We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Ethische Erklärung Vorliegenden Studie ist es in Übereinstimmung mit den Richtlinien des schwedischen National Board für Versuchstiere und der Europäischen Gemeinschaft Richtlinie (86/609 / EWG) unter den ethischen Genehmigungen durchgeführt N338 / 09, N15 / 10 und N65 / 10, die durch die genehmigt Nord Stockholm Tierethikkommission. 1. Gewebepräparation <ol><li> Perfusions &amp; Fixierung <ol><li> Anesthetize das Tier mit Isofluran transkardialer Perfusion über linken Ventrikels durchzuführen. Initiieren Spülen von Gefäßen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), um die Blutbestandteile zu entfernen, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (PFA). </li><li> Fixieren Sie seziert Gehirn, Rückenmark und periphere LN Gewebe durch in PFA eingetaucht wird. Nach 24 Stunden bei 4 ° C, übertragen das Gewebe aus PFA in PBS und lagern bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung. Alternativ zu kommerziellen PBS, lösen sich 9 g NaCl in 250 ml der S &amp;# 246; rensen Puffer und 750 ml VE - Wasser (dH 2 O) hinzuzufügen; 0,2 M Sörensen - Puffer (pH 7,4) lösen sich 13,8 g NaH 2 PO 4 x 1 H 2 O und 71,2 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O in 2,5 l dH 2 O. vorzubereiten </li></ol></li><li> Dehydration &amp; Einbetten <ol><li> Schneiden Sie das Gewebe in etwa 5 mm dicke Abschnitte mit einer Rasierklinge. </li><li> Initiieren des Gewebes Härtungsprozess (Dehydratisierung) , indem das Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor verwendet (Standardverfahren basierend auf Eintauchen in aufsteigenden Konzentrationen von Ethanol, gefolgt von Xylol und schließlich Paraffin (Tabelle 1). </li><li> Legen Sie das Gewebe in eine Form und gießen in dem flüssigen Paraffin um die Probe eine &quot;Paraffinblock&quot; zu bilden. Langzeitlagerung erfordert Raumtemperatur (RT). Jedoch vor dem Schneiden ist es empfehlenswert , die Blöcke zu kühlen, beispielsweise über Nacht (o / n) bei 4 ° C.</li></ol></li></ol> 2. Sectioning <ol><li> Platzieren Sie den Paraffinblock in eine feste Halterung des Schlittens Mikrotom, die hin und her über das Messer bewegen kann. Stellen Sie den optimalen Winkel zwischen dem Block und dem Mikrotom-Messer (das hängt von Messergeometrie, sondern auch auf der Schnittgeschwindigkeit und Technik). </li><li> Schneiden Sie 3 bis 5 um dicke Querschnitte aus dem Paraffinblock. </li><li> Übertragen Sie einfach schneiden Abschnitt in einen Wasserbehälter und montieren Sie ihn anschließend aus dem Wasser auf den Glasträger. </li><li> Drücken Sie die montierten Abschnitt sorgfältig gegen ein Papiertuch Restwasser und mögliche Luftblasen zu entfernen. Im Handel vorbeschichteten sind Klebstoff Glasobjektträger zu empfehlen. </li><li> Trocken gerahmte Dias für ein paar Stunden in einem Ofen 50 - 60 ° C. </li></ol> 3. Entparaffinierung (Rehydrierung &amp; Blockierung der Endogene Peroxidase) <ol><li> Tauchen Sie die Dias 2x in Xylol (alternativ XylolersatzXEM-200), jedes Mal 15 bis 20 &#39;. </li><li> Spülen in 99% Ethanol. </li><li> Um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, inkubiere die Abschnitte 30 &#39;in Methanollösung, die 0,25% Wasserstoffperoxid. </li><li> Weiter Rückfettung durch Ethanol mit steigendem Wassergehalt unter Verwendung von (99%, 70%, endet in destilliertem Wasser. </li><li> Von diesem Punkt der Abdeckung bis Montage schlüpft Abschnitte feucht gehalten werden müssen. </li></ol> 4. Antigen Retrieval <ol><li> Verwenden Sie einen Dampfgarer zum Kochen Sie die Folien in einer Antigen - Retrieval - Lösung (in diesem Fall EDTA pH 8,5 - Puffer) für 60 &#39;(EDTA Puffer - Stammlösung enthält 1,21 g Tris und 0,37 g gelöst EDTA in 50 ml dH 2 O; zur Herstellung des Arbeits Lösung verdünnte 2,5 ml EDTA - Stammlösung in 47,5 ml dH 2 O). </li><li> Das Abkühlen der die Folien auf RT ca. 1 Stunde und dann spülen 3 - 5-fach mit Tris-gepufferte Salzlösung (TBS, verwenden Sie alternativ PBS), bestehend aus 0,05 M Tris und 0,15 M NaCl; pH-Wert 7,5 eingestellt with HCl. Alternativ kommerzielle TBS verwenden. </li></ol> 5. Das Blockieren der unspezifischer Bindungsstellen <ol><li> Zur Vermeidung von unspezifischen Hintergrundreaktionen, inkubiere die Abschnitte auf RT für 30 &#39;in der blockierenden Lösung, die 10% fötales Kälberserum (FCS) und 90% DAKO Puffer enthält. </li></ol> 6. Doppelimmunmarkierung: Die gleichzeitige Inkubation mit dem primären Abs <ol><li> Verdünnte erforderliche Menge an primären Antikörper in der Blockierungslösung und Inkubieren o / n bei 4 ° C. Für die Doppelimmunfärbungs kombinieren α-Eotaxin (CCL11; 1: 300) mit α-CD68 (Ed1; 1: 1000) oder α-Iba1 (AIF1, 1: 1000) oder α-CD8a (Ox-8; 1: 200) . </li><li> Spülen Sie die Folien 3-5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer). </li><li> Verdünnte erforderliche Menge an sekundärem Antikörper (biotinylierter anti-Ziege und AP-konjugiertem Anti-Maus, die beide 1: 200) in der Blockierungslösung und inkubiere 1 h bei RT. