Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 31400936, 31460260) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Jiangxi Provinz in China (20171BAB215020). Wir danken auch das gemeinsame Programm zwischen Nanchang University und Queen Mary University of London für diese Arbeit zu unterstützen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschuss von Nanchang University genehmigt.
1. Montieren Sie das Gerät und schließen Sie das Mikrotom
<ol><li>Entwerfen Sie den Parameter gemäß den Anforderungen (ergänzende Abbildung 1).</li>
	<li>Einreichen des Parameters zu einer Fabrik zur Herstellung von Acryl-Boards.</li>
	<li>Montieren Sie alle Teile in der Reihenfolge: Verwenden Sie Chloroform, um 7 gewerbliche Acryl Boards in einen Tank mit einem Abschnitt Kanal und Wasser Bad (Abbildung 1) zu kombinieren. Achtung: Chloroform produziert giftige Substanzen trifft es Licht und Sauerstoff. Montieren Sie das Gerät in einer Dampfhaube.</li>
	<li>Installieren Sie die röhrenförmigen elektrisches Heizelement durch das Loch in Acryl Board #1 (Abbildung 2A, Pfeilspitze).</li>
	<li>Um die Temperatur-Controller zu installieren, erstellen Sie ein kleines Loch auf der #2 Acryl Board mit einer elektrischen Bohrmaschine, und installieren Sie den Temperatur-Detektor (Abbildung 2A, Pfeil). Installieren Sie ein digitales Thermostat auf dem Tank (Abbildung 2A). Hinweis: Die Temperatur-Detektor sollte innerhalb 1 cm unterhalb der Wasseroberfläche liegen.</li>
	<li>Um Kraft zugreifen, passen Sie die Spannung unter 24 V bevor Sie das Gerät einschalten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Schnittabfallwanne aus Mikrotom.</li>
	<li>Verknüpfen Sie die Abschnitte-Kanal mit dem Mikrotom-Klingenhalter mit neutraler Silikondichtstoff (Abb. 2 b). Hinweis: Schmieren Sie jede neutrale Silikon-Dichtstoff über der Spitze des Messers nicht, so dass die alte Klinge leicht ersetzt wird.</li>
	<li>Trocknen Sie über Nacht um die Chloroform und neutral Silikon-Dichtstoff Zeit zu erstarren lassen.</li>
	<li>Installieren Sie die Klinge auf der Klingenhalter. Gießen Sie Wasser in das Wasserbad (Abbildung 2). Die Wasseroberfläche sollte nur den oberen Bereich des Blatts (Abb. 2D, Pfeilspitze) berühren.</li>
</ol>(2) Paraffin-Schnitt
Hinweis: Trümmer oft an den oberen oder unteren Kanten des Wachs-Blocks und der Wasseroberfläche ansammeln. Diese Ablagerungen sollten regelmäßig gelöscht werden.
<ol><li>
Durchführen Sie herkömmliche Paraffin10-Schnitt.
	<ol>
<li>Klemmen Sie das Paraffin-eingebetteten Exemplar auf einer rotierenden Mikrotom und setzen Sie das Messer in einem Messerhalter.</li>
		<li>Drehen Sie das Handrad und Abschnitt der Probekörpers.</li>
		<li>Übertragen Sie das Paraffin geschnittene Band auf 38,5 ° C warmen Wasserbad.</li>
		<li>Holen Sie ab, die in den Abschnitten auf das Mikroskop von der Wasseroberfläche nach Entfaltung zu schieben.</li>
		<li>Trocknen Sie die Folien in einem Ofen bei 42 ° C über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verbesserte Paraffin-Schnitt (Abb. 3)
	<ol>
<li>Schliessen Sie das Gerät.</li>
		<li>Öffnen Sie das Heizgerät mit Temperaturschalter Erkennung und stellen Sie gezielte Temperatur zwischen 38,0 ° C bis 40,0 ° C für 1 h im voraus, um das Wasser warm ein.</li>
