绝单个粒子。当一个原本有用的图像中存在少量问题 (如包含非粒子) 时, 这种方法特别有用. github 存储库的示例审查目录中包含了以可重现和可报告的方式执行此操作的示例。

当指定一个小的最小直径 (和 lt;10 像素) 时, 图像噪声可能会被预先识别为粒子。在这些情况下, 当进一步的下游分析被删除图像的存在时, 图像仍可能被接受。作为指导原则, 当粒子由小于 ~ 200 像素¹⁹组成时, 应以怀疑的态度对待形状数据。

图生成
图像分析产生的 csv 文件是 tidy¹² , 可以很容易地在研究人员的首选软件包中组合和分析 (例如, 在 python 或 dplyr²²与 gplot2 中的熊猫²⁰与 seaborn ²¹在 r)。然而, 所需的确切数字类型必然会随着研究问题和结果的不同而不同。下面列出了一个可能的数字示例 (图 4), github 16 上提供了从 csv 文件生成该数字的相应代码。

图 4:由图像管道生成的 csv 数据生成的实验特定图形示例。在本例中, 显示了两个实验反应器之间随着时间的推移的粒子分布, 并将其与研究人员注意到的定性元数据结合起来。有关生成代码和数据, 请参见示例/图。请点击这里查看此图的较大版本.

虽然图像分析系统相当强大, 并采取了 qc 步骤, 以确保不良图像被删除, 但适当注意采样、制版和图像采集中的具体问题可以提高数据的准确性和图像的比例。图像通过 qc。

采样浓度
假设已采取具有代表性的样品, 最重要的步骤是确保有足够的粒子存在于具有代表性^{的 9}和高效的分析中, 同时不会使粒子重叠。

这相当于在广泛的总悬浮固体范围内的约0.5 至2毫升混合液, 但可能需要进行实验特定的测定。图 5显示了过度浓缩、过度稀释和适当颗粒浓度的示例, 作为参考。染色也会受到颗粒浓度的影响。过度稀释会导致颗粒过度染色、模糊, 而稀释后可能不会产生具有足够对比度的颗粒, 从而获得最佳的阈值。

图 5:显示颗粒浓度过高、可接受和过度稀释的参考图像。放大 15 x。请点击这里查看此图的较大版本.

染料浓度
添加到样品中的染色量至关重要, 正确的量可能因污泥而异。大约5μl 的 1% (w/v) 亚甲蓝每0.5 至2毫升的样品提供足够的对比度, 而不会造成 "出血" 和模糊颗粒的形状。

没有单一的理想浓度;必须在对比度和清晰度之间找到平衡。图 6说明了在三个样品中, 每2毫升污泥中, 每2毫升的污泥中, 每2毫升的二甲苯蓝色为5、25和50μl。在权衡这种权衡时, 偶尔对比不良的粒子 (图 6a) 优先于可解析性差的 blobs (图 6a)。

图 6:染色浓度的增加提高了颗粒的对比度, 但也扭曲了观察到的边界。放大 15 x。请点击这里查看此图的较大版本.

板材储存
固定化后, 板材可在制冷 (4°c) 下存放至少3天。这是一个保守的时期, 在这期间, 不太可能发生污染生长和染料扩散。未显示下面描述的任何问题的板材仍可能在3天后映像。如果储存时间过长, 现有颗粒可能会继续生长, 并将出现在其他粒子的焦平面中, 同时保留污渍的色调, 如图7a 所示。表面污染物, 如真菌孢子, 也可能在长时间储存后生长。这些通常不会占据污渍的颜色, 并将出现在不同的焦平面上, 如图7b 所示。在某些情况下, 尚不清楚是否发生了污渍的过度生长或扩散, 例如在图 7b的底部和图 7b的中心。不管是什么原因, 像这样的斑点表明盘子已经老化到了有用的寿命之外

图 7:显示过度生长信号的参考图像, 表明一个板块已被存储超过其使用寿命。放大 15 x。请点击这里查看此图的较大版本.

板材制备
有两个问题与身体准备琼脂板相关--过度厚的琼脂和过度的旋转。在第一种情况下 (图 8), 粒子在不同深度悬浮, 因此很难获得大多数粒子处于焦点的图像。

图 8:使用过多的琼脂会产生比焦平面厚的样品, 从而产生模糊的粒子。放大 15 x。请点击这里查看此图的较大版本.

在第二种情况下, 旋流产生粒子的不均匀分布 (图 9a), 偏置结果来自板的不同部分 (图 9a, c。一般情况下, 不需要超过7毫升的琼脂覆盖100毫米培养皿, 只需要温和的手部动作, 以均匀地覆盖菜。

图 9:在板材制备过程中, 超强的旋流将表现为非均匀颗粒分布 (a), 与较大 (b) 和更小 (c) 颗粒分布的偏置部分。板材直径为100毫米, 缩微图放大15x。请点击这里查看此图的较大版本.

显微成像
影响质量的图像采集主要有两个问题。第一个问题是确保大多数粒子在焦平面上。即使在低放大倍率下, 许多活性污泥颗粒的大小也是如此, 如果不对粗聚焦稍作调整, 许多颗粒也会稍微失去焦距, 从而引入不准确的颗粒测量。任何图像都不会包含100% 完美聚焦的粒子;图 8和图 5b分别是重点不佳和可接受的示例。

接触水平是第二个主要问题。曝光不良的图像会导致数据丢失和分割不良 11。此外, 染料的高对比度可以产生狭窄的直方图, 降低数据的有效动态范围。直方图的上限和下限可以在捕捉图像之前进行调整, 以防止曝光不良并增加动态范围。图 10中列出了过度、不足和可接受的暴露的示例。

图 10:显示较差和可接受的图像曝光的参考图像。请点击这里查看此图的较大版本.

这种方法的优点是它提供了涵盖整个过程的具体标准。此外, 我们还提供了一个软件管道, 通过实验室内的分析来简化分析, 并推广实验室之间的可比数据。这种方法的主要局限性在于, 要求保持所有粒子聚焦可防止高放大倍率, 从而限制其对小尺寸 (尤其是丝状结构) 的颗粒的使用。该方法的未来方向可以包括先进的图像分析技术 (特别是降^{噪 24、25}、高动态范围成像^{、对焦堆叠 26、27}和机器学习)辅助阈值、分割和分类²⁸。主要的图像采集改进将包括软件来控制机械阶段⁸和生产 ' 全板 ' 马赛克档案。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了国家科学基金会 cbet 1336544 的赠款的支持。

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