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer (use alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer). </li><li> Inkubieren der Objektträger mit Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (HRP) in der Blockierungslösung für 1 Stunde bei RT verdünnt. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit TBS-Puffer (verwenden Sie alternativ 10x verdünnt DAKO-Puffer). </li></ol> 7. Visualisierung <ol><li> Visualisierung des gebundenen AP-markierten sekundären Antikörper <ol><li> Bereiten 0,1 M Tris-HCl - Puffer durch Lösen von 12,1 g Tris in 1 l dH 2 O und pH - Wert auf HCl unter Verwendung von . Verwenden Sie die gleiche Tris-HCl-Puffer 1 M levamisole Lösung herzustellen. Bereiten Sie frisch 4% NaNO 2 -Lösung in dH 2 O. </li><li> Zur Erzielung 50 ml des Fast Blue (FB) Substrat (Volumen erforderlich für eine Standard-Glasküvette) auflösen 6,25 mg Naphtol-AS-MX-Phosphat in 312,5 ul DMF in der Glasröhre und rühren in 50 ml vorgewärmten (37 ° C) Tris-HCl-Puffer. in 312,5 ul 2 N HCl hinzufügen 312,5 ul zuvor 12,5 mg FB RR Salz zu lösen preparot 4% NaNO 2 Lösung und rühren Sie die Mischung in den gleichen 50 ml vorgewärmtes Tris-HCl - Puffer. Schütteln Sie leicht, bis die gelbe Flüssigkeit klar wird, und fügen Sie schließlich 77 ul zuvor hergestellten 1 M Levamisol Lösung. Das Filtrat erhaltene Mischung und gieße auf platziert Folien in der Glasküvetten. </li><li> Initiieren Sie die Inkubation bei 37 ° C und Kontrollprozess unter dem Lichtmikroskop zu entwickeln ca.. alle 15 - 30 min. Wenn Fuzzy-Drehen, ersetzen Sie die FB-Lösung mit der frischen Mischung. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5-fach mit TBS-Puffer und Transfer anschließend in PBS-Puffer. </li></ol></li><li> Visualisierung des gebundenen biotinylierten sekundären Antikörper <ol><li> Bereiten DAB / H 2 O 2 Entwicklungslösung , die durch Verdünnen von 1 ml DAB - Stammlösung (25 mg DAB pro 1 ml PBS) in 49 ml PBS. Fügen 16,5 &amp; mgr; l H 2 O 2 und das Filtrat vor Gießen auf Abschnitte. </li><li> Die Umwandlung des Chromogens DAB in Ausfällen Stirnn Pigment kann sofort erfolgen. Steuern Sie den Entwicklungsprozess unter dem Lichtmikroskop (sogar einige Sekunden längere Inkubationszeit kann einen hohen Hintergrund erhöhen und die Maske das spezifische Signal). </li><li> Die Intensität des braunen Pigmentes Niederschlag kann alternativ durch Inkubation in 2% Kupfersulfat und 0,9% NaCl für 5 &#39;, die aus Lösung verbessert werden. </li><li> Spülen Sie die Folien 3 - 5x mit PBS und schließlich mit dH 2 O, verwenden Sie alternativ Leitungswasser. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Deckel direkt aus dem Wasser gleitet durch die Verwendung wässriger GelTol Eindeckmediums. Vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen. </li><li> Ermöglichen eine vollständige Trocknung des Befestigungsmedium, beispielsweise o / n bei 4 ° C. Shop getrockneten Folien auf RT. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % Ethanol </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &amp;# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 3. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % Ethanol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % Ethanol </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % Ethanol </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Xylol </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Xylol </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> Paraffin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> Paraffin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 13. </td><td> Paraffin </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> Paraffin </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Gewebeverarbeitung von Tissue-Tek VIP Vakuuminfiltrationsprozessor.

