Diese Arbeit wurde von Jugendprogramm "1000plan", die Startup-Fonds von der Tongji-Universität und NSFC Grant # 21607115 und 21777116 (Lin) unterstützt.

1. Design und Fertigung von einem Zebrafish Embryos anordnen Vorlage
<ol><li>
Entwerfen Sie die arraying Vorlage mit einem 12 x 8, 96-Well-Layout, das eine standard 96-Well-Platte passt. Verwendung der Dimensionen in Figur 1A für die oberen Embryo Einklemmung Kammer aufgeführt (siehe auch die ergänzenden Datei).
	<ol>
<li>Verwenden Sie die Maße, die in Abbildung 1 b und 1D für die Verlockende Falle gut gezeigt.</li>
		<li>Verwenden Sie die Maße für die Vakuumkammer unten in Abbildung 1 .</li>
		<li>Verwenden Sie die Maße für die Luft im in Abbildung 1 b / Outlet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie einen 3D-Drucker (mit 0,1 mm Genauigkeit) die Vorlage drucken; siehe Tabelle der Materialien für empfohlene Harz für den Druck verwendet werden. Hinweis: 3D Drucker mit einer Genauigkeit von 0,1 mm werden für die Herstellung der arraying Vorlage empfohlen (siehe Tabelle der Materialien). Die empfohlene Farbe für die Fläche der Vorlage ist dunkelgrau oder schwarz.</li>
</ol>(2) Zebrafischembryo Laichen
<ol><li>Legen Sie zwei Paare von männlichen und weiblichen Fische pro Paarung Box einen Tag vor der Laichzeit. Getrennten Männchen und Weibchen durch einen durchsichtigen Kunststoff Teiler.</li>
	<li>Nehmen Sie den Teilern morgens, männliche und weibliche Fische zu mischen.</li>
	<li>Entfernen Sie die männlichen und weiblichen Fische und sammeln Sie Zebrafisch-Embryonen mit einem feinmaschigen Sieb zu. Waschen Sie die Embryonen mit Ei 250 mL Wasser (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Übertragen Sie die gesammelten Embryonen auf Petrischalen (90 mm Durchmesser) mit Holtfreter Lösung (siehe Tabelle der Materialien) und Tote und unbefruchtete Embryonen mit einem Stereomikroskop zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die Embryonen in einem Inkubator 28,5 ° C. Um 4 Uhr post Düngung (hpf), beobachten die Embryonen und entfernen Sie alle Toten und ungesunden Embryonen. Die Embryonen sind nun bereit für den nächsten Schritt.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Vorlage anordnen
<ol><li>Waschen Sie die Vorlage 2 – 3 Mal mit 500 mL entionisiertem Wasser und steckte es in den Trockenofen (45 ° C) für 5 min.</li>
	<li>Kleben Sie die untere Kammer mit einem Stück des Versiegelns Film (Bild 2Schritt 1).</li>
	<li>Verbinden Sie eine Vakuum-Pumpe durch den Luftauslass an der Unterseite der Vorlage. Hinweis: Die empfohlene max. Vakuum für die Vakuumpumpe ist 0,1 Mpa. Beachten Sie die Stärke des Vakuums verwendet. Wenn der Unterdruck zu stark ist, schneiden Sie eine kreuzförmige Loch auf der Siegelfolie, den Druck zu senken.</li>
</ol>4. Anordnung Zebrafish Embryos in einer 96-Well-Platte
<ol><li>Mit einer Kunststoff transferpipette, legen Sie ca. 150 Embryonen in die Vorlage, wie in Abbildung 2, Schritt2 gezeigt.</li>
	<li>Verbinden Sie die Vakuumpumpe bis zum ausblas Unterdruck in der Kammer von der Siegelfolie in Schritt 3.3 versiegelt zu generieren.</li>
	<li>Schütteln Sie die gesamte Vorlage horizontal, bis jeder auch ein Embryo gefangen (Abbildung 2, Schritt 3 hat). Hinweis: Wenn die Holtfreter Lösung trocknet, bevor die Embryonen in jedem Bohrloch gefangen sind, fügen Sie zusätzliche Holtfreter Lösung in der Einklemmung Kammer hinzu und wiederholen Sie diesen Schritt.</li>
	<li>Entsorgen Sie zusätzliche Holtfreter Lösung und Embryonen, die nicht in den Brunnen (Abbildung 2, Schritt 4) eingeschlossen sind.</li>
	<li>Schalten Sie aus und trennen Sie die Vakuumpumpe.</li>
	<li>Legen Sie eine standard 96-Well-Platte umgedreht gegen die Vorlage (Abbildung 2, Schritt 5) und drehen Sie beide zur gleichen Zeit (Abbildung 2, Schritt 6).</li>
	<li>Tippen Sie auf der Unterseite der Vorlage oder die Luft verbinden Steckdose, um ein komprimiertes Gas Abstauben kann um alle eingeschlossenen Embryonen aus der Vorlage auf die 96-Well-Platte (Abbildung 2, Schritt 6) übertragen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.1 bis 4,8, zusätzliche Multi-well-Platten vorzubereiten.</li>
	<li>Der Siegelfolie entfernen und Waschen der Vorlage 3 Mal von oben bis unten mit 500 mL entionisiertem Wasser für eine spätere Verwendung. Hinweis: Verwenden Sie organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, nicht um die Vorlage zu reinigen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments.">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Transformation,+Speciation,+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent.">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract.">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles.">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li><li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+(nanotomy)+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain.">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials.">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid,+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules.">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li><li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben ein Patent auf die beschriebenen 3D-gedruckten Vorlage gefüllt.

