이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 31400936, 31460260)에 의해 지원 되었다, 자연 과학 재단의 장시 성 중국 (20171BAB215020). 우리는 또한이 작업을 지원 하기 위한 난창 대학과 런던 퀸 메리 대학 간의 공동 프로그램을 감사 합니다.

여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용 위원회의 남 창 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 장비를 조립 하 고는 톰을 연결
<ol><li>디자인 요구 사항 (보충 그림 1) 당 매개 변수.</li>
	<li>아크릴 보드 제조에 현지 공장에 매개 변수를 제출 합니다.</li>
	<li>순서 대로 모든 부품을 조립: 클로 프롬을 사용 하 여 결합 7 상업 아크릴 보드 탱크로 섹션 채널 및 물 목욕 (그림 1). 주의: 클로 프롬 때 그것은 빛과 산소 독성 물질을 생성 합니다. 증기 두건에서 장치를 조립 한다.</li>
	<li>아크릴 보드 #1 (그림 2A, 화살촉)에 구멍을 통해 전기 요소를 설치 합니다.</li>
	<li>온도 컨트롤러를 설치 하는 전기 드릴을 사용 하 여 #2 아크릴 보드에 작은 구멍을 만들고 온도 검출기 (그림 2A, 화살표)를 설치 합니다. 탱크 (그림 2A)에 디지털 온도 조절기를 설치 합니다. 참고: 온도 검출기는 수 면 아래 1 cm 이내 이어야 한다.</li>
	<li>전원에 대 한 액세스를 제공 하려면 장비를 켜기 전에 24 V는 전압을 조정 합니다.</li>
	<li>톰에서 섹션 쓰레기 트레이 제거 합니다.</li>
	<li>중립 실리콘 실 란 트 (그림 2B)와 톰 블레이드 홀더를 가진 섹션 채널을 연결 합니다. 참고: 오래 된 잎은 쉽게 교체할 수 있도록 블레이드 상단 위에 중립 실리콘 실 란 트를 얼룩 하지 마십시오.</li>
	<li>클로 프롬 및 중립 실리콘 실 란 트 시간을 강화 하기 위해 하룻밤 건조.</li>
	<li>블레이드 블레이드 홀더를 설치 합니다. 물 목욕 (그림 2C)에 물을 붓으십시오. 수 면 그냥 블레이드 (그림 2D, 화살표 머리)의 상단을 터치 한다.</li>
</ol>2. 파라핀 단면
참고: 파편은 종종 왁 스 블록 및 수 면의 위쪽 또는 아래쪽 가장자리에 누적 될. 이 파편 정기적으로 삭제 해야 합니다.
<ol><li>
전통적인 파라핀10단면을 수행 합니다.
	<ol>
<li>로타리 톰에 파라핀 포함 견본을 클램프과 블레이드 홀더에 블레이드를 놓습니다.</li>
		<li>수동 핸들을 표본 섹션.</li>
		<li>38.5 ° C 따뜻한 물 목욕을 sectioned 파라핀 리본을 전송 합니다.</li>
		<li>현미경에 섹션 전개 후 물 표면에서 슬라이드를 선택 합니다.</li>
		<li>하룻밤 건조 오븐에서 42 ° C에 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
향상 된 파라핀 단면 (그림 3)
	<ol>
<li>장치를 켭니다.</li>
		<li>온도 감지 스위치 히터를 열고 40.0 ° C에 미리 따뜻한 물에 1 시간을 38.0 ° C 사이의 대상된 온도 설정 합니다.</li>
		<li>파라핀 포함; 인수 파라핀 블록 수정 그리고 톰의 카세트 클램프에는 파라핀 블록을 놓고 그것을 자물쇠. 참고: 파라핀 블록의 뛰어난 및 하 부 테두리 섹션 리본 호를 형성 하 고 좁은 섹션 채널을 통해 흐름 수 없습니다 되기에서 방지 하기 위해 가로 수정할 수 합니다.</li>
		<li>신속 하 게 절단 두꺼운 섹션으로 샘플을 접근 한다.</li>
		<li>적합 한 섹션 두께 (성인 쥐 두뇌, 성인 마우스 신장, 및 태아 마우스 두뇌 10 µ m, zebrafish 눈 4 µ m)를 조정 합니다. 수동 핸들으로 바뀌고 섹션 섹션 채널 및 목욕에 자동으로 입력 합니다.</li>
		<li>느리고 균일 한 절삭 스트로크 (그림 3A)에 견본 섹션. 참고: 첫 번째 섹션의 Thethickness는 몇 분 동안 중지 되는 수동 핸들 변경 될 것입니다. 일회용 블레이드 섹션 연속 긁힌 자국이 있을 때 대체 되어야 한다.</li>
		<li>(그림 3B, 3c) 라인에서 떠 목욕 실로 섹션 안내. 참고: 경우 head 섹션 챔버 벽에 고착, 부동을 브러시 가이드를 사용 합니다.</li>
		<li>현미경 슬라이드에 섹션을 준수 합니다. 섹션 후 완전히 물 목욕, 핀셋으로 별도 여러 섹션에에서 전개. 다음 그들에서 픽업 현미경 슬라이드 (그림 3D)에 물 목욕. 참고: 섹션 해야 선택 됩니다 물 목욕의 후부에서 섹션 채널 및 물 목욕의 앞쪽에 아직 되지 것입니다 완전히 펼친 대로.</li>
		<li>밤새 42 ° C 오븐에서 그들을 배치 하 여 슬라이드를 건조. 슬라이드 다음 저장할 수 있습니다 실 온에서 무기한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>개선된 방법8의 평가 위해 얼룩이 지는 Hematoxylin 오신 (그)를 사용 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography.">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+zebrafish+histology.">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li><li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid-Cut:+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples.">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754 (2016).</li><li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles.">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438 (2010).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis.">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies.">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus.">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).</li><li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples.">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets.">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).</li></ol>