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The authors declare no conflict of interest.

Standard-immunhistochemischen Verfahren erfordern häufig spezifische Anpassungen ein optimales Ergebnis zu erzielen, die häufig umfangreiche Erfahrung beinhaltet, sondern auch &quot;trial and error&quot; -Ansatz. Von Gewebeaufbereitung bis Target-Visualisierung, fast jeder Schritt in dem Protokoll können einzeln unterzogen werden, um entworfen Modifikationen, um das Endergebnis zu verbessern. Doppelfärbung Protokoll hier vorgestellten Beispiel für IHC-basierte Protein besonders angepasst Targeting durch neuroinflammation betroffen Wechselbeziehungen zwischen den Zielproteinen unserer Beteiligung an Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Ratten CNS und LN Gewebeschnitten zu beurteilen. Als solches kann es als ein Tutorial für das Erlernen der Technik der IHC verwendet werden, sondern auch als Quelle der Inspiration für fortgeschrittene Studien. Allerdings ist zu beachten, dass eine bloße Reproduktion dieses Protokolls für die Ausrichtung anderer Proteine ​​und / oder in anderen Geweben gehalten werden, als hier können suboptimale Ergebnisse erzeugen präsentiert. In - situ - Hybridisierung unter Verwendung gesperrt Nukleinsäure (LNA) Ribosonde gegen CCL11 upregulation der jeweiligen mRNA - Spiegel in CNS des congenic Rattenstamm 10 ausgestellt. Dieser Befund wurde durch qPCR Analysen bestätigt. Ferner ergab qPCR CCL11 upregulation auch im congenic peripheren LN im Vergleich zum Wildtyp (wt) Stamm. Schließlich, Western Blot (WB) zeigte signifikant erhöhte Expression des CCL11 Protein in beiden Zielgeweben der Krankheit geschützten congenic Rattenstamm 10. Daher richtet man den Ursprung dieses Chemokin direkt in den Zielgeweben zu untersuchen, und zu diesem Zweck entwickelten wir das hier Doppelfärbungsprotokoll beschrieben. Neben der Vermeidung mechanischer Beschädigung des Gewebes während der Post-mortem-Dissektion und Postfixierung Entkalkung, Gewebeschneide könnte ziemlich schwierig erscheinen. Die Aufteilung erfordert in der Regel Geschick und Übung. Die Qualität der Scheibe hängt von vielen Aspekten such als einen rechten Winkel zwischen dem Gewebeblock und dem Messer , um Einstellen des Drucks aufgebracht auf Probe während des Schneidens, Schnittgeschwindigkeit, usw. Die Dicke der in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten hergestellt von Schlitten - Mikrotom kann von 2 bis 50 um variieren zu reduzieren. Schneiden Paraffingewebescheiben aus einem warmen Wasserbad auf Glasobjektträger vorzugsweise mit einem Klebstoff, wie Poly-L-Lysin oder Aminopropyltriethoxysilan (APTS) beschichtet kommerziell montiert sind einen besseren Halt bei der anspruchsvollen Färbeverfahren zu gewährleisten. Im Gegensatz zu Gewebeschnitten cryo die bei etwa geschnitten -20 ° C Kryoschnittmaschinen gewaschen und bei RT vor der Anfärbung unter Verwendung von gekühlten Paraffinblöcke werden bei RT in Scheiben geschnitten und anschließend getrocknet bei 50- 60 ° C vor der Entparaffinierung. Hochkonservierten Gewebearchitektur, Zellmorphologie und Zielepitope sind essentiell für Proteine ​​Lokalisation und Wechselwirkung der Ziel zu bewerten. Um eine optimale Gewebe preser zu erreichenvierung, haben Proben richtig befestigt werden, entweder Koagulieren oder Vernetzungs Fixative verwendet. Koagulieren Fixiermitteln, wie Ethanol, sind häufiger für die Kryokonservierung verwendet. Proteindenaturierung unter Verwendung von Ethanol 9 durch das Gewebe Entwässerung erreicht; die 16 in unzureichender Zell Erhaltung führen kann. Im Gegensatz zu koagulierenden Fixiermitteln ist Formaldehyd ein Vernetzungs Fixiermittel , die am häufigsten in Routine - Histologie und IHC 9 verwendet wird sowohl für Kryo- und Paraffingewebekonservierung. Wir haben eine optimale Fixierung für die Ratte CNS und LN durch Eintauchen in die Formaldehyd-Lösung für 24 h bei 4 ° C vor der Entkalkung und anschließender Paraffineinbettung erreicht. Trotz