Es gibt zwei wichtige Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit für eine erfolgreiche Umsetzung der 3D-Druck Vorlage erfordern für Anordnung Zebrafisch-Embryonen.
Der wichtigste Faktor auf die Gestaltung der arraying Vorlage ist die Einklemmung. Macht sicher gibt es nur einen Embryo in jedes gut gefangen, man sollte achten Sie besonders auf den Durchmesser und die Tiefe des Brunnens Verlockende Falle, und der Durchmesser der Durchgangsöffnung. Der empfohlene Durchmesser ist innerhalb von 1,5 bis 2-fache des Durchmessers eines typischen Embryos (einschließlich der Chorion). Die Tiefe der Einklemmung gut sollte innerhalb 2 Mal des Durchmessers eines typischen Embryos (einschließlich der Chorion) zur Vermeidung von Embryonen in der gleichen gut stapeln. Der Durchmesser der Durchgangsöffnung sollte etwa die Hälfte des Durchmessers eines typischen Embryos (einschließlich der Chorion) Embryonen verdrängt durch das Loch durch den Unterdruck zu vermeiden. Aufgrund der Komplexität des Entwurfs wird für die Fertigung der arraying Vorlage 3D-Drucktechnologie empfohlen.
Das Wesen der arraying Vorlage soll einzelnen Embryonen an bestimmten Standorten, d.h. Positionen zu fangen, die mit einem 96 oder 384-Well-Platte passen. Erstellen Sie einen richtigen Unterdruck an die einzelnen Embryonen in Position zu halten, ohne sie zu beschädigen, muss man den Unterdruck erzeugt durch die Vakuum-Gerät einstellen. Zu viel Druck kann die Embryonen zerstören, während zu wenig Druck nicht sie in den Brunnen fangen kann. Daher ist es dringend empfohlen, zu beobachten, die Embryonen vor der Übertragung in die multiwell-Platten in der Vorlage unter einem Stereomikroskop gefangen. Darüber hinaus könnte die Embryonen während Einklemmung, an der Luft während dieses Prozesses ausgesetzt werden. Sollte dies geschehen, fügen Sie zusätzliche Holtfreter Mittel in der Einklemmung Kammer gemäß Schritt 4.3. Auch wegen der Möglichkeit von Embryonen, die an der Luft ausgesetzt wird, funktioniert das aktuelle Protokoll auf Dechorionated Zebrafish Embryos nicht.
Die arraying Vorlage in dieser Arbeit präsentierte bietet einen innovativen Ansatz für eine Low-Cost- und Hochdurchsatz-Screening-Plattform mit Zebrafisch-Embryonen zu etablieren. Im Vergleich zu vorher festgelegten Roboter-Plattformen oder im Handel erhältlichen Flow Cytometry-basierten Instrument, diese Methode ist einfach zu bedienen und erfordert keine anspruchsvolle Ausbildung. Nehmen Vorteile der 3D Druck Technologie, könnte man das Format der arraying Vorlage für verschiedene Zwecke passen problemlos ändern.
Die Vorlage und das Protokoll in seiner jetzigen Form benötigen noch einige manuelle Arbeit. Straffung des Verfahrens weiter den Durchsatz verbessern und erhöhen Sie die Menge der multiwell-Platten innerhalb kurzer Zeit vorbereitet.