저자는이 장치에 대 한 특허를가지고 하 고 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

파라핀 섹션 형태를 개선 하 고 기존의 파라핀 단면 동안 시간을 낭비의 문제를 해결, 우리는 향상 된 파라핀 단면 절단 및 전개 방법을 만들었습니다. 이 향상 된 방법은 간단한 장비 섹션 채널, 물 목욕, 온도 감지 스위치 히터에 의존 합니다. 섹션 리본 섹션 채널을 통해 물 목욕을 입력 하 고 자동으로 절단 하는 동안 펼쳐져. 따라서,이 방법은 파라핀 품질과 효율성, 파라핀 성인 마우스 해 마, 성인 마우스 신장, E15.5 마우스 두뇌, 및 성인 zebrafish 눈의 단면에 의해 확인 된 단면을 향상 시킵니다.
전통적인 파라핀 단면 동안 컬링 섹션을 피하기 위해, 많은 조정 되었습니다, 조직 표면 보습, 왁 스 블록을 냉각, 습도, 증가 및 cryosectioning6,7, 결합 등 8; 그러나, 이러한 조정 확인 파라핀 단면 더 지루한. 유체 물에 의존 하는 상업 섹션 이동 체계는 더 성공 했다. 이 시스템에는 섹션 수 면 즉시 절단 후,와 전기 모터 구동 물 스트림 블레이드 홀더에서 낮은 따뜻한 물 목욕9섹션을 전송 합니다. 그것의 기계 장치 때문에 단면, 향상 된 섹션 품질 결과 정전기 억제 하지 않습니다. 또한,이 시스템은 수동으로 블레이드 홀더 섹션 물 목욕 전송 방지, 쉽게 깨지기 쉬운 섹션, 손상 그것은 또한 돕는다 높은-품질 얇은 섹션 인수에.
우리의 향상 된 방법으로 간단한 장비 몇 가지 장점 가진 상업 섹션 전송 시스템의 경험에 그립니다. 첫째, 장비는 저렴, 지역 개발에 실험실에서이 방법을 대중화 수와 상업 섹션 전송 시스템을 보완 될 수 있습니다. 둘째, 장비에 물은 정적 이며 결코 취득 얇은 섹션을 섹션을 방해. 우리는 연속적으로 향상 된 방법을 사용 하 여 2 µ m 두께의 zebrafish 눈을 구분 하 고 인수 섹션은 높은 품질의. 셋째, 더 큰 물 목욕 탱크 전개 하 여 협조를 두 명의 연산자를 허용 동시에, 부동 적어도 40 섹션을 허용 하는 장비에 사용 됩니다. 한 사람이 지속적으로 조직 견본을 자를 수 있다 고 다른 섹션을 직접 물고기 수 있습니다. 이 전개 하는 섹션에 대 한 대기 시간을 줄일 수 있습니다. 균일 한 절단 치기로 연속 절단은 또한 섹션 품질을 향상 시킵니다.
구조와 우리의 간단한 장비의 모양을 개선을 필요 합니다. 예를 들어 더 통합 하 고 휴대용이 장비를 만들기 위해 전원, 히터, 온도 조절기 등 구성 요소를 통합할 수 있습니다. 또한, 상업 로타리 microtomes 다른 크기가 있다. 다른 microtomes에 연결 하려면, 각도이 기기 높이 조정 되어야 한다. 파라핀 단면 다른 분자 기술로 결합 된 신경 생물학, 조직 형태 및 다른 연구 분야11,,1213에 널리 사용 됩니다. 잠재적으로, 임상 검사 효율14,15 그리고 여기에 사용 되는 세 가지 조직 형식 넘어 기타 생물 들이이 방법을 개선할 수 있습니다.

