この作品は中国の国家自然科学基金 (許可番号 31400936、31460260) によって支えられた、自然科学財団の江西省の中国 (20171BAB215020)。我々 はまた、この作業を支援する南昌大学とクイーン クイーンメアリー、ロンドン大学との共同プログラムを感謝します。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアと使用南昌大学委員会によって承認されています。
1. 機器をアセンブルし、ミクロトームを接続
<ol><li>要件 (補助図 1) あたりパラメーターを設計します。</li>
	<li>アクリル板を製造するローカル工場にパラメーターを送信します。</li>
	<li>シーケンスのすべての部品を組み立てる: クロロホルムを使用してタンクに 7 商業アクリル板を組み合わせてセクション チャネルと水お風呂 (図 1)。 注意: 光と酸素を満たしているとき、クロロホルムは有毒物質を生成します。ヒューム フードの装置を組み立てます。</li>
	<li>アクリル板 #1 (図 2 a,矢印) に穴を介して管状電気加熱要素をインストールします。</li>
	<li>温度コント ローラーをインストールするのには、電気ドリルを使用して #2 アクリル板に小さな穴を作成し、温度検出器 (図 2 a,矢印) をインストールします。タンク (図 2 a) にデジタル サーモスタットをインストールします。 注: 温度検出器は水面下 1 cm 以内にする必要があります。</li>
	<li>電源アクセスを提供するために、機器の電源を入れる前に 24 V 以下の電圧を調整します。</li>
	<li>ミクロトームから切片屑トレーを取り外します。</li>
	<li>中立的なシリコーン ・ シーラント (図 2 b) ミクロトーム ナイフ ホルダーを含むセクション チャネルにリンクします。 注: 刃の上の上の中立シリコーン ・ シーラント中傷されず古い刃は簡単に交換できるようにします。</li>
	<li>クロロホルムと固化する中立的なシリコン シール剤の時間を許可するために一晩乾燥させます。</li>
	<li>ブレード ホルダーに刃をインストールします。(図 2) 風呂の水に水を注ぐ。水表面だけブレード (図 2 D,アロー ・ ヘッド) の上部に触れる必要があります。</li>
</ol>2. パラフィン切片
注: 破片は、多くの場合ワックスのブロックと水の表面の上下端に蓄積します。この残骸は、定期的にクリアする必要があります。
<ol><li>
従来のパラフィン切片10を実行します。
	<ol>
<li>回転式ミクロトームのパラフィン包埋標本をクランプし、ブレード ホルダーにブレードを配置します。</li>
		<li>ハンド ホイールを切り、標本をセクションします。</li>
		<li>パラフィン切片のリボンを 38.5 ° C の温水浴に転送します。</li>
		<li>顕微鏡にセクションを展開した後の水面からスライドをピックアップします。</li>
		<li>42 ° C のオーブンでスライドを一晩乾かします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
改良されたパラフィン切片 (図 3)
	<ol>
<li>機器の電源を。</li>
		<li>温度検出スイッチでヒーターを開き、40.0 ° C 1 時間事前に水を暖めるために 38.0 ° C 間ターゲットの温度を設定します。</li>
		<li>パラフィン包埋にしたパラフィン ブロックを変更します。ミクロトームのカセット クランプにパラフィン ブロックを配置し、それをロックします。 注意: パラフィン ブロックの優れたと劣るボーダーは、円弧を形成し、狭いセクション チャネルを通過することができないからセクション リボンを防ぐために水平方向に変更ください。</li>
		<li>切断より厚いセクションでサンプルの迅速なアプローチします。</li>
		<li>適切なセクションの厚さ (成体マウスの脳、成体マウス腎臓、胎児マウスの脳に 10 μ m、ゼブラフィッシュの目 4 μ m) を調整します。ハンド ホイールを切り、セクションは、セクション チャネルと風呂に自動的に入力されます。</li>
		<li>ゆっくりと均一な切断ストローク (図 3 a) で標本をセクションします。 注: ハンド ホイールが数分間停止した後の最初のセクションが変更されます。セクションは連続した傷がある場合、替刃を置き換える必要があります。</li>
		<li>ライン (図 3 b、3 C) で浮かぶ風呂室にセクションをガイドします。 注: 場合は head セクションは、チャンバー壁に準拠して、浮いた状態を保つにブラシ ガイドを使用します。</li>
		<li>顕微鏡スライド上にセクションを遵守します。セクションの後完全に風呂の水、ピンセットで別のいくつかのセクションで展開します。顕微鏡のスライド (図 3 D) に風呂の水からそれらをピックアップします。 注: セクションする必要がありますピックアップする水のバスの後方からセクション チャネルと水お風呂の前のそれらがまだできないので完全に展開。</li>
		<li>一晩 42 ° C のオーブンでそれらを配置することによって、スライドを乾燥します。スライドは、無期限に室温で格納されることができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色法の改良8の評価のために使用します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography.">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+zebrafish+histology.">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li><li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid-Cut:+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples.">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles.">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. 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F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus.">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).</li><li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples.">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets.">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).</li></ol>