		<li>Ändern Sie den paraffinblock erworben durch das Paraffin einbetten; dann das Mikrotom Kassette Klemme der paraffinblock aufsetzen und einrasten. Hinweis: Die superior und inferior Grenzen der paraffinblock sollten horizontal geändert werden, um zu verhindern, dass die Abschnitt Multifunktionsleiste aus bilden einen Bogen und nicht mehr durch den schmalen Abschnitten Kanal fließen.</li>
		<li>Schnell Ansatz der Probenmaterials durch Schneiden dicker Abschnitte.</li>
		<li>Passen Sie auf eine geeignete Schnittdicke (10 µm Erwachsener Mäuse Köpfe, Erwachsenen Maus Nieren und Embryo mäusegehirnen, 4 µm für Zebrafisch Augen). Drehen Sie das Handrad und die Abschnitten treten automatisch die Abschnitte Kanal und Bad.</li>
		<li>Abschnitt der Probe in eine langsame und gleichmäßige schneiden Schlaganfall (Abb. 3A). Hinweis: Thethickness des ersten Abschnitts wird geändert werden, nachdem das Handrad für ein paar Minuten gestoppt wurde. Die klingen sollten ersetzt werden, wenn die Abschnitte in Folge Kratzer haben.</li>
		<li>Führen Sie die Abschnitte in die Badewanne Kammer in einer Linie (Abb. 3 b, 3 C) zu schweben. Hinweis: Wenn das Kopfteil an der Kammerwand hält, verwenden Sie eine Bürste Anleitung schwimmend weiterhin.</li>
		<li>Abschnitte auf Objektträger zu halten. Entfalten Sie nach den Abschnitten voll im Wasserbad, separate mehrere Abschnitte mit einer Pinzette. Dann holen sie aus dem Wasserbad auf den Objektträger (Abbildung 3D). Hinweis: Abschnitte sollten aus dem Hinterteil des Wasserbades, abgeholt werden wie in den Abschnitten-Kanal und der vorderen des Wasserbades noch nicht voll entfaltet werden.</li>
		<li>Trocknen Sie die Folien werden, indem sie in einem 42 ° C Ofen über Nacht. Die Folien können dann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie Färbung Hämatoxylin-Eosin (HE) aus Gründen der Bewertung der verbesserten Methode8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography.">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+printing:+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering.">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosectioning+tissues.">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li><li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning.">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li><li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks.">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li><li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+zebrafish+histology.">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li><li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid-Cut:+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples.">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles.">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis.">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies.">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus.">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).</li><li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples.">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets.">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben ein Patent auf dieses Gerät und keine Interessenskonflikte zu erklären.