verursacht grundlegende Veränderungen in der Konformation von Makromolekülen (Formaldehyd bildet nämlich Methylenbrücken, die Proteine ​​vernetzen und dadurch Antigene maskieren, die spezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern kann), ist diese halb reversible kovalente Reagens liefert hohe Quakeit Gewebeerhaltung. Bemerkenswert ist, Temperatur und Dauer der Fixierung mit Vernetzungsreagenzien können verschiedene Aspekte der IHC wie Schneiden, Epitop-Erkennung beeinflussen und sogar Kreuzreaktivität. Also sowohl Unter Fixierung und Über Fixierung unter Verwendung von Aldehyd-basierten Reagenzien wie Formaldehyd verursachen können Artefakte, die in erster Linie sind aufgrund der Autolyse oder übermäßige Querverbindungen 17, respectively. Trotzdem durch eine unspezifische Hintergrundfärbung zu hydrophobem Protein durch overfixation beobachtete Bindung kann unter Verwendung niedriger gesalzen Puffer enthaltend nichtionische Detergentien verringert werden, oder indem der pH - Wert des Verdünnungspuffers erhöht , wenn polyklonale Abs 18 verwendet wird . Jedoch eine unspezifische Hintergrundfärbung (Rauschen) verursacht durch ionische und elektrostatische Protein - Wechselwirkungen könnten unter Verwendung Verdünnungspuffer mit hoher Ionenstärke verringert, was zugleich das Rauschen durch hydrophobe Proteinbindung 18 verursacht verschlimmern. Wenn es um die Detektion der Ziel Epitope kommt, Formaldehyd-induced Veränderung der Tertiärstruktur von Proteinen sein kann, obwohl nicht vollständig, 19 durch Antigen - Retrieval umgekehrt: i) durch Erhitzen in Puffern mit verschiedenen pH - Werten (wärmeinduzierte Epitopdemaskierung (HIER), ii) durch enzymatischen Abbau (Protease-induzierte Epitopdemaskierung (PIER; 20)), iii) durch Inkubation in stark alkalischen oder sauren Lösung oder Saccharose 21, 22 oder iiii) durch mit konzentrierter Ameisensäure 23 zu behandeln. HIER erscheint praktisch für Mehrheit der Ziel - 19 - Epitope. Neben Erwärmungsdauer, pH-Wert der Lösungen wie EDTA (pH 5,5, 8,5 oder 9,0) oder Natriumcitratpuffer (pH 6.0- 6.2) kann für das Ergebnis von HIER wesentlich sein. Bemerkenswerterweise wurde das befriedigendste Ergebnis in unserer Studie durch Dämpfen, die Proben für 1 Stunde in der EDTA-Lösung mit dem pH-Wert 8,5 erreicht. Obwohl Antikörper gegen die spezifischen Epitope bevorzugt binden, Anziehungs unspezifisch, ähnlich der verwandten Ag BindungsSeiten können nicht ganz ausgeschlossen werden. Bemerkenswert ist , wahrscheinlich die effizienteste Methode für die Hintergrundfärbung zu reduzieren , ist die Inkubation in (in unserer Studie verwendet , wie beispielsweise FCS) Proteine Blockierung vor der Anwendung der primären Abs 9. Monoklonale primäre Abs sind ohnehin über polyklonalen Abs bevorzugt aufgrund höherer Spezifität und dadurch reduziert unspezifische Hintergrundsignal. Trotzdem noch Kreuzreaktivität erscheinen mag, wie monoklonale Abs gegen Epitope gerichtet sind üblicherweise aus einer kleinen Anzahl von Aminosäuren besteht, die 24 ist ein Teil einer anderen (unspezifisch) Protein sein kann. Anders als monoklonale, polyklonale haben Abs eine höhere Chance multiple Isoformen des Zielproteins zu erkennen. Wir haben zunächst zwei verschiedene Primär Abs CCL11 zu erfassen: i) ein polyklonaler Ziege in angehoben und ii) ein monoklonaler Maus in angehoben. In unseren Händen, zeigten beide Produkte die gleiche Färbungsmuster für das Ziel Chemokin. Um die gleichzeitige Co-Färbung durchzuführen, haben wir Ziege-anti Ratte CCL11 Ab in Kombination mit den Antikörpern gegen Iba-1, Ed1 und CD8 verbunden, die alle in der Maus erzeugt wurden. Dennoch neben gleichzeitig können Doppelimmunfärbungs auch nacheinander 25 durchgeführt werden, wie es für die Co-Markierung des primären Abs in der gleichen Art hergestellt erforderlich. Die optimale Arbeitskonzentration der ABS in unserer Studie verwendet wurde, durch Testverdünnungsreihe als ein optimales Verhältnis zwischen der Intensität des