著者は、このデバイスの特許を持っているし、競争の興味を宣言しません。

パラフィン セクション形態を改善し、従来のパラフィン切片中の無駄な時間の問題を解決するには、改良されたパラフィン切片作製法切削と展開を組み合わせたを作成しました。この改良法は、セクション チャネル、水浴と温度検出スイッチとヒーターで構成されるシンプルな機器に依存します。セクション リボン セクション チャネルを介して水の風呂に入るし、自動的に切削しながら展開します。したがって、このメソッドは、パラフィン切片作製の品質と効率性は、成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、大人のゼブラフィッシュ目のパラフィン切片によって確認されたを向上します。
従来のパラフィン切片作製中にカーリングのセクションを避けるためには、多くの調整を行った組織表面を潤し、ワックスのブロックを冷却、湿度を増やすこと、セクショニング6,7を組み合わせることなど 8;ただし、これらの調整、パラフィン切片より退屈です。液体の水に依存する商業セクション転送システムより成功しています。このシステムでセクションが刈取直後後水表面を接触し、電気モーター駆動の水の流れは、低温水バス9ブレード ホルダーからセクションを転送します。その機構により静電気は、改善された断面品質断面を阻害しません。さらに、このシステムは、風呂の水にナイフ ホルダーからのセクションを手動で転送を回避と壊れやすいセクションを簡単に傷つけることができます高品質の薄いセクションを取得するのに。
私たちの改善された方法と簡単な装置をいくつかの利点を持つ商業セクション転送システムの経験を描画します。まず、装置は安く、開発途上地域の研究所でこのメソッドを普及できるし、商務部転送システムを補完することがあります。第二に、装置の水は静的であり、決して薄いセクションを取得するセクションを妨げます。我々 は連続して改善法を用いた 2 μ m の厚みのゼブラフィッシュ目を断面と高品質の取得セクション。第三に、大きい風呂水槽は少なくとも 40 のセクションを展開し、協力する 2 つの演算子をできるようにフローティングを可能にする機器で使用されます。一人は継続的に組織標本を切ることができるし、他のセクションを魚することができます直接。これには、展開するセクションを待っている時間が短縮されます。制服切断ストロークで連続切削もセクションの品質が向上します。
構造と私たちの単純な装置の外観の改善が必要です。たとえば、ようにこの装置をより積分とポータブル電源、ヒーター、温度コント ローラーなどのコンポーネントを統合できます。さらに、商業回転式ミクロトームは、異なるサイズを持っています。他のミクロトームに接続、この装置の高さと角度を調整する必要があります。神経生物学、組織形態、その他の研究フィールド11,12,13では、パラフィン切片他の分子の手法と組み合わせるが使用されています。潜在的に、このメソッドでは、臨床検査効率14,15とここで使用される 3 つの組織の種類を超えて他の生物的標本を向上できます。