형태학 연구 생물학 연구에서 중요 하다입니다. 새로운 기술 얼룩 뒤에 그들의 목표는 전체 조직 또는 생물1,2,3, 얇은 섹션으로는 시료를 절단에서 직접 관찰 하는 연구를 허용 했다, 남아 있다 기본 메서드 fornot 유일한 조직 형태 뿐만 아니라 조직에서 직접 대상으로 하는 단백질. 가벼운 현미경 검사 법 사용 하 여 세 가지 섹션 유형: 파라핀, 냉동, 그리고 semithin. 비록 cryosectioning 조직 antigenicity을 보호 하는 것이 일반적 이며 견본 준비는 간단 하다, 가난 하 고 얇은 단면4,5에 대 한 부적 절 한 유지 조직 형태가 이다. 파라핀 단면 전시 잘 보존 된 형태에 대 한 가장 자주 사용 되는 방법입니다. 표본은 완전히 탈수 하 고 왁 스에 포함 된, 파라핀 블록 무기한으로 저장할 수 있습니다. 또한, 파라핀 단면 얇은 섹션 추가 실험에서 생물학 프로브 액세스를 개선 하 고 셀 레이어 오버레이 Z 방향으로 감소 생산 합니다.
그러나, 전통적인 파라핀 단면 지루한 이며 연산자 기술 요구. 파라핀 섹션에는 고정, 탈수, 포함, 절단, 그리고 떠 받 다. 중요 한 것은, 물 목욕을 칼 홀더에서 섹션 리본 전송은 필요 하지만 어려운 주니어 연산자에 대 한입니다. 건조 한 공기에 (서) 특히 섹션 리본 정전기 때문 트위스트 것과 따뜻한 물 표면에 전개 하기 어렵습니다. 섹션을 개선 하기 위해 품질, 얼음 물에 immersing 또는 톰 근처 가습기로 습도 올리는 왁 스 블록을 냉각 톰 블레이드 가공 패스 사이의 노출 된 조직 표면에 보습6,7 권장 . 파라핀 단면을 개선 하기 위한 새로운 방법 등 하이브리드 파라핀 포함, cryosectioning8, 상업 섹션 전송 시스템 지원9. 비록 이러한 방법을 부분적으로 파라핀을 개선 속도 품질, 단면 그들은 단면 훨씬 더 복잡 하 고, 만들고 상업 섹션 전송 시스템은 비싼.
이 프로토콜을 로타리 톰의 블레이드 홀더에 연결 될 수 있는, 저렴 한 간단 하 고 유연한 장비 단계를 만드는 방법을 보여 줍니다. 이 장비는 구성 섹션 채널, 물 목욕, 온도 감지 스위치 히터. 절단 후, 섹션의 수십 섹션 채널을 흘러 하 고 따라서 자동으로 펼쳐지고 직접 물 목욕을 입력 합니다. 이 파라핀 단면 효율을 향상 하 고이 기술을 더 편리 하 게. 이 방법, 더 성인 마우스 hippocampal 섹션, 성인 마우스 신장 섹션, 배아 15.5 일 된 (E15.5) 마우스 뇌 섹션, 및 섹션 짧은 시간에 수확 하 고 형태학 상으로 더 온전 하 게 남아 있었다 성인 zebrafish 눈을 사용 하 여. 이 메서드는 또한 가속된 파라핀 섹션 구별의 손실을 피하 면 서 단면 필요로 하는 다른 조직 샘플에 대 한 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commercial acrylic board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubular electric heating element(12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller(12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutral silicone sealant</td><td></td><td></td><td>Link the water channel with the microtome knife holder</td></tr><tr><td>Voltage transformer</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Disposable blade</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip&amp;nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for paraffin sections</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&amp;nbsp;- Cold Plate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraffin repellent spray&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning

파라핀 끼워 넣어진 조직의 단면 조직학 및 병 리에 널리 사용 됩니다. 그러나, 그것은 지루한입니다. 이 방법을 개선 하기 위해, 여러 상업 회사 유체 물을 사용 하 여 복잡 한 섹션 전송 시스템을 고안 했다. 단순화 하기 위해이 기술을, 우리가 만든 결합 절단 및 간단한 항 온 챔버; 내 부동 수 제 장비를 사용 하 여 간단한 방법 따라서, 섹션 자동으로 물 표면에 물 목욕을 입력합니다. 성인 쥐 두뇌, 성인 마우스 신장, 배아 마우스 두뇌, 및 성인 zebrafish 눈에서 해 마는 비교에 대 한 전통적인 파라핀 단면 및 제시 방법 모두를 사용 하 여 절단 했다. 통계 분석이 보여줍니다 우리의 개선된 방법 시간을 저장 하 고 높은 품질 섹션을 생산. 또한, 짧은 시간에 전체 견본의 파라핀 단면 주니어 연산자에 대 한 쉽습니다.

개선된 방법 그대로 파라핀 섹션의 수를 증가 했다. 성인 마우스 hippocampal 조직, 성인 마우스 신장, 배아 마우스 두뇌, 그리고 zebrafish 눈에이 새로운 방법을 테스트 했습니다. 물 탱크에 추가 되었다 그리고 40.0 ° c 38.0 ° C 사이 수 온 유지 되었다 순차적으로 준비 후 조직 샘플, 그들은 구분 하 고 기존의 단면에 비해 했다. 새로운 메서드는 섹션 손실을 피할 하 고 성인 마우스 해 마, 성인 마우스 신장, E15.5 마우스 두뇌, 및 성인 zebrafish 눈 (그림 4A4c, 4E, 4 G)에 그대로 섹션의 비율. 결론적으로, 우리의 방법 섹션 손실을 방지 하 고 견본 당 더 많은 그대로 섹션을 수확 하 여 단면 개선.
개선된 방법 견본 당 소요 시간 감소. 전체 시리즈는 성인 마우스 해 마, 성인 마우스 신장, E15.5 마우스 두뇌, 및 성인 (장기의 마지막 부분에 첫 번째 섹션)에서 단면 우리 수행 시간을 기존의 방법과 우리의 향상 된 방법 사이 비교, zebrafish 눈입니다. 결과 개선된 방법 (그림 4B4, 4 층, 4 H) 모든 테스트 샘플에서 속도 단면 파라핀 가속 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리의 방법은 빠른 고급 파라핀 단면에 대 한 허용.
시리즈 섹션 zebrafish 광섬유 망막의 H와 E 얼룩에 의해 관찰 되었다. 시리즈 제 브라 망막의 광 디스크 세그먼트의 단면에 대 한 개선된 방법에서 수확 하는 섹션은 더 나은 전통적인 파라핀 메서드 (그림 5A, 5B) 단면에서 그 보다 더 나은 무결성. 가장 수확된 섹션 (그림 5C, 5 D)의 품질에 대 한이 두 메서드 간의 중요 한 차이가 없었다. 때때로, 종래의 방법에서 수확 하는 섹션의 품질은 상대적으로 낮은 (그림 5E, 5 층).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig1.jpg"> 그림 1: 탱크에 7 상업 아크릴 보드를 조립 하는 과정. (A) 7 아크릴 보드의 전체 보기. (B-G) #7 보드 보드 # 1에서에서 탱크의 stepwise 어셈블리입니다. (H) 조립 후 기본 탱크. (I) 일반적인 탱크 크기; 탱크 표면에 보호 막은 추가 설치에 대 한 제거 되었습니다. L = 400 m m, L' = 220 mm, H = 122 m m, W = 200 m m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig2.jpg"> 그림 2: 적절 하 게 조립된 장비 사용에 대 한 준비. (A)는 그대로 장비 로타리 톰에 연결 된 후. 화살표 표시, 온도 감지기는 전기 드릴으로 작은 구멍을 통해 설치 됩니다. 화살표 머리, 히터 (전기 요소) 보드 #1 구멍을 통해 설치 됩니다. (B) 섹션 채널과 톰 블레이드 홀더 사이 연결의, 기능에 증폭된 파선된 영역. 화살표 머리, 블레이드 홀더 및 섹션 채널 중립 실리콘 실 란 트로 연결 된다. (C) 물과 B 동일 부와 블레이드를 설치 합니다. (D) C. 