هذا العمل كان يدعمها البرنامج "1000plan الشباب" و "أموال بدء التشغيل" من جامعة تونغجى، وتشرف منحة # 21607115 21777116 (لين).

1-التصميم والتصنيع الأجنة الزرد أرايينج قالب
<ol><li>
تصميم قالب أرايينج مع 12 من 8، 96-جيدا التخطيط الذي يناسب لوحة 96-جيدا قياسية. استخدام الأبعاد المذكورة في الشكل 1A للدائرة الفخ الجنين العلوي (انظر أيضا الملف التكميلي).
	<ol>
<li>استخدام الأبعاد المبينة في الشكل 1 باء و دال 1 للفخ جيدا.</li>
		<li>استخدام الأبعاد في الشكل 1 للدائرة فراغ أسفل.</li>
		<li>استخدام الأبعاد في الشكل 1B للهواء في/منفذ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>استخدام طابعة 3D (بدقة 0.1 ملم) لطباعة القالب؛ انظر الجدول للمواد الراتنج الموصى بها لاستخدامها للطباعة. ملاحظة: يوصي بالطابعات ثلاثية الأبعاد بدقة 0.1 مم لتصنيع قالب أرايينج (انظر الجدول للمواد). اللون المقترح لسطح القالب هو رمادي داكن أو أسود.</li>
</ol>2-الزرد الجنين التفريخ
<ol><li>مكان اثنين من أزواج من سمك الذكور والإناث للتزاوج مربع قبل التبويض بيوم واحد. منفصلة من الذكور والإناث بمقسم بلاستيك الشفاف.</li>
	<li>الإقلاع الفواصل في الصباح لخلط الأسماك الذكور والإناث.</li>
	<li>إزالة الأسماك الذكور والإناث وجمع الزرد الأجنة باستخدام مصفاة مش غرامة. أغسل الماء الأجنة مع البيض 250 مل (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>نقل الأجنة التي تم جمعها إلى أطباق بتري (90 ملم في القطر) مع الحل في هولتفريتير (انظر الجدول للمواد) وإزالة أجنة ميتة والمخصبة باستخدام ستيريوميكروسكوبي.</li>
	<li>وضع الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية. في ح 4 وظيفة التسميد (hpf) ومراقبة الأجنة وإزالة أي أجنة ميتة وغير صحية. الأجنة الآن جاهزة للخطوة التالية.</li>
</ol>3-إعداد أرايينج القالب
<ol><li>أغسل القالب 2 – 3 مرات بواسطة 500 مل من الماء ووضعه في فرن التجفيف (45 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>الشريط الدائرة السفلي مع قطعة من ختم الفيلم (الشكل 2، الخطوة 1).</li>
	<li>قم بتوصيل مضخة الفراغ من خلال منفذ الهواء في الجزء السفلي من القالب. ملاحظة: الفراغ الحد الأقصى الموصى به لمضخة فراغ هو 0.1 الآلام والكروب الذهنية. كن على علم من قوة الفراغ المستخدمة. إذا كان الضغط السلبي قوية جداً، قطع حفرة على شكل الصليب على الفيلم الختم إلى انخفاض الضغط.</li>
</ol>4-أرايينج "الأجنة الزرد" إلى لوحة 96-جيدا
<ol><li>استخدام ماصة نقل بلاستيك، مكان حوالي 150 الأجنة في القالب، كما هو موضح في الشكل 2، الخطوة 2.</li>
	<li>قم بتوصيل مضخة فراغ مخرج الهواء لتوليد ضغط سالب في قاعة مختومة بختم الفيلم في الخطوة 3، 3.</li>
	<li>هز القالب كامل أفقياً حتى كل جيدا على الجنين واحد أكمنة (الشكل 2، الخطوة 3). ملاحظة: إذا كان حل هولتفريتير يجف قبل الأجنة محاصرون في كل بئر، إضافة الحل إضافية هولتفريتير في غرفة الفخ وكرر هذه الخطوة.</li>
	<li>تجاهل حل إضافي هولتفريتير والأجنة التي هي شرك لا في الآبار (الشكل 2، الخطوة 4).</li>
	<li>قم بإيقاف تشغيل وقطع مضخة فراغ.</li>
	<li>ضع لوحة 96-جيدا قياسية رأسا على عقب ضد القالب (الشكل 2، الخطوة 5) وتدوير كليهما في نفس الوقت (الشكل 2، الخطوة 6).</li>
	<li>اضغط على الجزء السفلي من القالب أو توصيل الهواء منفذ للغبار غاز مضغوط يمكن نقل الأجنة جميع المحاصرين من القالب إلى لوحة 96-جيدا (الشكل 2، الخطوة 6).</li>
	<li>كرر الخطوة 4.1 إلى 4.8 لإعداد إضافية من لوحات متعددة جيدا.</li>
	<li>إزالة الفيلم الختم وغسل القالب 3 مرات من أعلى إلى أسفل مع منزوع 500 مل من الماء للاستخدام في المستقبل. ملاحظة: لا تستخدم أي من المذيبات العضوية، مثل الإيثانول، لتنظيف القالب.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments.">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Transformation,+Speciation,+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent.">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract.">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles.">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li><li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+(nanotomy)+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain.">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials.">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid,+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules.">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li><li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li></ol>

وقد شغل المؤلفين براءة في وصف قالب طباعة 3D.

هناك اثنين من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب اهتماما وثيقا لتنفيذ ناجح لقالب طباعة 3D أرايينج الأجنة الزرد.
هو العامل الأكثر أهمية في تصميم القالب أرايينج الفخ أيضا. يجعل بالتأكيد هناك جنين واحد فقط محاصرين في كل بئر، واحدة ينبغي إيلاء اهتمام وثيق للقطر وعمق البئر الفخ، والقطر من خلال ثقب. القطر الموصى بها ضمن 1.5 إلى 2 مرات قطر جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة). ينبغي أن يكون عمق الفخ جيدا داخل 2 مرات قطر جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة) لتجنب التراص الأجنة في البئر نفسها. القطر من خلال ثقب ينبغي أن يكون قرابة نصف قطرها جنينا النموذجية (بما في ذلك المشيمة) تفادي الأجنة التي تقلص من خلال الثقب بالضغط السلبي. نظراً لتعقيد التصميم، ينصح بتقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد لتصنيع قالب أرايينج.
هو جوهر القالب أرايينج إيقاع الأجنة الفردية في مواقع محددة، أي الوظائف التي تناسب مع صفيحة 96-أو 384 جيدا. لخلق ضغط سلبي مناسبة لعقد الأجنة الفردية في المكان دون الأضرار بها، واحدة يجب ضبط الضغط السلبي التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز الشفط. قد تدمر الكثير من الضغوط الأجنة، بينما الضغط قليلاً جداً قد لا اعتراض عليها في الآبار. ولذلك، ينصح بشدة لمراقبة الأجنة أكمنة في القالب تحت ستيريوميكروسكوبي قبل تحويلها إلى لوحات مولتيويل. وعلاوة على ذلك، خلال الفخ، الأجنة قد يتعرض للهواء أثناء هذه العملية. وإذا حدث ذلك، أضف إضافية هولتفريتير المتوسطة في قاعة الفخ وفقا للخطوة 4، 3. أيضا، بسبب احتمال الأجنة التعرض إلى الهواء، البروتوكول الحالي لا يعمل على ديتشوريوناتيد الزرد الأجنة.
يوفر هذا القالب أرايينج قدم في هذا العمل نهجاً مبتكراً لإنشاء منصة فحص منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية باستخدام أجنة الزرد. مقارنة بالمنصات الآلية المحددة سابقا أو الصك على أساس قياس تدفق المتاحة تجارياً، هذا الأسلوب هو سهل الاستخدام ولا يتطلب التدريب المتطور. أخذ مزايا تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد، واحد يمكن بسهولة تغيير تنسيق القالب أرايينج لتناسب أغراض مختلفة.
القالب والبروتوكول في شكله الحالي لا يزال يتطلب بعض العمل اليدوي. تبسيط الإجراء يمكن زيادة تحسين مستوى الإنتاجية وزيادة كمية ألواح مولتيويل التي أعدت خلال فترة قصيرة من الزمن.

ككائن نموذج الشعبي، الزرد يستخدم على نطاق واسع في مجالات الطب وعلم السموم1،2،،من34. مقارنة بمنصات في المختبر ، الزرد توفر الكثير من التعقيدات البيولوجي أكبر أن أحد أو لا يمكن أن تقدم نوعين من الخلايا. إضافة إلى كونه كائناً كامل النموذجي وخصوبتها كبيرة الزرد والسريع والمتزامن من التنمية الجنينية والجهاز عالية أعطت الشفافية هذا النموذج مزايا فريدة من نوعها لاستخدامها لسمية واسعة النطاق أو المخدرات/مجمع الفرز5. مئات الأجنة التي تنتجها زوج واحد من الزرد الكبار كل أسبوع تفوق أي نماذج حيوانية أسرة أخرى وجعلت مناسبة لفحص إنتاجية عالية.
إجراء فحص نموذجي باستخدام الزرد ينطوي على قدر كبير من العمل اليدوي، مثل الكبار الزرد التفريخ، اختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في حاويات مناسبة حيث أنهم يتعرضون للتعرض عن طريق غمر المياه. ويرصد وضع الأجنة ونهايات يمكن ملاحظتها مثل معدلات الوفيات، وإمكانية فقس البيض، والشذوذ غالباً ما قيمت يدوياً ويستخدم كتعريفات أولية لسمية المواد الكيميائية أو مؤشرات لمدى فعالية العقاقير أو المركبات. لتسريع إجراءات الفرز، تم استكشاف النهج مثل التصوير الآلي وتحليل الصور الحاسوب مسبقاً. على سبيل المثال، مجاهر مع المحتوى العالي من قدرات التصوير وقد تم تكييف أداء الآلي مشرق الحقل أو تصوير الأسفار على الأجنة الزرد في مختلف مراحل النمو من لوحات جيدا 96/3846. أجهزة موائع جزيئية مقترنة بالمجاهر استخدمت لوضع اليرقات الزرد من خلال التلاعب الحالي لتصوير الدماغ الخلايا العصبية7. هذه النهج يمكن تحسين كبير في كفاءة عمليات اقتناء الصورة مقارنة بالتشغيل اليدوي التقليدي. وعلاوة على ذلك، مع عدد كبير من الصور التي يتم إنشاؤها، أدوات تحليل الصورة كما وضعت لتسريع عملية معالجة البيانات، كما يتبين من ليو وآخرون وتو et al. 8 , 9.
كما يزيد مستوى الإنتاجية لتحليل التصوير والصورة، أصبح من الواضح أن هذه الخطوة الحد من معدل للفحص يكمن في عملية إعداد أجنة الزرد للتعرض، والذي يعني عادة أرايينج منهم إلى 96-384 جيدا أو لوحات. لحل هذه الخطوة عنق الزجاجة، وضعت موجهة برؤية الروبوتات ماندريل et al. 10 ولنا11 سابقا ليحل محل المناولة اليدوية ولكن الأدوات متطورة بل وهناك منحنى التعلم عميق لتنفيذ مثل هذه التقنيات. ولذلك، لتوفير نهج سهلة الاستخدام يصبح أحد العوامل الهامة لزيادة تحسين مستوى الإنتاجية لفحص الزرد، وهو الهدف الرئيسي لهذا العمل.
في هذا العمل، ونحن تصميم وملفقة جنين أرايينج قالب عليها 3D الطباعة. صمم قالب أرايينج لإيقاع الجنين الزرد إلى الآبار التي تناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. بدلاً من اختيار الأجنة وأرايينج لهم في بئر فرادى واحداً تلو الآخر، أحد يمكن تنفيذ فخ الجنين ومجموعة جميع أجنة 96 في صفيحة الجدر مرة واحدة. باستخدام هذا القالب والبروتوكول التالي، واحد يمكن زيادة كبيرة في الكفاءة من أرايينج الأجنة في لوحات الجدر، والتي ستكون في الأجل زيادة قدرة الفرز على الأقل عشرة إضعاف، مقارنة بالتشغيل اليدوي. ويشمل البروتوكول هو موضح أدناه تصميم العام أرايينج القالب، تفريخ الزرد، جمع الجنين، وأرايينج. ويبين الشكل 1 التصميم العام للقالب أرايينج. ويبين الشكل 2 لمحة عامة عن البروتوكول خطوة بخطوة حول استخدام قالب الموصوفة في الأجزاء 3 و 4.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Facility</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>Mating box</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottle, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Vetec</td><td>v900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>Sea Salts</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Biochemical incubator</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>Photosensitive resin</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive PCR Plate Seals</td><td>Solarbio</td><td>YA0245</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Multi 8-channel pipette 30 - 300 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>Compressed Gas Duster</td><td>Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>Drying oven</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>System water</td><td></td><td></td><td>Water out of the facility&amp;rsquo;s water system</td></tr><tr><td>Egg water</td><td></td><td></td><td>Dilute 60mg &amp;ldquo;Instant Ocean&amp;rdquo; sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water</td></tr><tr><td>Holtfreter&amp;rsquo;s solution</td><td></td><td></td><td>Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water</td></tr></tbody></table>

a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying

الزرد كائن معترف به عالمياً من مياه العذبة استخداماً في علم الأحياء التنموي، وعلم السموم البيئية والأمراض البشرية المجالات البحثية ذات الصلة. بفضل ميزات فريدة من نوعها، بما في ذلك خصوبة كبيرة، الشفافية الجنين، والتنمية السريعة والفورية، إلخ، الزرد الأجنة غالباً ما تستخدم لتقييم السمية واسعة النطاق للمواد الكيميائية والمخدرات/مجمع الفرز. إجراء فحص نموذجي ينطوي على التفريخ الزرد الكبار، واختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في لوحات متعددة جيدا. من هناك، تتعرض الأجنة للتعرض ومدى سمية المادة الكيميائية، أو يمكن تقييم فعالية العقاقير/المركبات بسرعة نسبيا استناداً إلى الملاحظات المظهرية. ومن بين هذه العمليات، الأجنة أرايينج هو إحدى الخطوات الأكثر استهلاكاً للوقت وكثيفة العمالة التي تحد من مستوى الإنتاجية. في هذا البروتوكول، نقدم نهجاً مبتكراً أن يجعل استخدام قالب أرايينج طباعة 3D مقترنة بفراغ التلاعب الإسراع بهذه الخطوة شاقة. ويصف البروتوكول هنا التصميم العام للقالب أرايينج، الإعداد التجريبية التفصيلية والإجراءات خطوة بخطوة، تليها النتائج الممثل. عند تنفيذها، ينبغي أن يثبت هذا النهج مفيداً في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية باستخدام أجنة الزرد كاختبار المواضيع.

ويبين الشكل 3 قالب أرايينج نموذجية طباعة 3D. هذا القالب يستخدم الراتنج حساس كمواد خام وأدلى طابعة ثلاثية الأبعاد؛ تم تطبيق طبقة من الطلاء الأسود لتوفير أفضل على النقيض من لون الأجنة. موقف الآبار 96 (12 من 8) صممت لتناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. وبالمثل، يمكن أيضا تصميم قالب جيدا (24 من 16) 384 وملفقة باستخدام نفس الأسلوب. رأسا على عقب الدائرة كانت أكبر قليلاً من صفيحة 96-جيدا قياسية لتوفير المناسب أفضل. وصممت الأخاديد أيضا عقد أجنة إضافية أثناء أرايينج.
بمعدل متواضع، يمكن إعداد لوحات 20 استخدام قالب أرايينج طباعة 3D خلال 30 دقيقة، بينما ألواح اثنين أو ثلاثة فقط يمكن إعدادها يدوياً. ويبين الجدول 1 مقارنة بين عمليات القالب اليدوي والروبوتية وأرايينج. ويبين الشكل 4 مقارنة بين لوحات اثنين، واحد صفت في قالب أرايينج طباعة 3D، أعد يدوياً. استخدام قالب أرايينج، كان هناك كمية ضئيلة من سائل نقل الأجنة، مما جعلها ملائمة لزيادة التعرض للتجارب.
ويبين الشكل 5 أن كانت هناك لا آثار كبيرة على الحالة الصحية العامة للأجنة بعد يجري مطلي بأساليب قالب اليدوي وأرايينج. للتأكد من الأجنة لم تتأثر بهذه عملية أرايينج، تابعنا تطور الجنين بعد أرايينج لهم في لوحات 96-جيدا لمدة 3 أيام. معدل الفقس، ومعدل البقاء على قيد الحياة، ومعدل تشوه الأجنة الزرد في 24 و 48 و 72 هبف كانت كلها قابلة للمقارنة مع الأجنة صفت يدوياً.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig1.jpg"> رقم 1: تصميم جنينا الزرد أرايينج القالب. (ألف و جيم) 3 د ماكس الرسم عرض نظرة عامة على القالب. شريحة (ب) عرض القالب. (د) عرض جزئية من القالب. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig2.jpg"> رقم 2: الخطوات النموذجية عند استخدام قالب أرايينج. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig3.jpg"> الشكل 3: صور فوتوغرافية لقالب أرايينج طباعة 3D- <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig4.jpg"> الشكل 4: الصور المجهرية للأجنة بعد نقلها إلى لوحة 96-جيدا- (أ) صورة جزئية صفيحة 96، حسنا صفت بالقالب. (ب) صورة جزئية من صفيحة 96، حسنا صفت يدوياً. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57892/57892fig5.jpg"> الرقم 5: الوضع الصحي العام للأجنة بعد يجري مطلي بأساليب قالب اليدوي وأرايينج- استناداً إلى الفقس، غير طبيعية، ومعدلات البقاء على قيد الحياة للأجنة بعد مطلي باستخدام أما يدوياً أو بأساليب قالب أرايينج، لوحظت لا آثار كبيرة على الصحة العامة للأجنة في كلتا الحالتين. أشرطة الخطأ هي الانحرافات المعيارية. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57892/57892fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td style="text-align: center;">دليل</td>
			<td style="text-align: center;">منصة الروبوتية</td>
			<td style="text-align: center;">قالب أرايينج</td>
		</tr>
<tr>
<td>تصفيح الوقت</td>
			<td style="text-align: center;">10 – 30 دقيقة/لوحة</td>
			<td style="text-align: center;">5 – 10 دقيقة/لوحة</td>
			<td style="text-align: center;">1 – 2 دقيقة/لوحة</td>
		</tr>
<tr>
<td>التكلفة</td>
			<td style="text-align: center;">منخفض</td>
			<td style="text-align: center;">عالية</td>
			<td style="text-align: center;">منخفض</td>
		</tr>
<tr>
<td>التدريب المطلوب</td>
			<td style="text-align: center;">الحد الأدنى</td>
			<td style="text-align: center;">عالية</td>
			<td style="text-align: center;">Minumum</td>
		</tr>
<tr>
<td>مجال العمل</td>
			<td style="text-align: center;">الصغيرة</td>
			<td style="text-align: center;">كبيرة</td>
			<td style="text-align: center;">الصغيرة</td>
		</tr>
<tr>
<td>تأثير على الأجنة</td>
			<td style="text-align: center;">يذكر أن لا شيء</td>
			<td style="text-align: center;">يذكر أن لا شيء</td>
			<td style="text-align: center;">يذكر أن لا شيء</td>
		</tr>
<tr>
<td>كمية السائل المضافة كل بئر</td>
			<td style="text-align: center;">عشوائية</td>
			<td style="text-align: center;">5 – 10 ميليلتر</td>
			<td style="text-align: center;">الحد الأدنى</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: مقارنة بين عمليات القالب اليدوي والروبوتية وأرايينج-

Watch this Scientific Journal Video about A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying at JoVE.com

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق جنينا الزرد أرايينج القالب، يليه إجراء مفصل عن استخدام هذا القالب للإنتاجية العالية الزرد الجنين أرايينج في لوحة 96-جيدا.

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

a-3-dimensional-3d-printed-template-for-high-throughput-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

6.7K Views.  Tongji University. نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق جنينا الزرد أرايينج القالب، يليه إجراء مفصل عن استخدام هذا القالب للإنتاجية العالية الزرد الجنين أرايينج في لوحة 96-جيدا.

Video: A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Genetics

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Developmental Biology

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

<meta charset="utf8"></head><body>بروتوكول الفحص المجهري للورقة الضوئية متعددة الرؤوس المكرر لأجنة أسماك الزرد

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: استراتيجيات تركيب أجنة الزرد للفحص المجهري عالي الدقة متعدد الرؤى - تقنيات التصوير وإعادة بناء الصور

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

تخفيض حجم العمليات الجراحية لدراسة قياس النمط الجنيني

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

نظام الزرد Tol2: نهج وراثي معياري ومرن قائم على البوابة

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

التصوير المجهري للورقة الضوئية واستراتيجيات التركيب لأجنة أسماك الزرد المبكرة

التصوير الآلي شبه الإسفار من الأنسجة محددة في الزرد الأجنة