spezifischen Signals und des Hintergrundrauschens geschätzt. Es sollte jedoch bedacht werden , dass eine optimale Arbeitskonzentration von dem gleichen Antikörper manchmal zwischen Organen variieren kann, Spezies, Hintergrund Pathologie usw. Insbesondere Permeabilisierung nicht in unserem Färbeverfahren erforderlich wurde in Paraffin eingebettet ausgeführt, 3-5 &amp; mgr; m dicke Gewebeschnitte jedoch Detergentien wie Triton X-100 immer noch verwendet werden könnte Oberflächenspannung zu verringern und somit die Bindung zwischen Antigen und Antikörper zu erleichtern. Auf demVielmehr wird permeabilization- vermittelte Verbesserung der Ab Penetration häufig zum Proteinnachweis erforderlich in kultivierten Zellen oder Zellsuspensionen (Immunzytochemie (ICC)), für die Immunfluoreszenz (IF) in den Kryo-Abschnitte und IHC / IF in frisch (dick, Vibratom-cut) frei schwebenden Gewebeschnitten. Mehrere Kontrollen sind im Wesentlichen wichtig für spezifische / zuverlässige immunotargeting zu erzeugen. Als positive Kontrolle verwendeten wir Lungen aus einem Rattenmodell von Asthma, wo wir CCL11 + Eosinophilen erkennen konnten. Die negativen Kontrollen wurden nur in der Blockierungslösung o / n bei 4 ° C in Abwesenheit des primären Abs inkubiert. Wir haben bereits erwähnt, einige Ursachen und mögliche Abhilfemaßnahmen zur Reduzierung des Hintergrundsignals. Eine unspezifische Immunfärbungs Produkt kann als Reaktions zwischen DAB und Pseudoperoxidase der roten Blutzellen und Peroxidase der myeloischen Zellen treten auch 26. Aktivität dieser Enzyme, ebenso wie die Rausch caused durch endogene Biotin oder AP bereits während Formalin-Fixierung reduziert. Jedoch ist die Vorbehandlung mit Methanol / H 2 O 2 , die für ihre weiteren oder vollständigen Inaktivierung 27, 28 auf . Die Hintergrundfärbung durch die AP - Aktivität in Säugetiergewebe verursacht wird, kann weiter durch Levamisol inhibiert werden 29 oder durch Essigsäure 29. Unspezifische Bindung als Ergebnis ionischer Anziehung zwischen Avidin und entgegengesetzt geladenen zellulären Molekülen 30 können durch Substituieren Avidin aus Eiweiß mit Streptavidin vermieden werden aus Streptomyces avidinii 31. DAB ist wahrscheinlich die am häufigsten verwendete Chromogen in IHC. Neben DAB (braun Reaktionsprodukt), andere Peroxidase Chromogene in Gebrauch sind 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC, rot), 4-Chlor-1-Naphthol (CN, blau) und Tetramethylbenzidin (TMB; blau). Häufigsten gewählten AP Chromogene sind FB, Fast Red (FR), New Fuchsin und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat / Nitro blue Tetrazoliumchlorid (BCIP / NBT). Die Wahl von Enzymen und Chromogenen ist im Allgemeinen eine Sache der individuellen Präferenz, jedoch kann es durch die Zielfunktionen wie Lokalisierung, Expressionsmuster, sondern auch durch die Anwesenheit von endogenen Pigmente (Melanin, Hämosiderin) 32 gesteuert werden. Counterstain ist das letzte, fakultativer Schritt in der IHC Verfahren in der Regel Hämatoxylin unter Verwendung, Kernechtrot oder Methylgrün 18. Im Allgemeinen besser geeignet für die Einzelkennzeichnung erleichtert counterstain die Auslegung der Gewebemorphologie und es sollte auf subtile Weise eine Beeinträchtigung der Chromogen Niederschlag zu vermeiden, entwickelt werden. Nach Abschluss der Färbeverfahren Gewebeschnitten vorsichtig mit einem Deckglas montiert werden sollten ein Befestigungsmedium. Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Neben den physischen Schutz, Eindeckmediums verbessert die Visualisierung und die Qualität der Bildgebung. Entweder organisch / hydrophob oder wässrig / hydrophilen, die choice- des Befestigungsmediums wird in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Endprodukts in dem organischen Lösungsmittel. Während eine Toluol- basierend Eindeckmediums geeignet wäre, beispielsweise für DAB, wässrige Befestigungsmedium kann auf alle enzymatischen Chromogene angewendet werden, einschließlich Fluoreszenzmarkierung.