Zur Verbesserung von Paraffin Abschnitt Morphologie und lösen das Problem der verschwendete Zeit während konventioneller Paraffin-Schnitt, haben wir eine verbesserte Paraffin-Schnitt-Methode, die schneiden und Entfaltung verbindet. Diese verbesserte Methode beruht auf einfache Geräte, die einen Abschnitt-Kanal, ein Wasserbad und eine Heizung mit Erkennung Temperaturschalter umfasst. Der Abschnitt Band betritt das Wasserbad durch den Abschnitt Kanal und entfaltet sich automatisch beim Schneiden. Daher verbessert diese Methode Paraffin Schnitt, Qualität und Effizienz, die durch Paraffin-Schnitt der Erwachsenen Maus Hippocampus, Erwachsenen Maus Nieren, E15.5 mäusegehirnen und Erwachsenen Zebrafisch Augen geprüft wurden.
Zur Vermeidung von Sektion Eisstockschießen bei konventioneller Paraffin-Schnitt wurden viele Anpassungen vorgenommen wie Befeuchtung der Gewebeoberfläche, Kühlung des Wachs-Blocks, erhöhen die Luftfeuchtigkeit und kombiniert Kryoschneiden6,7, 8; aber machen diese Anpassungen Paraffin-Schnitt langweiliger. Eine Handelsabteilung-Transfer-System stützt sich auf flüssige Wasser ist erfolgreicher gewesen. In diesem System im Abschnitt Kontakte der Wasseroberfläche sofort nach dem Schneiden und Elektromotor angetriebene Wasserstrom überträgt die Abschnitte aus dem Klingenhalter mit dem niedrigeren Warmwasser Bad9. Statische Elektrizität hemmt durch seine Mechanismus nicht, die schneiden, wodurch verbesserte Schnittqualität. Zusätzlich, da dieses System manuell Abschnitte aus dem Klingenhalter auf dem Wasserbad übertragen vermeidet, hilft leicht zerbrechliche Teile beschädigen es auch beim Erwerb von qualitativ hochwertigen dünneren Bereiche.
Mit unserer verbesserten Methode zeichnet die einfache Ausstattung auf die Erfahrung des Transfersystems Handelsabteilung mit einigen Vorteilen. Erstens ist die Ausrüstung billiger, die könnte diese Methode in den Labors in Entwicklungsregionen zu popularisieren und die Handelsabteilung-Transfer-System ergänzen kann. Zweitens: das Wasser im Gerät ist statisch und niemals stört die Abschnitte, die es ermöglichen, die dünneren Bereiche erwerben. Wir nacheinander geschnittene Zebrafisch Augen 2 µm Dicke mit der verbesserten Methode, und die erworbene Abschnitte waren von höherer Qualität. Drittens dient ein größeren Wassertank Bad in der Ausstattung, die erlaubt mindestens 40 Abschnitte zu entfalten und gleichzeitig zu schweben, so dass zwei Betreiber kooperieren. Eine Person kann die Gewebeprobe kontinuierlich geschnitten und zum anderen kann direkt in den Abschnitten angelt. Dies reduziert die Wartezeit für die Abschnitte zu entfalten. Aufeinander folgenden Schneiden mit einem einheitlichen Schnitt verbessert auch die Schnittqualität.
Die Struktur und das Aussehen unserer einfachen Ausrüstung erfordert Verbesserung. Beispielsweise können die Komponenten wie die Kraft, eine Heizung und ein Temperaturregler integriert werden, um dieses Gerät integraler und tragbar zu machen. Darüber hinaus haben kommerzielle rotary Mikrotome verschiedene Größen. Zum Herstellen einer anderen Mikrotome sollte den Winkel und die Höhe dieser Geräte angepasst werden. Paraffin-Schnitt in Kombination mit anderen Verfahren der molekularen ist Neurobiologie, Morphologie der Gewebe und andere Forschung Felder11,12,13verbreitet. Diese Methode kann möglicherweise, klinische Untersuchung Effizienz14,15 und anderen biologischen Proben jenseits der drei Gewebetypen, die hier verwendeten verbessern.