Als beliebter Modellorganismus ist in den Bereichen Medizin und Toxikologie1,2,3,4Zebrafisch verbreitet. Im Vergleich zu in-vitro- Plattformen, Zebrafisch bieten viel höherer biologischen Komplexität, dass ein oder zwei Zelltypen nicht bieten konnte. Abgesehen davon, dass ein Organismus, Modell, dem Zebrafisch-große Fruchtbarkeit, schnelle und gleichzeitige Embryonalentwicklung und hohen Orgel Transluzenz haben gegeben, dieses Modell einzigartige Vorteile für groß angelegte Toxizität oder Drogen/Verbund screening-5verwendet werden. Die Hunderte von Embryonen, die jede Woche von ein paar Erwachsene Zebrafisch produziert haben übertreffen alle anderen ganz Tiermodellen und es für Hochdurchsatz-Screening geeignet.
Eine typische Screening-Verfahren mit Zebrafisch beinhaltet eine erhebliche Menge an Handarbeit, wie Erwachsene Zebrafisch laichen, Embryo Auswahl und Anordnung von Embryonen in geeigneten Behältern, wo sie auf die Exposition durch Eintauchen in Wasser ausgesetzt sind. Die Entwicklung der Embryonen wird überwacht und beobachtbaren Endpunkte wie Sterblichkeit, Schlupfrate und Anomalie sind oft manuell ausgewertet und als vorläufige Identifikationen der Toxizität von Chemikalien oder Hinweise auf die Wirksamkeit der Drogen oder Verbindungen. Um die Screening-Verfahren zu beschleunigen, wurden zuvor Ansätze wie automatisierte Imaging- und computergestützte Bildanalyse untersucht. Beispielsweise wurden Mikroskope mit hohem Gehalt imaging-Funktionen führen Sie automatisierte Hellfeld oder Fluoreszenz-Bildgebung auf Zebrafish Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien von 96/384-well-Platten6angepasst. Mikrofluidische Geräte gepaart mit Mikroskopen dienten zebrafischlarven durch aktuellen Bearbeitung für die Bildgebung des Gehirns Neuronen7positionieren. Diese Ansätze könnten die Effizienz der Bild Akquisitionen im Vergleich zum traditionellen manuellen Betrieb erheblich verbessern. Darüber hinaus wurden mit großen Anzahl von Bildern erzeugt werden, Bild-Analyse-Tools auch entwickelt, um die Verarbeitung der Daten zu beschleunigen wie Liu Et Al. und Tu Et Al. zeigen 8 , 9.
Der Durchsatz der Bildverarbeitung und Bildanalyse erhöht, wurde es klar, dass die Bandbreitenbegrenzung Schritt für das Screening liegt in den Prozess der Exposition, die in der Regel bedeutet, wobei sie in 96 oder 384-Well-Platten Zebrafish Embryos vorbereiten. Um diesen Engpass Schritt zu lösen, Vision-geführte Robotik von Mandrell Et Al. entwickelt wurden 10 und uns11 zuvor, manuelle Handhabung aber die Instrumente zu ersetzen waren eher anspruchsvoll und es gibt eine Tiefe Lernkurve, solche Techniken umzusetzen. Daher bieten ein easy-to-Use-Ansatz ist ein wichtiger Faktor, der Durchsatz Zebrafisch-Screening weiter zu verbessern und das Hauptziel dieser Arbeit ist.
In dieser Arbeit wir konstruiert und gefertigt einen Embryo, die Vorlage von 3D-Druck anordnen. Eine arraying Vorlage wurde entwickelt, um Zebrafish Embryos in Vertiefungen, die mit einer standard 96-Well-Platte passen zu fangen. Anstelle von Embryonen auswählen und anordnen sie in einzelnen Brunnen eins nach dem anderen, könnte man Embryo Einschluss und Array alle 96 Embryonen in einem mehrlagigen Teller auf einmal durchführen. Mit dieser Vorlage und das folgende Protokoll, konnte man deutlich steigern die Effizienz der Embryonen in mehrlagigen Platten, die im Begriff Schub würde die Screening-Kapazität mindestens das Zehnfache, im Vergleich zu manuellen Betrieb anordnen. Die nachfolgend beschriebene Protokoll beinhaltet eine Gesamtkonzeption für die Anordnung der Vorlage, Zebrafisch laichen, Embryo-Sammlung und Anordnung. Abbildung 1 zeigt das gesamte Design der arraying Vorlage. Abbildung 2 zeigt eine Übersicht des Protokolls Schritt für Schritt über die Verwendung der Vorlage in den Teilen 3 und 4 beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Facility</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>Mating box</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottle, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Vetec</td><td>v900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>Sea Salts</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Biochemical incubator</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>Photosensitive resin</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive PCR Plate Seals</td><td>Solarbio</td><td>YA0245</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Multi 8-channel pipette 30 - 300 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>Compressed Gas Duster</td><td>Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>Drying oven</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>System water</td><td></td><td></td><td>Water out of the facility&amp;rsquo;s water system</td></tr><tr><td>Egg water</td><td></td><td></td><td>Dilute 60mg &amp;ldquo;Instant Ocean&amp;rdquo; sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water</td></tr><tr><td>Holtfreter&amp;rsquo;s solution</td><td></td><td></td><td>Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water</td></tr></tbody></table>