Trotz Nutzung moderner Hochdurchsatzanalysen auf der Methylom, Transkriptom oder sogar Proteom-Ebene durchgeführt, Immunfärbung bleibt der Goldstandard für die Proteindetektion direkt in der Gewebeprobe, Zellkultur oder einer Zellabstrich. Durch die Offenlegung der Lokalisierung / Verteilungsmuster, Immunhistochemie (IHC) beurteilen kann relativen Verhältnisse und topographischen Zusammenhänge der Zielproteine ​​und sogar zeigen ihre biologischen Aktivitäten. Daher wird IHC breit für klinische und Forschungszwecke verwendet, beispielsweise zur Diagnose, Behandlung Evaluationen Untersuchung von Krankheitsmechanismen, funktionale und phänotypische Veränderungen in Tiermodellen, usw. Im wesentlichen Histologie, Pathologie, Biochemie und Immunologie umfasst, hat IHC signifikant seit 1941 fortgeschritten, wenn fluoreszierend markierte Antikörper zum ersten Mal verwendet wurden 1 Pneumokokken - Antigene in infizierten Gewebe zu identifizieren. Visualisierung von zellulären Produkten und Komponenten durch IHC basiert von Antikörpern (Abs) zu ihrem spezifischen Antigen (Ag) auf die Bindung. Neben der Verwendung von Fluorophor markierten Antikörper können Immunreaktionen auch unter Verwendung von Enzymen wie Peroxidase 2,3 oder alkalische Phosphatase 4 sichtbar gemacht werden. Ferner werden zum Nachweis spezifischer Antigen-Antikörper - Wechselwirkung von Licht und Elektronenmikroskopie, während radioaktive Markierungen sichtbar gemacht werden durch Autoradiographie kolloidales Gold-markiertem Antikörper 5 verwendet. Die Ag-Ab-Immunreaktion kann über direkte und indirekte Methoden erfasst werden. Die direkte Methode ist wesentlich schneller und einfacher, da es direkt primäre Abs 6 beschriftet verwendet. Jedoch aufgrund erheblicher Mangel an Empfindlichkeit, sind indirekte Methoden der direkten diejenigen bevorzugt. Zweischritt indirekten Nachweisverfahren unmarkiert erfordern primäre Abs, wie die erste, und markierten sekundären Abs gegen den primären Abs, als die zweite Schicht 7.Signalverstärkung kann durch die Einbeziehung weiterer, enzymgekoppelter tertiären Ab (dreistufigen indirekten Methode), das bindet an den sekundären Ab erreicht werden. Üblicherweise verwendete indirekte Nachweismethoden sind und Avidin-Biotin-Peroxidase-Antiperoxidase (PAP). Alternativ können alkalische Phosphatase-antialkaline Phosphatase (APAAP) -Komplex anstelle des PAP-Methode verwendet werden. Bemerkenswerterweise scheinen alkalischer Phosphatase (AP) Verfahren sogar als 4 Immunperoxidase Methoden empfindlicher zu sein. Avidin-Biotin-Komplex (ABC) -Methode verwendet biotinylierten sekundären Ab in Kombination mit entweder markiertem Avidin-Biotin-Komplex (LAB) oder Streptavidin-Biotin-Komplex (SLAB) markiert. Nachweisempfindlichkeit kann durch Avidin beteiligt mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiertem 8 erhöht werden. Andere Nachweisverfahren im Einsatz sind polymere Kennzeichnung, Tyramin - Amplifikation und Immuno-Rolling - Circle - 9. Bemerkenswerterweise können verschiedene Detektionsverfahren für mehrere Ag Detektions in demselben Gewebe kombiniert werden,Probe, die zum ersten Mal im Jahr 1978 4. Simultaneous Doppelimmunfärbungs präsentiert die hier berichtet wurde , wurde in Formalin fixierten, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Gewebeschnitten unter Verwendung von Peroxidase-gebundenen und AP-konjugiertem Sekundärantikörper jeweils durchgeführt. Die Signale wurden 3,3&#39;-diaminobencidine (DAB) Chromogen und die Fast Blue (FB) APAAP-Komplex sichtbar gemacht sind.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane 			(Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl 			ether) 
 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan 			(C3H2ClF5O)</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>1001936060</td>
 <td>Eye 			irradiation. Probably influences fertility and damages baby in 			uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing 			environment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodiumchloride 			(NaCl)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.0604</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate 			Buffer Saline (PBS), tablet</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde 			(OH(CH2O)nH (n = 8 - 100), 4% in 1x PBS </td>
 <td>Apl pharma</td>
 <td>34 24 28</td>
 <td>Health 			hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 			&ge;99.5%, absolute (CH3CH2OH)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>459844-1L</td>
 <td>Flamable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene 			(Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>534056</td>
 <td>Flamable. 			Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Histo-Comp 			Paraffin 			Wax</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>V0-5-1001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive 			Microscope Slides</td>
 <td>Starfrost </td>
 <td>MIC-1040-W</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylol 			substitute XEM-200 </td>
 <td>Vogel GmbH</td>
 <td>ND-HS-200</td>
 <td>Respiratory 			sensitization. Carcinogenicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- CD8 			(Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>AbD 			Serotec</td>
 <td>MCA48G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- Iba1 			(AIF1) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>MABN92</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- CD68 			(ED1) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>AbD 			Serotec </td>