形態学的研究は、生物学の研究が重要です。新技術は、全体の組織または生物1,2,3、薄い部分に試料を切断から直接彼らの目標は続いて染色を観察する研究者を許可しているが、プライマリのまま法者は唯一組織形態も組織に直接ターゲット蛋白質。光学顕微鏡を使用して、3 つのセクション タイプ: パラフィン、冷凍、およびグリコールメタクリル。セクショニングは共通組織抗原性を保護するため、試料の準備は簡単です、保有組織形態が悪いと薄い断面4,5には不向き。パラフィン切片は、保存状態の良い形態を展示するため最もよく使用される方法です。標本は完全に脱水し、ワックスに埋め込まれた、パラフィン ブロックに無期限に格納できます。また、パラフィン切片さらに実験の生物学的プローブ アクセスを改善し、Z 方向に細胞層オーバーレイを削減する薄いセクションを生成します。
しかし、従来のパラフィン切片がかかり、オペレーターのスキルを要求します。パラフィン切片を固定、脱水、埋め込み、切り取り、およびフローティング受けます。重要なは、風呂の水にナイフ ホルダーからセクション リボンを転送するは、ジュニアのオペレーターのためには必要なは難しいです。乾いた空気で特にセクション リボン静電気によるねじれが、暖かい水面に展開しにくい。セクションを改善するために品質、氷の水でそれらを浸すことまたはミクロトーム近く加湿器で湿度を上げるワックス ブロックを冷却のミクロトーム刃パス間公開される組織表面を潤し、6、7をお勧めします.ハイブリッド パラフィン包埋、セクショニング8、および商業部門転送システム支援9パラフィン切片を改善するための新しいメソッドが含まれます。これらのメソッドは、部分的にパラフィンを向上させる彼らははるかに厄介な断面を作る、商務部搬送システムは高価なセクショニング速度と品質。
このプロトコルでは、簡単、安価で柔軟な装置ステップバイ ステップ、回転式ミクロトームのナイフ ホルダーに接続することができますを作成する方法を示します。この装置は、温度検出スイッチ付きのヒーター、水風呂セクション チャネルで構成されます。切断した後、セクションの数十はセクション チャネルに流れるし、風呂の水、直接このように自動的に展開を入力します。これはパラフィン切片の効率が向上し、この技術をより便利になります。このメソッドよりアダルト マウス海馬セクション、成体マウス腎臓セクション、胚 15.5 日齢 (E15.5) マウスの脳のセクション、およびセクションを短い時間で収穫し、形態学的によりそのまま残った大人ゼブラフィッシュ眼を使用します。このメソッドは、加速されたパラフィン セクション区別の喪失を回避しながら断面を必要とする他の組織サンプルの使用もできます。

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commercial acrylic board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubular electric heating element(12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller(12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutral silicone sealant</td><td></td><td></td><td>Link the water channel with the microtome knife holder</td></tr><tr><td>Voltage transformer</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Disposable blade</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip&amp;nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for paraffin sections</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&amp;nbsp;- Cold Plate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraffin repellent spray&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning

組織学や病理学のパラフィン包埋組織の断面が使用されています。ただし、それは面倒です。この方法を改善するためにいくつかの民間企業は、液体の水を使用して複雑な部分転送システムを考案しています。この技術を簡素化し、我々 はカットとシンプルな恒温室; 内フローティングを組み合わせた自家製の機器を使用して単純なメソッドを作成したがって、セクションは自動的に水表面における水の風呂を入力します。アダルト ゼブラフィッシュ目マウス萌芽期の脳、成体マウス腎臓成体マウス脳海馬は、比較のため従来のパラフィン切片と提案手法の両方を使用して切られました。統計分析は、我々 の改良法時間を保存したし、高い品質のセクションを示しています。さらに、短時間で全体の標本のパラフィン切片ジュニア演算子の簡単です。

改善方法は、そのままパラフィン セクションの数を高めた。成体マウス海馬組織、成体マウス腎臓、マウス萌芽期の脳、ゼブラフィッシュの目のこの新しいメソッドをテストしました。タンクに水を追加し、40.0 ° c. に 38.0 ° C 水の温度に維持されました。準備した後、順次組織サンプル、切断され、従来区分と比較しています。新しいメソッドは、断面欠損を回避し、成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、成人ゼブラフィッシュ目 (図 4 a、4 C、4 e、4 G) でそのままセクションの割合を増加します。結論として、本手法は断面欠損を回避しよりそのままセクションごとに試料を採取して断面を改善しました。
法の改善には、1 試料当りの時間が減少しました。従来法と私たちの改良法の間に撮影時間を比較すると、全シリーズが成体マウス海馬、成体マウス腎臓、E15.5 マウスの脳は、大人の断面 (器官の最後のセクションを最初のセクション) から行ったゼブラフィッシュの目。改良法がセクショニング速度すべてのテストされたサンプル (図 4 b、4 D、4 f、4 H) にパラフィンを加速したことが示唆されました。一般的に、私たちのメソッドは、高速高品質パラフィン切片のできました。
ゼブラフィッシュ視神経網膜のシリーズ セクションは、H ・ E 染色で観察されました。シリーズは、ゼブラフィッシュの網膜の視神経乳頭のセグメントのセクショニングのため法の改善から収穫されるセクションが優れていた従来のパラフィン切片作製法 (図 5 a, 5 b) からのそれらよりもより良い整合性を持ちます。最も収穫セクション (図 5、5 D) の品質に関するこれらの 2 つの方法間に有意差はありませんでした。時折、従来から収穫の品質が比較的低い (図 5E5 階)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig1.jpg"> 図 1: タンクに 7 商業アクリル板を組み立てるためのプロセスです。(A) 7 アクリル板の全般的な眺め。(B G)#7 ボード基板 # 1 からタンクの段階的なアセンブリ。(H) アセンブリ後主タンク。(I) 一般的な水槽のサイズ;タンク表面の保護膜は、さらにインストールの削除されました。L = 400 mm、L' = 220 mm、H = 122 mm、W = 200 ミリメートル<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig2.jpg"> 図 2: 適切に組み立てられた装置の使用の準備ができています。(A) そのまま装置、回転式ミクロトームに接続されている後。矢印表示、温度検出器は、電気ドリルで小さな穴がインストールされます。#1 掲示板の穴に通して矢印ヘッド、ヒーター (電気要素) を設置します。(B) のミクロトーム刃ホルダーとセクション チャネル間の接続、機能の増幅された破線領域。矢印の頭、ブレード ホルダー、セクション チャネルは、中立シリコーンの密封剤によって接続されます。(C) B の水と同じ注ぎ、ブレードにインストールされています。(D) C. 矢印破線部側面図、水面はブレードの端に近い。VT: 変圧器;WB: 湯せん;DT: デジタル サーモスタットです。B: ブレード;BH: ブレード ホルダー;SC: セクション チャネル。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig3.jpg"> 図 3: セクショニング プロセス改良されたパラフィン。左下にある数字は、それぞれ A ~ D の増幅の破線エリアです。矢印表示、最初のセクション。(A、A')セクションは、セクション チャンネルすぐにおよび直接後切削を入力します。(B、B')セクション リボンは、セクション チャネルと水のお風呂の間の国境を越えた。(C, C')セクションで水浴の後にフロートし、十分に折られました。(D、D')セクションは顕微鏡のスライドによってピックアップ、彼らは水のバスの後部に達するし、十分に折られたとき。SC: セクション チャネル;WB、水浴。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig4.jpg"> 図 4: 改良断面法全体シリーズのセクションの大幅効率や歩留まり率の改善します。歩留まり率すべてカット セクションでそのままセクションの割合に匹敵します。データは、平均 ± SEM で表示され、同じ演算子が取得した.(A, C, E, G)化防止成体マウス海馬の断面欠損 (91.04 ± 1.429% N 3、対97.63 ± 0.4864 %n = = 3, p = 0.0120)、大人マウスの腎臓 (92.30 ± 0.5689% N 3、対95.99 ± 0.7055 %n = = 3, p = 0.0153)、E15.5 マウス脳 (90.67 ± 1.549%、N = 3対97.01 ± 0.2816%、N = 3, p = 0.0158) と大人のゼブラフィッシュ目 (91.27 ± 0.9734 %n = 4対96.32 ± 0.7217 %n = 4、p = 0.0059)。(B、D、F、H)保存法の改良に、成体マウス海馬の従来法と比較 (126.0 ± 3.606 分対79.67 ± 1.856 分、N = 3, p = 0.0003)、アダルト マウスの腎臓 (66・67 ± 1.764 分対41.33 ± 2.186 分、N = 3, p = 0.0008)、E15.5 マウス brアイン (99.67 ± 3.480 分対52.33 ± 4.333 分、N = 3, p = 0.0010) と大人のゼブラフィッシュ目 (48.00 ± 2.160 分対30.75 ± 1.797 分、N = 4、p = 0.0009)。* P < 0.05、* * P < 0.01、* * * P < 0.005。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig5.jpg"> 図 5: H ・ E 染色同じ演算子によるゼブラフィッシュ目従来の方法から取得し、パラフィン切片を改善の視神経乳頭のセグメントの全体シリーズ セクションが比較されます。(A) 従来パラフィン切片作製 (21 セクション)。(B) 改良されたパラフィン断面 (24 節)。(C) A6 の破線の領域。(D) B7 の破線の領域。(E) A17 の破線の領域。(F) B19 の破線の領域。アスタリスク、比較的貧しい品質のセクション。矢印の先端は視神経乳頭。矢印、網膜組織の深刻な涙。スケール バー = 200 μ m (A と B)。スケールバー = 50 μ m (C、D、E、F) です。<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
補足図 1: 7 の市販のアクリル板の寸法パラメーター 。数は、対応するボードの余白の長さを表します。単位: ミリメートル<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/supplementary_figure.AI">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください。</a> 。