Morphologische Studie ist wichtig in der biologischen Forschung. Obwohl neuer Technologie Forscher beobachten ihre Ziele direkt aus dem gesamten Gewebe oder Organismen1,2,3, schneiden die Probe in Dünnschliffen, gefolgt von Färbung erlaubt hat, bleibt die primäre Methode Fornot nur Gewebe Morphologie, sondern auch Protein targeting direkt im Gewebe. Lichtmikroskopie verwendet drei Schnitttypen: Paraffin, gefrorene und Ansät. Obwohl Kryoschneiden üblich ist, dass Gewebe Antigenität zu schützen und die Probenvorbereitung einfach ist, ist die einbehaltene Gewebe Morphologie Arm und ungeeignet für dünne Stationspunkte4,5. Paraffin-Schnitt ist die am häufigsten verwendeten Methode für die Ausstellung von gut erhaltenen Morphologie. Die Exemplare sind völlig dehydriert und in Wachs eingebettet, können der Paraffin-Blöcke auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Darüber hinaus produziert die Paraffin-Schnitt dünne Abschnitte, die Verbesserung der biologischen Sonde Zugang in weiteren Experimenten und reduzieren Zelle Schicht Overlay in Z-Richtung.
Doch herkömmliche Paraffin-Schnitt ist mühsam und erfordert Betreiber können. Paraffin-Abschnitte durchlaufen Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und schweben. Wichtiger ist Abschnitt Bänder aus dem Messerhalter auf dem Wasserbad zu übertragen notwendig, aber schwierig für junior-Betreiber. Besonders bei trockener Luft die Abschnitt-Bänder werden durch statische Elektrizität drehen und sind schwierig, auf dem warmen Wasser entfalten. Zur Verbesserung der Abschnitt sind Qualität, Befeuchtung der exponierten Gewebeoberfläche zwischen Mikrotom Klinge Pässe, die Wachs-Blöcke, Eintauchen in eiskaltes Wasser, oder erhöht die Luftfeuchtigkeit mit einem Luftbefeuchter in der Nähe von Mikrotom Kühlung6,7 empfohlen. . Neuere Methoden zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt gehören Hybrid Paraffin einbetten, Kryoschneiden8und Handelsabteilung Transfer System Hilfe9. Obwohl diese Methoden teilweise Paraffin verbessern schneiden, Geschwindigkeit und Qualität, sie schneiden machen viel schwerfälliger und Handelsabteilung Transfersysteme sind teuer.
In diesem Protokoll führen wir flexible, einfache und billige Geräte Schritt für Schritt zu schaffen, die an den Klingenhalter ein rotary Mikrotom angeschlossen werden können. Dieses Gerät umfasst einen Abschnitt-Kanal, ein Wasserbad und eine Heizung mit Erkennung Temperaturschalter. Nach dem Schneiden, Dutzende von Abschnitte fließen in den Abschnitt Kanal und geben Sie das Wasserbad direkt, damit automatisch entfaltet. Dies verbessert die Effizienz der Paraffin-Schnitt und macht diese Technologie noch komfortabler. Mit Hilfe dieser Methode, mehr Erwachsene Maus hippocampal Abschnitte, Erwachsenen Maus Niere Abschnitte, embryonale 15,5 Tage alte (E15.5) Maus Gehirn Abschnitte und Erwachsenen Zebrafisch Auge Abschnitte wurden geerntet in kürzerer Zeit und morphologisch mehr intakt geblieben. Diese Methode kann auch für andere Gewebeproben, die erfordern beschleunigte Paraffin-Schnitt und verhindern, dass der Abschnitt Unterscheidung verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>133000-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Paraffin Embedding Module</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial acrylic board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloromethane</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubular electric heating element(12V 200W)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller(12v 120w)</td>
			<td>Mingsuo</td>
			<td>XH-W3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary microtome&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Link the water channel with the microtome knife holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage transformer</td>
			<td>Dearll</td>
			<td>S-250-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable blade</td>
			<td>Accu-Edge</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Baso Diagnostics Inc.</td>
			<td>BA-4025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin&#160;</td>
			<td>Baso Diagnostics Inc.</td>
			<td>BA-4025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslide</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td>7105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip&#160;</td>
			<td>Citoglas</td>
			<td>10212424C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Xilong Chemical</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath for paraffin sections</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore Arcadia C&#160;- Cold Plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin repellent spray&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9990420</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning

Histologie und Pathologie ist das Schneiden von Paraffin-eingebetteten Gewebe verbreitet. Jedoch ist es langweilig. Um diese Methode zu verbessern, haben mehrere Handelsgesellschaften komplexer Abschnitt Transfersysteme mit fließenden Wasser entwickelt. Um diese Technologie zu vereinfachen, haben wir eine einfache Methode mit hausgemachten Ausrüstung, die schneiden und schwimmend in einem einfachen thermostatischen vereint; Geben Sie deshalb die Abschnitte automatisch das Wasserbad auf der Wasseroberfläche. Im Hippocampus von Erwachsenen mäusegehirnen, Erwachsenen Maus Nieren und embryonalen mäusegehirnen Erwachsenen Zebrafisch Augen wurden mit konventioneller Paraffin-Schnitt und die vorgestellte Methode zum Vergleich geschnitten. Statistische Analyse zeigt, dass unsere verbesserte Methode Zeitersparnis und höhere Qualität Teile produziert. Darüber hinaus ist es einfach für junior Operatoren, Paraffin-Schnitt einer ganzen Probe in kurzer Zeit.

Die verbesserte Methode stieg die Zahl der intakten Paraffin Abschnitte. Wir haben diese neue Methode auf Erwachsenen Maus hippocampal Gewebe, Erwachsenen Maus Nieren und embryonalen mäusegehirnen Zebrafisch Augen getestet. Wasser wurde hinzugefügt, um den Tank, und die Wassertemperatur war zwischen 38,0 ° C bis 40,0 ° c gehalten Sie waren nach einem seriell Vorbereitung der Gewebeproben, geschnitten und im Vergleich zu herkömmlichen schneiden. Die neue Methode Abschnitt Verlust zu vermeiden und erhöht den Anteil der intakten Abschnitte in den Erwachsenen Maus Hippocampus, Erwachsenen Maus Nieren, E15.5 mäusegehirnen und Erwachsenen Zebrafisch Augen (Abbildung 4A4 C, 4E, 4 G). Zusammenfassend, verbessert unsere Methode der Schnitt durch die Verhinderung Abschnitt Verlust und Ernte mehr intakte Abschnitte pro Probe.
Die verbesserte Methode verringert den Zeitaufwand pro Probe. Bei einem Vergleich den Zeitaufwand zwischen der herkömmlichen Methode und unsere verbesserte Methode, führten wir ganze Serie schneiden (aus dem ersten Abschnitt zum letzten Abschnitt eines Organs) auf die Erwachsenen Maus Hippocampus, Erwachsenen Maus Nieren E15.5 mäusegehirnen und Erwachsenen Zebrafisch Augen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die verbesserte Methode das Paraffin Schnitt Geschwindigkeit in allen getesteten Proben beschleunigt (Abbildung 4 b4D, 4F, 4 H). Unsere Methode erlaubt für schneller hochwertige Paraffin-Schnitt.
Serie Abschnitte der Zebrafisch faseroptische Netzhaut war von H und E Färbung beobachtet. Für Serie Schneiden des Segments Papille der Zebrafisch Netzhaut, waren die Abschnitte von der verbesserten Methode geerntet besser hat bessere Integrität als jene aus der konventionellen Paraffin-Schnitt Methode (Abbildung 5A, 5 b). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen beiden Methoden bezüglich der Qualität der meisten geernteten Abschnitte (Abbildung 5, 5 D). Gelegentlich, die Qualität der Teile aus der konventionellen Methode geerntet wurden relativ niedrig (Abb. 5E, 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig1.jpg"> Abbildung 1: der Prozess für die Montage der 7 kommerziellen Acryl-Boards in einem Tank. (A) Gesamtansicht der 7 Acryl Boards. (B-G) Schrittweise Montage des Tanks vom Board # 1 Board #7. (H) primäre Tank nach der Montage. (I) Allgemeine Tankgröße; die Schutzmembran auf der Tankoberfläche wurde für die weitere Installation entfernt. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, B = 200 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig2.jpg"> Abbildung 2: die entsprechend montierten Geräte einsatzbereit. (A) das intakte Geräte nach Verbindung zum rotary Mikrotom. Pfeil-Anzeige, Temperatur-Detektor wird durch das kleine Loch von Bohrmaschine installiert. Pfeilspitze, die Heizung (röhrenförmige elektrisches Heizelement) wird durch das Loch im Board #1 installiert. (B) die verstärkte gestrichelte Fläche A, die Funktion der Verbindung zwischen dem Mikrotom-Klingenhalter und Abschnitte Kanal. Pfeilspitze, Klingenhalter und Abschnitte Kanal sind durch neutrale Silikon-Dichtstoff verbunden. (C) identisch mit B, mit dem Wasser gegossen und Blade installiert. (D) Seitenansicht im gestrichelten Bereich C. Pfeilspitze, die Wasseroberfläche liegt in der Nähe der Schneide. VT: Spannungswandler; WB: Wasserbad; DT: digitaler Thermostat; B: Klinge; BH: Klingenhalter; SC: Abschnitte Kanal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig3.jpg"> Abbildung 3: Prozess-Schnitt verbesserte Paraffin. Die Zahlen in der unteren linken Ecke befindet sich liegen die verstärkte gestrichelten Bereiche A-D. Pfeil-Indikationen, der erste Abschnitt. (A, A') Der Abschnitt betritt die Abschnitte Kanal sofort und direkt nach dem Schneiden. (B, B') Die Abschnitte Band überquert die Grenze zwischen den Abschnitten Kanal und Wasser-Bad. (C, C') In den Abschnitten zu den hinteren des Wasserbades schweben und sind voll entfaltet. (D, D') Die Abschnitte werden von Mikroskop-Objektträger abgeholt, wenn sie den hinteren des Wasserbads zu erreichen und sind voll entfaltet. SC: Abschnitte Kanal; WB, Wasserbad. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig4.jpg"> Abbildung 4: die verbesserte Stationspunkte Methode verbessert die Effizienz und Ertrag Rate deutlich für die gesamte Serie Abschnitte. Die Ausbeute betrug den Anteil der intakten Abschnitte in alle Zuschnitte. Daten sind als Mittelwert ± SEM gezeigt und vom gleichen Betreiber erworben. (A, C, E, G) Die verbesserte Methode Abschnitt Verlust des Hippocampus Erwachsener Mäuse verhindert (91.04 ± 1.429 % N = 3, Vs 97,63 ± 0.4864 % N = 3, p = 0.0120), Erwachsene Maus Nieren (92.30 ± 0.5689 % N = 3, Vs 95.99 ± 0.7055 % N = 3, p = 0.0153), E15.5 Gehirn der Maus (90.67 ± 1,549 %, N = 3 Vs 97.01 ± 0.2816 %, N = 3, p = 0,0158), und Erwachsene Zebrafisch Augen (91.27 ± 0.9734 % N = 4 Vs 96.32 ± 0.7217 % N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) Die verbesserte Methode gespeichert Zeit verglichen mit der konventionellen Methode für die Erwachsenen Maus Hippocampus (126.0 ± 3,606 min Vs 79.67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0,0003), Erwachsene Maus Nieren (66.67 ± 1,764 min Vs 41.33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 Maus Br Ain (99,67 ± 3,480 min Vs 52.33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0.0010), und Erwachsene Zebrafisch Augen (48,00 ± 2,160 min Vs 30.75 ± 1,797 min, N = 4, p = 0,0009). * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,005. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig5.jpg"> Abbildung 5: H und E Färbung der ganzen Serie Abschnitte des Segments Papille der Zebrafisch Augen erworben von den herkömmlichen Methoden und verbesserte Paraffin-Schnitt vom selben Betreiber verglichen werden. (A) konventioneller Paraffin-Schnitt (21 Teile). (B) verbesserte paraffin Stationspunkte (24 Teile). (C) im gestrichelten Bereich der A6. (D) im gestrichelten Bereich der B7. (E) im gestrichelten Bereich der A17. (F) im gestrichelten Bereich der B19. Sternchen, die Abschnitte mit relativ schlechter Qualität. Pfeilspitzen, Papille; Pfeile, schweren Verschleiß des retinalen Gewebes. Maßstabsleiste = 200 µm (A und B); Maßstabsleiste = 50 µm (C, D, E, F). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Ergänzende Abbildung1: der Dimensionsparameter der 7 kommerziellen Acryl Platten. Die Zahl gibt die Länge des entsprechenden Board Rands. Einheiten: mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/supplementary_figure.AI">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Das Schneiden und schwimmende Methode für Paraffin-eingebetteten Gewebe für Schneiden

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt. Diese Methode verbindet schneiden und schweben mit einer einfachen thermostatischen Kammer, um den Transfer-Prozess erforderlich, nach der herkömmlichen Methode zu vermeiden. Infolgedessen wurden die Effizienz und die Anzahl der intakten Paraffin Abschnitte erheblich verbessert.

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Aufrufe.  Nanchang University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt. Diese Methode verbindet schneiden und schweben mit einer einfachen thermostatischen Kammer, um den Transfer-Prozess erforderlich, nach der herkömmlichen Methode zu vermeiden. Infolgedessen wurden die Effizienz und die Anzahl der intakten Paraffin Abschnitte erheblich verbessert.

Serie: The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Vibratom Sectioning für Enhanced Erhaltung der Zytoarchitektur der Säugetier-Corti-Organ

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.

The overall goal of this protocol is to accurately align magnetic resonance imaging (MRI) image volumes with histology sections via the creation of customized 3D-printed brain holders and slicer boxes.

3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Automatisierte Gait-Analyse zur Beurteilung der funktionellen Erholung bei Nagetieren mit peripheren Nerven- oder Rückenmarkskontitionsverletzungen

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...