 <td>MCA341R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- 			eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody</td>
 <td>Santa Cruz 			BT</td>
 <td>SC-6181</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alkaline 			phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody</td>
 <td>Dakopatts, 			Denmark</td>
 <td>D0314</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotinylated 			secondary antibody</td>
 <td>Amersham 			Biotech</td>
 <td>RPN1025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avidin- 			horseradish peroxidase complex (HRP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Naphthol 			AS-MX phosphate (C19H18NO5P)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N4875-1G</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast Blue 			RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 			x 			1/2 ZnCl2)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>FBS25</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisol 			hydrochloride (C11H13ClN2S)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31742</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3,3'-Diaminobenzidine 			tetrahydrochloride (DAB Chromogen)</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>S3000 </td>
 <td>Highly 			flammable. Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 			sulphate (CuSO4)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.02791</td>
 <td>Acute 			toxicity. Environmental hazzard.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GelTol 			Aqueous Mounting Medium</td>
 <td>Thermo 			Electron Corporation</td>
 <td>230100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen 			peroxide, 30% (H2O2)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>107210</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol 			(CH3OH)</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>65543</td>
 <td>Acute 			toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 			(hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 			)</td>
 <td>AppliChem </td>
 <td>A1379</td>
 <td>Skin and 			eye irritation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 			Buffered Saline (TBS), tablet</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T5030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Di- Sodium 			hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 			x 			2H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.0658</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium 			dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 			x 			1H2O) </td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.06346</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf 			serum (FCS) </td>
 <td>Cambrex 			BioScience</td>
 <td>DE-14-802F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAKO 			cytomation wash buffer 10x </td>
 <td>DAKO </td>
 <td>S3006</td>
 <td>Should be 			stored at 2-8 &deg;C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N- 			Dimethylformamide; DMF (C3H7NO)</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>40250</td>
 <td>Flammable. 			Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glas 			coverslips 24 x 36 mm </td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 <td>BB024036A1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric acid, conc. (HCl)</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>30721</td>
 <td>Corrosive, 			irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric acid solution 			volumetric, 2M HCl (2N) </td>
 <td>Fluka </td>
 <td>71826</td>
 <td>Corrosive, 			irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium 			nitrite, ReagentPlus, &ge;99.0% (NaNO2)</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S2252 </td>
 <td>Oxidant. 			Toxic. Dangerous for the environment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenedinitrilotetraacetic 			acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 			x 2H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.08454</td>
 <td>Oral 			exposures may cause reproductive and developmental effects.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 			V.I.P 			Vacuum Infiltration Processor </td>
 <td>Sakura</td>
 <td>5902 VIP 			Jr. 115 V, 60 Hz</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hacker-Bright 			8000 Series Base Sledge Microtome </td>
 <td>Hacker 			instruments</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Household 			food steamer </td>
 <td>Braun</td>
 <td>MultiGourmet 			FS 20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Light 			microscope </td>
 <td>Leica 			Polyvar 2</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

immunohistochemical analysis in the rat central nervous system and peripheral lymph node tissue sections

Immunhistochemie (IHC) bietet hochspezifische, zuverlässige und attraktive Protein-Visualisierung. Korrekte Durchführung und Interpretation einer IHC-basierten Mehrfarbenkennzeichnung ist anspruchsvoll, insbesondere dann, wenn für die Beurteilung der Zusammenhänge zwischen Zielproteine ​​in das Gewebe mit einem hohen Fettgehalt, wie beispielsweise das zentrale Nervensystem (ZNS) verwendet. Unser Protokoll stellt eine Weiterbildung der Standard Immunomarkierung Technik besonders angepasst für den Nachweis von sowohl strukturelle als auch lösliche Proteine ​​in der Ratte ZNS und peripheren Lymphknoten (LN) durch Neuroinflammation betroffen. Dennoch mit oder ohne weitere Modifikationen, könnte unser Protokoll wahrscheinlich für die Erkennung von anderen verwandten Protein-Targets verwendet werden, auch in anderen Organen und Arten als hier dargestellt.