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The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法

ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

the-cutting-floating-method-for-paraffin-embedded-tissue-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.3K ビュー.  Nanchang University. ここでは、パラフィン切片を改善するためのプロトコルを提案する.このメソッドは、切断と従来の方法に必要な転送処理を避けるために簡単な恒温室を使用して浮動小数点を兼ね備えています。その結果、そのままパラフィン切片数と効率が大幅に向上。

ビデオ: The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

免疫組織化学のためのスライス標本の薄いセクショニング

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

生物学

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its excellent preservation of morphology. Personalized medicine increasingly provides individually adapted and targeted therapies for characterized individual diseases enabled by combined morphological and molecular analytical technologies and diagnostics. Performance of morphologic and molecular assays from the same FFPE specimen is challenging because of the negative impact of formalin due to chemical modification and cross-linking of nucleic acids and proteins. A non-cross-linking, formalin-free tissue fixative has been recently developed to fulfil both requirements, i.e., to preserve morphology like FFPE and biomolecules like cryo-preservation. Since FISH is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics, we tested the applicability of FISH protocols on tissues treated with this new fixative. We found that formalin post-fixation of histological sections of non-cross-linking, formalin-free and paraffin-embedded (NCFPE) breast cancer tissue generated equivalent results to those with FFPE tissue in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) FISH analysis. This protocol describes how a FISH assay originally developed and validated for FFPE tissue can be used for NCFPE tissues by a simple post-fixation step of histological sections.

Fluorescence in-situ hybridization (FISH) is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics for selection of therapy in personalized medicine. A novel non-cross-linking, formalin-free tissue fixative that allows high quality morphologic, molecular and FISH analyses from the same specimen by addition of a post-fixation step before FISH is presented.

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

がん研究

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

免疫・感染学

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

医学

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

パラフィン セクションの埋め込み膵島

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

<meta charset="utf8"></head><body>低死亡率と最小限の癒着性を備えた最適化された薄型子宮内膜マウスモデル

Establishing a Mouse Model of Thin Endometrium

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory treatment options are still urgently needed. Several animal models of TE have been developed, but the mouse model involving abdominal surgery and injection of 95% ethanol presents a formidable challenge due to the high mortality rate and risk of intrauterine adhesions if not performed correctly. Here, we describe a detailed protocol that produces reliable and reproducible TE with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus with varying infusion times. The results showed that all of the mice successfully developed TE with infusion times ranging from 1-3 min, characterized by a typical reduction in endometrial thickness and the number of glands, as well as excessive endometrial fibrosis. These findings suggest that this mouse model is suitable for studying thin endometrium and can serve as a platform for developing future TE treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

This article describes a detailed protocol for producing a reliable and reproducible thin endometrium with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus within 1-3 min.

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory ...

切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法

要約

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免疫組織化学のためのスライス標本の薄いセクショニング

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニーバイオフィルムの薄い断面

マウスの卵巣脂肪パッドに移植

診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

パラフィンセクションの埋め込み膵島

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

切削とフローティング区分のための組織のパラフィン包埋法

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免疫組織化学のためのスライス標本の薄いセクショニング

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

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パラフィン セクションの埋め込み膵島

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

薄い子宮内膜のマウスモデルの確立

パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニーバイオフィルムの薄い断面

パラフィンセクションの埋め込み膵島