a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying

Der Zebrabärbling ist ein weltweit anerkannter Süßwasser Organismus häufig in Entwicklungsbiologie, Umwelttoxikologie und Krankheit beim Menschen verwandten Forschungsgebieten. Dank seiner einzigartigen Eigenschaften, einschließlich große Fruchtbarkeit, Embryo Transluzenz, schnelle und gleichzeitige Entwicklung, etc.Zebrafisch-Embryonen werden häufig verwendet für groß angelegte Toxizität Bewertung von Chemikalien und Drogen/Compound Screening. Eine typische Screening-Verfahren beinhaltet Erwachsenen Zebrafisch laichen, Embryonen Auswahl und Anordnung der Embryonen in Multi-well-Platten. Von dort aus Embryonen sind Belichtung und die Toxizität von Chemikalien ausgesetzt, oder die Wirksamkeit der Medikamente/Verbindungen kann relativ schnell anhand der phänotypischen Beobachtungen ausgewertet werden. Zwischen diesen Prozessen ist Embryonen anordnen eine zeitraubende und arbeitsintensive Schritte, die den Durchsatz begrenzt. In diesem Protokoll präsentieren wir ein innovatives Konzept, das macht die Verwendung einer 3D-gedruckten arraying Vorlage in Verbindung mit-Manipulation Vakuum um diesen mühsamen Schritt zu beschleunigen. Das Protokoll hierin beschreibt das Gesamtdesign der arraying Vorlage, eine detaillierte Versuchsaufbau und Schritt für Schritt Verfahren, gefolgt von repräsentative Ergebnisse. Bei der Implementierung sollte dieser Ansatz in einer Vielzahl von Anwendungen in der Forschung mit Zebrafisch-Embryonen als Tests Themen vorteilhaft.