Doppelimmunfärbungen (co-Anfärbungen) wurden in Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Ratten CNS und LN Abschnitten durchgeführt. 3-5 um dicke Gewebeschnitte wurden mit einem Schlitten Mikrotom geschnitten, vorbeschichtete Klebeglasobjektträger aufgebracht anschließend auf und behandelt wie zuvor 10,11,12 beschrieben. Kurz gesagt, nach deparaffinizing, Gewebe Rehydratation und endogene Peroxidase Inaktivierung wurden die Schnitte auf den Antigen-Retrieval-Verfahren unterzogen wird, durch ein Blockierungsschritt folgen unspezifische Bindungsstellen zu beseitigen. i) CCL11 / Iba-1, ii) CCL11 / Ed1 und iii) CCL11 / Cd8: Die Co-Anfärbungen wurden in den folgenden Kombinationen durchgeführt. Der primäre Abs für jeden Co-Färbung verwendet wurden in zwei verschiedenen Arten (Ziege und Maus bezeichnet) erhöht, wodurch ihre gleichzeitige Inkubation aktiviert. CCL11 wurde durch die braune Peroxidase Reaktionsprodukt sichtbar gemacht, während Iba-1, Ed1 und Cd8, durch das blaue AP Signal sichtbar gemacht wurden. <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits im Detail und in einem größeren Zusammenhang in unserer jüngsten Studie über die Rolle des CCL11 Chemokin bei Multipler Sklerose (MS) -ähnlichen neuroinflammation 10 beschrieben. Gemäß der IHC in der Ratte durchgeführten Analysen CNS war CCL11 in pericarya, Dendriten und Axone der Neuronen in den ventralen Hörnern des Rückenmarks grauen Substanz (1A und B) angeordnet sind . Außerdem wurden einzelne CCL11 + Plasmazellen nachweisbar in den gleichen Gewebeabschnitten (1A), sowie einzelne CCL11 + / Ed1 + Makrophagen und Gehirn resident Mikroglia an der Entzündungsstelle beobachtet (Daten nicht gezeigt; Ed1 ist ein Marker von lysosomalen Proteins in aktivierten Makrophagen und Mikroglia 13). Bemerkenswerterweise wurde CCL11 Chemokin nicht co-lokalisierenden mit Iba-1 + Makrophagen und Mikroglia Gehirn resident (1A gefunden; Iba-1 ist ein Marker für das Erfassen ionisiert Ca 2+ -bindi<html> ng Protein 14). IHC-basierten Protein - Targeting in Umfangs Ratte LN ausgeführt CCL11 Protein Kolokalisation mit Ed1 (2B) gezeigt. Es wurden jedoch keine CCL11-sezernierenden CD8 + T - Lymphozyten nachweisbar in den gleichen Gewebeabschnitte (2A; CD8 + -Zellen wurden nachgewiesen unter Verwendung von anti-CD8a, Marker für überwiegend zytotoxische T - Zellen , die an MHC - Klasse - I - Moleküle binden , 15). Mit Ausnahme der Weglassung Primär Abs während o / n Inkubation in der Blockierungslösung wurden die Steuerabschnitte in dem Protokoll beschrieben behandelt. Keine Erfassungssignale der Zielproteine (wie in der 1A dargestellt, B und 2A, B) wurden in das ZNS und LN Steuerabschnitten (1C bzw. 2C) beobachtet. s / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1 : A, B: Doppel Immunostaining in der Ratte LN. Primäre Antikörper , der gegen das Chemokin CCL11 in Kombination mit entweder α-CD8 (A) oder Ed1 (B). . CCL11 Detektionssignal (braun) co-lokalisierenden mit dem Marker für eine lysosomale Protein in Makrophagen (Ed1, blau): keine Co-Lokalisierung innerhalb der gleichen Zelle wurde für CCL11 + (braun) und CD8 + Zellen (blau) B beobachtet. C: Negativkontrolle; ein Detail unmarkierten resident Zellen im peripheren LN zeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50425/50425fig2.jpg" /> Abbildung 2. A, B: Doppel Immunostaining in der Ratte Spinal Cord. Ventralhorn der grauen Substanz ausstellenden CCL11 in neuronalen pericarya, Dendriten und Axone (braun) co-gefärbt mit entweder Iba-1 + (A; blau) oder ED1 + (B; blau) Makrophagen / Mikroglia - Zellen . C: Negativkontrolle; ein Detail unmarkierten residenten Zellen im Vorderhorn des Rückenmarks grauen Substanz zeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections at JoVE.com

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K Aufrufe.  Karolinska Institutet. We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Serie: Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...