화살표 머리에 점선된 영역의 측면 모습, 물 표면 블레이드 가장자리에 가깝습니다. VT: 전압 변압기; WB: 물 목욕; DT: 디지털 온도; B: 블레이드; BH: 블레이드 홀더; SC: 섹션 채널입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig3.jpg"> 그림 3: 프로세스를 구분 하는 향상 된 파라핀. 왼쪽 아래에 있는 그림은 A d에서 증폭된 파선된 지역 각각. 화살표 표시, 첫 번째 섹션입니다. (A, A') 섹션 입력 섹션 채널 즉시 직접 후 절단. (B, B') 섹션 리본 섹션 채널 및 물 목욕 사이 경계를 교차 한다. (C, C') 섹션 물 목욕의 후부에 부동 하 고 완전히 접힌 되지 않습니다. (D, D') 섹션은 집어 현미경 슬라이드에 의해 그들은 물 목욕의 후부에 도달 되지 않을 때 완전히 접힌. SC: 섹션 채널; WB, 물 목욕입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig4.jpg"> 그림 4: 향상 된 단면 방법 크게 전체 시리즈 섹션에 대 한 효율과 수율 속도 향상. Yield 속도 모든 컷된 섹션에 그대로 섹션의 비율을 같게 했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시 하 고 같은 연산자에 의해 인수. (A, C, E, G) 개선된 방법 성인 마우스 해 마의 섹션 손실 방지 (91.04 ± 1.429 %N = 3, vs 97.63 ± 0.4864 %N = 3, p 0.0120 =), 성인 신장 마우스 (92.30 ± 0.5689 %N = 3, vs 95.99 ± 0.7055 %N = 3, p = 0.0153), E15.5 쥐의 뇌 (90.67 ± 1.549%, N = 3 대 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158), 그리고 성인 zebrafish 눈 (91.27 ± 0.9734 %N = 4 대 96.32 ± 0.7217 %N = 4, p = 0.0059). (B, D, F, H) 개선된 방법 저장 시간 성인 쥐 해 마에 대 한 종래의 방법에 비해 (126.0 ± 3.606 분 대 79.67 ± 1.856 분, N = 3, p = 0.0003), 성인 신장 마우스 (66.67 ± 1.764 분 대 41.33 ± 2.186 분, N = 3, p = 0.0008), E15.5 마우스 br 아 인 (99.67 ± 3.480 분 vs 52.33 ± 4.333 분, N = 3, p = 0.0010), 그리고 성인 zebrafish 눈 (48.00 ± 2.160 분 vs 30.75 ± 1.797 분, N = 4, p = 0.0009). * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.005. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig5.jpg"> 그림 5: 비교 H와 E 같은 연산자로 zebrafish 눈 종래의 방법에서 획득 및 파라핀 단면 개선의 광학 디스크 세그먼트의 전체 시리즈 섹션의 얼룩. (A) 기존의 파라핀 단면 (21 절). (B) 향상 된 파라핀 단면 (24 절). (C) A6의 파선된 영역. (D) B7의 파선된 영역. (E) 점선된 영역 A17. B19 (F) 점선된 영역. 별표, 상대적으로 가난한 품질 섹션입니다. 화살표 머리, 광학 디스크; 화살표, 망막 조직의 심한 눈물입니다. 눈금 막대 = 200 µ m (A와 B); 눈금 막대 = 50 µ m (C, D, E, F). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1: 7 상업 아크릴 보드의 차원 매개 변수. 숫자는 해당 보드의 길이 나타냅니다. 단위: mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/supplementary_figure.AI">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

절단 및 파라핀 끼워 넣어진 조직 단면에 대 한 부동 방법

여기, 선물이 파라핀 단면 개선 하는 프로토콜. 이 메서드는 절단 하 고 종래의 방법에 필요한 전송 프로세스를 피하기 위해 간단한 온도 챔버를 사용 하 여 부동을 결합 합니다. 그 결과, 효율과 그대로 파라핀 섹션 수가 크게 개선 했다.

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

the-cutting-floating-method-for-paraffin-embedded-tissue-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K 조회수.  Nanchang University. 여기, 선물이 파라핀 단면 개선 하는 프로토콜. 이 메서드는 절단 하 고 종래의 방법에 필요한 전송 프로세스를 피하기 위해 간단한 온도 챔버를 사용 하 여 부동을 결합 합니다. 그 결과, 효율과 그대로 파라핀 섹션 수가 크게 개선 했다.

비디오: The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Immunohistochemistry에 대한 슬라이스 준비 씬 Sectioning

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

연구

생물학

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

암 연구학

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

면역학 및 감염병학

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

면역 조직 화학 및 전자 현미경을 사전은 임베딩에 대한 비 인간 영장류 뇌 조직의 준비

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

신경과학

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

설립 및 종양 조각의 분석 Explants 진단 테스트에 대 한 전제 조건으로

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

Optimized Thin Endometrium Mouse Model with Low Mortality and Minimal Adhesions

Establishing a Mouse Model of Thin Endometrium

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory treatment options are still urgently needed. Several animal models of TE have been developed, but the mouse model involving abdominal surgery and injection of 95% ethanol presents a formidable challenge due to the high mortality rate and risk of intrauterine adhesions if not performed correctly. Here, we describe a detailed protocol that produces reliable and reproducible TE with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus with varying infusion times. The results showed that all of the mice successfully developed TE with infusion times ranging from 1-3 min, characterized by a typical reduction in endometrial thickness and the number of glands, as well as excessive endometrial fibrosis. These findings suggest that this mouse model is suitable for studying thin endometrium and can serve as a platform for developing future TE treatments.

This article describes a detailed protocol for producing a reliable and reproducible thin endometrium with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus within 1-3 min.

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory ...

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.