Abbildung 3 zeigt eine typische 3D-gedruckten arraying Vorlage. Diese Vorlage verwendet lichtempfindliche Harz als Rohstoff und wurde von einem 3D-Drucker gemacht; eine Schicht aus schwarzem Lack wurde angewandt, um einen besseren Kontrast zur Farbe der Embryonen zur Verfügung zu stellen. Die Position von 96 Wells (12 x 8) wurde entwickelt, um mit einer standard 96-Well-Platte passen. Ebenso eine 384 (24 x 16) gut Vorlage könnte auch so konzipiert und hergestellt unter Verwendung der gleichen Methode. Der Vorteil Kammer war etwas größer als ein standard 96-Well-Platte, bieten eine optimale Passform. Nuten wurden auch entwickelt, um die zusätzlichen Embryonen während der Anordnung zu halten.
Zu einem bescheidenen Preis konnte 20 Platten vorbereitet werden, der Bohrschablone 3D-gedruckten arraying innerhalb von 30 Minuten, während nur zwei bis drei Platten manuell vorbereitet werden konnte. Tabelle 1 zeigt einen Vergleich zwischen manuellen, Roboter und Anordnung Vorlage Operationen. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich zwischen zwei Platten, angeordnet von der 3D-gedruckten arraying Vorlage, manuell vorbereitet. Mit der arraying Vorlage gab es eine vernachlässigbare Menge Flüssigkeit übertragen mit den Embryonen, die auch es bequem für weitere Belichtung Experimente gemacht.
Abbildung 5 zeigt, dass gab es keine wesentlichen Auswirkungen auf den allgemeinen Gesundheitszustand der Embryonen nach wird durch manuelle und Anordnung Vorlage Verfahren überzogen. Um sicherzustellen, dass die Embryonen nicht durch einen arraying Prozess betroffen waren, folgten wir Entwicklung des Embryos nach Anordnung sie in 96-Well-Platten für 3 Tage. Die Schlupfrate, Überlebensrate und Fehlbildung Rate von Zebrafisch-Embryonen am 24, 48 und 72 hpf waren vergleichbar mit den Embryonen manuell angeordnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig1.jpg"> Abbildung 1: Entwurf eines Zebrafish Embryos Vorlage anordnen. (A und C) 3-d Max Zeichnung zeigt die Übersicht der Vorlage. (B) Querschnitt der Vorlage anzeigen (D) eine eingeschränkte Sicht auf die Vorlage. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig2.jpg"> Abbildung 2: typische Schritte bei der Verwendung der Vorlage arraying. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig3.jpg"> Abbildung 3: Fotos einer 3D-gedruckten arraying Vorlage. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig4.jpg"> Abbildung 4: mikroskopische Aufnahmen von Embryonen nach 96-Well-Platte übertragen. (A) teilweise Bild einer 96-Well-Platte angeordnet von der Vorlage. (B) teilweise Bild einer 96-Well-Platte manuell angeordnet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig5.jpg"> Abbildung 5: der allgemeine Gesundheitszustand der Embryonen nach wird durch manuelle und Anordnung Vorlage Methoden vernickelt. Basierend auf den Schlupf, abnormal, und Überlebensraten der Embryonen nach dem verchromt mit Handbuch oder die arraying Vorlage-Methoden, keine wesentlichen Auswirkungen auf den Gesamtzustand der Embryonen wurden in beiden Fällen beobachtet. Fehlerbalken sind Standardabweichungen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td style="text-align: center;">Manuell</td>
			<td style="text-align: center;">Roboterplattform</td>
			<td style="text-align: center;">Anordnung der Vorlage</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beschichtung-Zeit</td>
			<td style="text-align: center;">10-30 min/Platte</td>
			<td style="text-align: center;">5 – 10 min./Platte</td>
			<td style="text-align: center;">1 – 2 min./Platte</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kosten</td>
			<td style="text-align: center;">Low</td>
			<td style="text-align: center;">Hoch</td>
			<td style="text-align: center;">Low</td>
		</tr>
<tr>
<td>Erforderliche Ausbildung</td>
			<td style="text-align: center;">Mindestens</td>
			<td style="text-align: center;">Hoch</td>
			<td style="text-align: center;">Minimum</td>
		</tr>
<tr>
<td>Arbeiten Bereich</td>
			<td style="text-align: center;">Kleine</td>
			<td style="text-align: center;">Große</td>
			<td style="text-align: center;">Kleine</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wirkung auf die Embryonen</td>
			<td style="text-align: center;">Wenig bis keine</td>
			<td style="text-align: center;">Wenig bis keine</td>
			<td style="text-align: center;">Wenig bis keine</td>
		</tr>
<tr>
<td>Flüssigkeitsmenge pro Bohrloch hinzugefügt</td>
			<td style="text-align: center;">Zufällige</td>
			<td style="text-align: center;">5 – 10 ΜL</td>
			<td style="text-align: center;">Mindestens</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Vergleich der manuellen, Roboter und Anordnung Vorlage Operationen.

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A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fertigen eine zebrafischembryo Vorlage, gefolgt von ein detailliertes Verfahren für die Verwendung dieser Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos Anordnung in einer 96-Well-Platte anordnen.

Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

a-3-dimensional-3d-printed-template-for-high-throughput-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

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Serie: A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Forschung

Genetik

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Entwicklungsbiologie

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Verfeinertes Multiview-Lichtblattmikroskopie-Protokoll für Zebrafischembryonen

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Strategien für die Montage von Zebrafischembryonen für die hochauflösende Multiview-Lichtblattmikroskopie — Techniken zur Bildgebung und Bild

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Chirurgische Größenreduktion von Zebrafischen für die Erforschung der embryonalen Muster Skalierung

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen