Die Autoren haben nichts preisgeben.

1. Vorbereitung das Wachstumsmedium Hinweis: die chemische Zusammensetzung der minimale mittlere M63 lautet wie folgt: 62 mM K 2 HPO 4, 39 mM KH 2 PO 4, 15 mM (NH 4) 2 SO 4 1,8 µM FeSO 4, 15 µM Thiamin-HCl, 0,2 mM MgSO 4 und 22 mM Glukose. M63 erfolgt durch das Mischen von drei Stammlösungen: 5 X Lösung, 20 % Glukose und MgSO 4 Thiamin-Lösung. Speichern Sie alle Lösungen bei 4 ° c
<ol><li>Herstellung der fünf X-Lösung <ol><li>, FeSO 4 Lösung vorzubereiten benutzen eine elektrische Pipette und ein Einweg-serologische Pipette eine 50 mL Zentrifugenröhrchen DdH 2 O hinzu. Verwenden Sie eine P-200 hinzufügen 0,06 mL HCl zu erhalten 0,01 M HCl. Add 36 mg FeSO 4-7 H 2 O und gut verrühren.</li>
		<li>160 mL DdH 2 O in einem Messzylinder messen und einen 500-mL-Becherglas hinzufügen. Fügen Sie die folgenden in dieser Reihenfolge: 10,72 g K 2 HPO 4, 5,24 g KH 2 PO 4, 2, 0 g (NH 4) 2 SO 4 und 0,5 mL FeSO 4-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1.1).</li>
		<li>Mit dem Präzisions-pH-Meter, den pH-Wert auf 7,0 durch Zugabe von 2 M KOH einstellen. Gießen Sie die Lösung in einen Glaszylinder und einem Gesamtvolumen von 200 mL fügen Sie DdH 2 O hinzu. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 250-mL-Filteranlage (PVDF, 0,22 µM).</li>
	</ol></li> <li>Herstellung der 20 % Glukoselösung <ol><li>200 mL DdH 2 O in einem Messzylinder zu messen und um einen 500-mL-Becherglas gießen. Fügen Sie beim Mischen mit einem Magnetrührer, 50 g Glukose. Verdünnen Sie die Lösung in einem Messzylinder auf ein Gesamtvolumen von 250 mL. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Herstellung der MgSO 4 Thiamin Lösung <ol><li>einen 500-mL-Becherglas 150 mL DdH 2 O hinzufügen. Fügen Sie beim Mischen mit einem Magnetrührer ein Gesamtvolumen von 200 mL 1,0 g Thiamin-HCl und 10 g MgSO 4-7 H 2 O. verdünnt die Lösung in einem Messzylinder hinzu. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung minimale mittlere M63 <ol><li>legen die fünf X-Lösung, die 20 % Glukoselösung MgSO 4 Thiamin Lösung, eine elektronische Pipette, einer P-200-Pipette und 200 µL Pipettenspitzen auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Maßnahme 155,8 mL DdH 2 O in einem Messzylinder und gießen Sie sie in einen 500-mL-Becherglas.</li>
		<li>Mit dem elektronischen Pipette und Einweg-serologische Pipette, Hinzufügen der gemessenen DdH 2 O. 40 mL 5 X und 4 mL 20 % Glucoselösung Fügen Sie dann 0,2 mL MgSO 4 Thiamin-Lösung mit der P-200. Die Lösung zu sterilisieren, wie unter Schritt 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Glycerin-Lager <ol><li>Zelle Kultur Hinweis: die Bakterienstämme (z.B., W3110 und seine reduzierte Genome) gibt es von Belastung Bank Organisationen. Die Stämme werden in der Regel in Form von Kolonien auf Agarplatten erhalten.
	<ol><li>Platz fünf sterilisierte Glasröhren mit Silikon Gummistopper, eine elektronische Pipette, P-1,000, 1.000 µL Pipettenspitzen, P-200, 200-µL-Pipettenspitzen und die Ziel-Stämme (Kolonien auf Tellern) auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Aussetzen die Mündung des Glasrohrs auf dem Bunsenbrenner vor dem Öffnen des Silikon-Gummistopfens. Setzen Sie den Silikon-Gummistopfen in die Flamme nach dem Öffnen der Tube und leicht setzen Sie die Kappe wieder auf die Glasröhre.</li>
		<li>Verwenden die elektronische Pipette und Einweg-serologische Pipette eines der Glasröhren und 4,5 mL M63, die anderen vier Röhrchen 5 mL M63 hinzu.</li>
		<li>P-200 Tipp verwenden, um eine Kolonie zu wählen und in das Glasrohr mit 5 mL M63 impfen.</li>
		<li>Vortex das Rohr zu einer Suspension. Verdünnen Sie die Lösung dann 10-fach durch Übertragung von 0,5 mL dieser Lösung auf eine der vier Röhren mit 4,5 mL M63.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang im Schritt 2.1.5 für die übrigen Röhren beschrieben. Eine Verdünnungsreihe mit fünf verschiedenen Konzentrationen (Verdünnungen von 1, 10, 100, 1000 und 10.000) ist jetzt bereit.</li>
		<li>Sterilisieren die Mündern von Glasröhren und Silikon-Gummistopfen wie unter Punkt 2.1.2 beschrieben. Verschließen Sie die Rohre mit dem Stopfen. Kontamination vermeiden, indem Sie nicht knittern die Silikon-Gummistopper.</li>
		<li>Legen die fünf Röhren in einem vorgewärmten schütteln Inkubator bei 37 ° C und bei 200 u/min schütteln. Inkubation die Kultur über Nacht oder für 10 bis 30 h</li>
	</ol></li> <li>Auswahl der Kultur für das Glycerin Lager <ol><li>legen das vorgewärmte Raumtemperatur M63 Medium, P-1,000, 1.000 µL Pipettenspitzen und ein Einweg-Küvette auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Hinzufügen 1000 µL M63, eine Einweg-Küvette mit einem p-1, 000. Legen Sie die Einweg-Küvette in einem Spektrophotometer, starten Sie das Programm bei einer festen Wellenlänge von 600 nm und Maßnahme des Rohlings.</li>
		<li>Ans der sauberen Bank die fünf Glasröhren aus dem Schütteln Inkubator.</li>
		<li>Verwerfen M63 von Einweg-Küvette und die gleichen Einweg-Küvette mit einem p-1, 000 1.000 µL Kultur hinzufügen. Die optische Trübung der Zellkultur (OD 600) zu messen, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben. 
		Hinweis: Um eine Kontamination zu vermeiden und eine präzise Messung zu erreichen, setzen Sie die Glasröhren und die Stopper der Flamme wie beschrieben und Wirbel der Kultur vor der Probenahme. Um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten, sind wiederholte Messungen empfohlen, besonders wenn die Zelldichte niedrig ist.</li>
		<li>Der fünf Zellkulturen, wählen Sie in der frühen Phase des exponentiellen Wachstums (OD 600 = 0,01 - 0,05) für den Glycerin bestand. 
		Hinweis: Wenn mehrere Kulturen dichten im optimalen Bereich, die am nähsten zu 0,05 ist allgemein ausgewählt.</li>
	</ol></li> <li>Machen die Glycerin-Bestände für wiederholte Prüfungen. 
	Hinweis: Dies ist für die Zubereitung von zehn Aktien beschrieben. Größere oder kleinere Mengen können je nach den experimentellen Anforderungen erfolgen.
	<ol><li>Legen Sie die sterilisierten 60 % Glycerin Lösung, zehn sterilisiert 1,5 mL Mikroröhrchen, P-1,000 und P-200, 1.000 und 200 µL Pipettenspitzen und eine Reaktionscup auf einer sauberen Werkbank stehen.</li>
		<li>Fügen Sie 250 µL 60 % Glycerin Lösung und 750 µL der ausgewählten Zellkultur 1,5 mL Reaktionscup und Mischung von Pipettieren sterilisiert. 
		Hinweis: Das Lager Volumen ist variabel, aber behalten Sie immer eine 1:3-Verhältnis von 60 % Glycerin, Zellkultur; Dadurch wird eine Endkonzentration von 15 % Glycerin.</li>
		<li>Stellen die restlichen neun Mikroröhrchen in die Reaktionscup Ständer und 100 µL der Mischung in 2.3.2 Schritt für jedes Rohr vorbereitet zu verzichten. Mittlerweile gibt es zehn identische Glycerin-Beständen für die zukünftige Verwendung.</li>
		<li>Speichern die Bestände in einer Tiefkühltruhe bei-80 ° c</li>
	</ol></li></ol> 3. Erwerb der Wachstumskurven <ol><li>der Mikrotestplatte Leser einrichten. 
	Hinweis: Die Begriffe in Anführungszeichen zeigen die spezifische Formulierung auf der Platte-Leser verwendet hier verwendet (siehe Tabelle Materialien).
	<ol><li>Offene Software. Offene &#34; Protokolle &#34; in &#34; Task-Manager &#34; und wählen Sie &#34; neu erstellen &#34;. Wählen Sie &#34; Standardprotokoll &#34;.</li>
		<li>Open &#34; Verfahren &#34;, und passen Sie die Einstellungen. Offene &#34; Set Temperatur &#34;, und wählen Sie &#34; Inkubator auf &#34;. Set &#34; Temperatur &#34; auf 37 ° C und &#34; Gradient &#34; auf 0 ° C. Check &#34; vorheizen &#34; bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Offene &#34; starten kinetische &#34;, Set &#34; Laufzeit &#34; für 24:00:00 oder 48:00:00, und &#34; Intervall &#34; 00:30:00 oder 01:00. 
		Hinweis: Es dauert ca. 1 min zu lesen, eine gesamte 96 gut Platte.</li>
		<li>Open &#34; schütteln, &#34; und &#34; Shake Modus &#34; als &#34; Linear &#34;. Überprüfen Sie &#34; CoNstitution Shake &#34; und &#34; Frequenz &#34; auf 567 cpm. Offene &#34; lesen &#34;, überprüfen &#34; Absorption &#34;, &#34; Endpunkt/kinetische &#34;, und &#34; Monochromatoren. &#34; gesetzt &#34; Wellenlänge &#34; bis 600.</li>
		<li>Klicken Sie &#34; Validate &#34; zu bestätigen, dass das Verfahren korrekt ist. Klicken Sie &#34; speichern Sie &#34; als ein neues Programm für die spätere Verwendung zu speichern.</li>
	</ol></li> <li>Echtzeit-Aufnahme des Wachstums <ol><li>zeichnen einen 96-Well-Platte-Piktogramm (8 × 12 Tabelle) um die Positionen der beimpften Kultur Proben auf der 96-Well-Platte anzugeben. Drucken Sie die Tabelle und verwenden Sie es als Referenz für das Experiment. 
		Hinweis: Der Brunnen befindet sich am Rande der Mikrotestplatte sollte nur leere Medium wegen Verdunstung enthalten.</li>
		<li>Ort eine sterilisierte 96-Well-flache Unterseite Mikrotestplatte mit Deckel, P-1000, 1000 µL Pipettenspitzen, P-200, 200-µL-Pipettenspitzen, mehrere 1,5 mL Mikroröhrchen, ein 8-Mehrkanal-Pipette, sterilisierte Reagenz Reservoir, Raumtemperatur M63 und Glycerin Aktien (vorbereitet in Schritt 2.3) auf einer sauberen Werkbank.</li>
		<li>Ca. 25 mL M63 hinzufügen das Reagenz-Reservoir. Dieses Reservoir-Lager für die folgenden Schritte verwenden.</li>
		<li>Fügen Sie 900 µL M63, Mikroröhrchen in Vorbereitung für die Herstellung von Verdünnungsreihen.</li>
		<li>Lassen die Glycerin-Aktie bei Raumtemperatur auftauen. Fügen Sie 900 µL M63 aufgetauten Glycerin Lager und Wirbel. Dies führt zu einer 10-divisibel Verwässerung der ursprünglichen Glycerin Aktie.</li>
		<li>Transfer 100 µL der 10-divisibel Verdünnung zu einer anderen Reaktionscup mit 900 µL M63 und Wirbel. Dies führt zu einer 100-fold Verdünnung.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.2.6 bis die gewünschte Anzahl von Verdünnungen erreicht werden.</li>
		<li>Füllen die Brunnen am Rande der Mikrotestplatte mit 200 µL M63 mit einer 8-Kanal-Pipette (P-200). 
		Hinweis: Diese Brunnen können als Rohling verwendet werden.</li>
		<li>Last 200 µL der einzelnen verdünnt Probe vorbereitet in Schritten 3.2.4 - 3.2.7 um die Mikrotestplatte Brunnen nach der Referenztabelle (Schritt 3.2.1). Wirbel der verdünnten Proben vor dem Laden und laden die gleiche Probe in mehreren Wells in vielfältig Standorte auf der Platte.</li>
		<li>96-Well Mikrotestplatte auf der Platte-Leser legen.</li>
		<li>Open &#34; Read Now &#34; in &#34; Task-Manager &#34; und wählen Sie das Programm (Abschnitt 3.1). Klicken Sie auf &#34; OK &#34; Messung zu beginnen. Speichern Sie die Aufnahme als neue experimentelle Datei für die Datenanalyse (Abschnitt 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse der Daten <ol><li>Export die Ergebnisse der Daten in Echtzeit Wachstumsrate (Abschnitt 3.2) auf einen USB-Speicher-stick als eine Text-Datei. 
	Hinweis: Eine 96-Well formatierte Ergebnisse (Kurven) werden auf der Platte Leser in Echtzeit angezeigt. Die Stundenaufzeichnungen (OD-Werte) können als Tabelle exportiert werden; die Zeilen und Spalten darstellen, die gut Zahlen (z.B. A1, B1) und die Messzeit (z.B. 00:00:59), beziehungsweise.</li>
	<li>Öffnen Sie die Textdatei mit einem Tabellenkalkulations-Software.</li>
	<li>Kopieren Sie die stündlichen OD 600 lautet der 96-Well Mikrotestplatte in ein neues Arbeitsblatt zur weiteren Analyse.</li>
	<li>Subtrahieren Hintergrund liest vor Zeit Null von der stündlichen liest jeder Probe gut. 
	Hinweis: der Einfachheit halber der Mittelwert des Rohlings Brunnen enthaltenden M63 (Schritt 3.2.8) kann verwendet werden, als den Hintergrundwert.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert aus fünf aufeinander folgenden OD 600 liest die maximale Bevölkerungsdichte abzuschätzen. 
	Hinweis: Der größte Mittelwert der fünf aufeinander folgenden OD 600 lautet ist definiert als die maximale OD 600 entsprechende Wachstumskurve.</li>
	<li>Berechnung die Wachstumsrate µ (h -1), durch die Anwendung der folgenden Gleichung für alle Paare aufeinander folgender Werte OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Hinweis: In dieser Gleichung C ich und C i + 1 repräsentieren die OD 600 Werte zwei aufeinander folgenden Zeitpunkten (t ich und t i + 1, beziehungsweise). LN gibt natürlichen Logarithmus.</li>
	<li>Berechnen die Veränderungen bei der Zunahme im Laufe der Zeit auf Stundenbasis OD 600 basierend liest laut Schritt 4.6. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der fünf aufeinander folgenden Wachstumsraten, die maximale Wachstumsrate zu schätzen. 
	Hinweis: Der größte Mittelwert mit der kleinsten Standardabweichung ist definiert als die maximale Wachstumsrate der entsprechenden Wachstumskurve.</li>
</ol> 5. Bestätigt die globale Vorspannung des 96-Well lautet (Optional) Hinweis: sowohl die Platte Leser und die Verbrauchsmaterialien 96-Well-Platte können dazu führen, dass voreingenommene Messungen. Um sehr präzise und reproduzierbar quantitative Ergebnisse zu erzielen, bestätigt die globale Vorspannung der 96-Well-Platte ist sehr zu empfehlen.
<ol><li>96-Well-Platte und der Platte-Leser auf den Bias Test vorbereiten, wie in Abschnitt 3.2.2 beschrieben.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mL M63, eine sterilisierte 50 mL Zentrifugenröhrchen. Die Brühe Glycerin auf die gleichen Zentrifugenröhrchen und Wirbel. Übertragen die abgehängte Lösung zu einem sterilisierten Reagenz Reservoir.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 8-Kanal-Pipette, um 200 µL der suspendierten Lösung auf die 96-Well-Platte zu übertragen.</li>
	<li>96-Well-Platte auf den Teller-Leser und starten Sie die Messung.</li>
	<li>Datensatz die stündliche OD 600 liest und analysiert, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Vergleichen Sie die berechnete maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte von jedem gut zu bestimmen, standortbezogene Voreingenommenheit des 96-Well lautet.</li>
</ol>

<ol>
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Wir danken für die Bereitstellung der KBE-Assay-Beispiel Kohei Tsuchiya. Diese Arbeit wurde teilweise finanziell durch eine Beihilfe für wissenschaftliche Forschung (C) Nr. 26506003 (zu BWY) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan unterstützt.

Wichtige Schritte im Protokoll sind die Vorbereitung einer Stammaktie der exponentiell wachsenden Zellen und die Replikation der gleichen Proben in mehreren Brunnen an verschiedenen Positionen auf die Mikrotestplatte. Zuvor, Mikrobiologen die Kultur angefangen eine Übernachtung Vorkultur. Während diese Methode die Verzögerungszeit des Bakterienwachstums verringern kann, ist es schwierig, reproduzierbare Wachstumskurven zu erreichen. Wie in Abbildung 2dargestellt, führte die unabhängigen Messungen unter Verwendung der gemeinsamen Glycerin Bestände nahezu identische Wachstumskurven, die präzise und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Wie in Abbildung 3dargestellt, geben Brunnen an verschiedenen Standorten etwas anders lautet, gilt die globale Hintergrund der Messungen. Für die quantitative Auswertung des Bakterienwachstums sollte diesem Hintergrund betrachtet werden. Inokulation von Proben für mehrere Bohrlöcher an abwechslungsreiche Platte stellen für experimentelle Replikation wird dringend empfohlen, um globale Vorspannung zu berücksichtigen.
Neben der Behandlung von Fehlern, sollte die Änderung und Fehlerbehebung, abgeleitet von den experimentellen Geräten und Verbrauchsmaterialien betrachtet werden. Mehrere fortgeschrittene Mikrotestplatte Leser sind im Handel erhältlich. Sie zeigen eine breite Variation in Eigenschaften, wie die Methode der Justage der Wellenlänge des Lichts, die Art der Beheizung oder Kühlung, und die Art und Häufigkeit der Erschütterung. Basierend auf unserer Erfahrung, sollten Verdunstung im Hochdurchsatz-Studien angesprochen werden, weil Änderungen in Flüssigkeitsvolumen großen Einfluss auf die OD600 mal gelesen. Verdunstung wird durch die Methode der Heizung durch die Mikrotestplatte Leser und die Architektur der Mikrotiterplatten verwendet verursacht. Die beiden Modi der Heizung, die häufig in kommerziellen Mikrotestplatte Leser implementiert sind Heizung mit Warmluft und Heizung mit einer Heizplatte. Die Mikrotestplatte Leser in diesem Protokoll verwendeten verwendet die heiße Platte als eine Heizmethode um Verdunstung zu verringern, weil das Medium in die Mikrotestplatte bläst warme Luft schnell austrocknen würde. Die Mikrotiterplatten sollte auch sorgfältig ausgewählt werden. Verschiedene 96-Well-Mikrotiterplatten (mit Deckel) dazu führen, dass verschiedene Ebenen der Verdunstung. Das beschriebene Verfahren nutzt das Plattenformat mit einem tiefen überdachte Deckel, der Verdunstung reduziert.
Außerdem, wenn die Studie stationäre Phasenanalyse der Wachstumskurve erfordert, sollte dann die Art und Häufigkeit der Erschütterungen in der Mikrotestplatte Leser berücksichtigt werden. Schütteln während Kultur sorgt dafür, dass die wachsenden Zellen gleichmäßig in den Medien ausgesetzt sind. Unsachgemäße schütteln oder niedriger Frequenz verursachen die Zellen, zu stapeln, um den gut Rand oder in der Mitte bei einer hohen Dichte, wodurch falsch liest, die entweder niedriger oder höher als tatsächliche mal gelesen. Die beschriebene Methode verwendet lineare, bidirektionale schütteln. Während der 8-förmigen schüttelnde Modus wahrscheinlich ausreichend ist, empfehlen wir nicht den kreisförmigen Modus schütteln.
Die größte Beschränkung dieser Methode ist die Verdunstung von der Zellkulturmedium. Da die maximale Kulturvolumen klein ist, verursacht also200 µL Inkubation bei 37 ° C erhebliche Verdunstung. Damit diese Methode eignet sich für die Kultivierung länger als 48 h zusätzlich, Zellkulturen mit geringer Dichte sollte vermieden werden, da bei diesen dichten optischen Erkennung (OD600) beschränkt. Zusammen betrachtet, sind sehr langsam wachsende Zellen/Dehnungen oder sehr geringen Ausgangskonzentration Kulturen nicht bevorzugt, da sie längeren Zeit benötigen und sind unterhalb der Nachweisgrenze von OD600.
Diese Methode liefert präzise, Hochdurchsatz-Messungen, die sehr vorteilhaft für systematischen Erhebungen sind. Als ein repräsentatives Ergebnis dieser Methode erlaubt es, um ein Sortiment von E. Coli -Stämme mit verschiedenen Genomsequenzen bzw. Medium einfach und reproduzierbar zu bewerten5. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden der Kultivierung in Rohren und manuell messen Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten, ist die beschriebene Methode weniger Arbeits- und zeitintensiv. Zukünftige Anwendungen und Entwicklung der Methode werden angenommen, die Automatisierung von experimentelle Manipulation und computergestützte Analyse einzubeziehen. Automatische Messung und Robotik Anwendung führt zu eine hocheffiziente und zuverlässige Methode der Bewertung von Zellwachstum und Durchführung überleben Tests mit Bakterien- und Säugetier-Zellen.

Mikrobiologische Untersuchungen beginnen oft mit der Kultur der Bakterienzellen und der Bewertung der Bakterienwachstum Kurven, die ein grundlegendes Phänomen der bakteriellen Physiologie1,2,3darstellen. Grundlegende Kultur Prinzipien sind weit verbreitet in der veröffentlichten Literatur und Lehrbücher, weil Bakterienkultur eine grundlegende Methodik ist. Die Ebene der Bank erhebliche Aufmerksamkeit hat traditionell auf die Optimierung Wachstumsmedien und Kultivierung Bedingungen, sondern steuern die Wachstumsrate, die wahrscheinlich noch größeres Verständnis für mikrobielle Physiologie bieten würde wurde nicht ausgiebig studiert4. Für exponentiell wachsenden Bakterien, ist ein wichtiger Parameter der zellulären Staat die Wachstumsrate, die berichtet wurde, das Genom, Transkriptom und Proteom5,6,7,8 abgestimmt sein . So ist die quantitative Bewertung des Bakterienwachstums entscheidend für das Verständnis der mikrobielle Physiologie.
Um bakterielles Wachstum zu bewerten, die experimentellen Methoden zur Schätzung der Biomasse sind gut etablierte9,10 und basieren auf dem Nachweis von biochemischen, physikalische oder biologische Parameter, z. B. optische Trübung. Darüber hinaus basieren die analytischen Methoden verwendet, um die dynamischen Eigenschaften des Wachstums Änderungen erfassen häufig auf etablierte nichtlineare Modelle11,12,13, z. B. logistische Gleichungen. Wachstumsdynamik sind in der Regel durch zeitgesteuerte Sampling des Zellwachstums in der Kultur durch optische Trübungsmessung oder Durchführung von koloniebildenden Einheit (KBE) Assays erworben. Die Einschränkung dieser Kultivierung und Erkennung Methoden ist, dass die Datenpunkte kein getreues Spiegelbild der Populationsdynamik sind, da die Messintervalle oft in Stunden sind und die Kultur-Bedingung (z. B.Veränderungen in Temperatur und Belüftung) ist zum Zeitpunkt der Probenahme gestört. Kultur und Analysetechniken müssen aktualisiert werden, mit den letzten Entwicklungen in Technologie und Verständnis. Jüngste Fortschritte in der Mikrotestplatte Leser erlauben die Echtzeit-Beobachtung des Bakterienwachstums und Arbeitskosten deutlich zu verringern. Mit diesen fortschrittlichen Geräten, haben die neuesten Studien über Bakterienwachstum Analysemethoden für Hochdurchsatz-Messungen14,15berichtet.
Dieses Protokoll soll die genaue Wachstumsdynamik in gewissem Hochdurchsatz-bewerten, die quantitative Studien nützlich sein werden, die letztlich die Fragen wie die Wachstumsrate bestimmt wird und welche Faktoren beeinflussen die Wachstumsrate. Das Protokoll befasst sich mit allen Faktoren, die für die reproduzierbare und genaue Quantifizierung des Bakterienwachstums berücksichtigt werden sollten. Die experimentelle Methode und Analyse sind detailliert im Haupttext beschrieben. Diese Methode erlaubt die präzise und reproduzierbare Analyse des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz. Mikrobiologen können dieses Protokoll verwenden, um zusätzliche quantitative Ergebnisse aus ihrer experimentellen Beweise ableiten. Dieses Protokoll kann auch für Studien in der Systembiologie verwendet werden, die versuchen, konzeptionellen Schlussfolgerungen zu ziehen oder einen theoretischen Überblick über Wachstum zu erreichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Bakterielles Wachstum ist ein zentrales Konzept in der Entwicklung der modernen mikrobielle Physiologie, sowie bei der Untersuchung der zelluläre Dynamik auf der Systemebene. Jüngste Studien haben Zusammenhänge zwischen Bakterienwachstum und genomweite Ereignisse, z. B. Genom Reduktion und Transkriptom Reorganisation berichtet. Richtig analysieren Bakterienwachstum ist entscheidend für das Verständnis der Wachstum-abhängige Koordination von Genfunktionen und zellulären Komponenten. Dementsprechend ist die präzise quantitative Auswertung des Bakterienwachstums in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erforderlich. Neue technologische Entwicklungen bieten neue experimentelle Tools, die Updates über die Methoden zur Untersuchung von Bakterienwachstum zu ermöglichen. Die hier vorgestellte Protokoll beschäftigt einen Mikrotestplatte Leser mit einem hochoptimierten experimentelle Verfahren für die präzise und reproduzierbare Auswertung des Bakterienwachstums. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das Wachstum von mehreren Werten zuvor beschriebenen Escherichia-coli -Stämme. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind wie folgt: die Vorbereitung einer großen Anzahl der Zelle Bestände in kleinen Fläschchen für wiederholte Prüfungen mit reproduzierbaren Ergebnissen, die Verwendung von 96-Well Platten für Hochdurchsatz-Wachstum-Bewertung und die manuelle Berechnung von zwei großen Parameter (d.h. maximale Wachstum Rate und Bevölkerung Dichte) repräsentieren die Wachstumsdynamik. Im Vergleich zu den traditionellen koloniebildenden Einheit (KBE) Assay, der die Zellen, die in Glasröhren im Laufe der Zeit auf Agarplatten kultiviert werden zählt, die vorliegende Methode ist effizienter und bietet detailliertere zeitliche Aufzeichnungen über Wachstum Veränderungen, aber hat eine strengere Nachweisgrenze bei niedrigen Bevölkerungsdichte. Zusammenfassend ist das beschriebene Verfahren vorteilhaft für die präzise und reproduzierbare Hochdurchsatz-Analyse des bakteriellen Wachstums, der konzeptionellen Schlussfolgerungen ziehen oder theoretische Bemerkungen verwendet werden kann.

Das beschriebene Verfahren bietet die Möglichkeit, dynamische Wachstum von Bakterien in einer kontinuierlichen, Hochdurchsatz-Weise durch den Einsatz eines 96-Well-Format-Reader, der mehrere optische Dichtemessungen in verschiedenen Zeitabständen (von Minuten bis Stunden bis Tage) nimmt zu erfassen. Die Wachstumskurven aus einer Zusammenstellung von E. Coli -Stämme, die mit dem Ausdruck verschiedener Genome können genau in einem einzigen Experiment (Abbildung 1A) erworben werden. Im Vergleich zu der beschriebenen Methode die traditionelle Methode (KBE-Assay) in der Regel erfordert längere Zeitintervalle Probenahme (Abbildung 1 b) und ist arbeitsintensiv, wenn mehrere Kultur erforderlich ist. Darüber hinaus erfordert jede Kultur Abtastzeit für die KBE-Assay die Verwendung von einem kleinen Volumen der Zellkultur, die für wiederholte Messungen verwendet werden kann. Darüber hinaus können begrenzte Anzahl von Zeitpunkten für die Erkennung die Probenahmestellen vermissen, die für die korrekte Berechnung der Wachstumsrate und der maximalen OD600benötigt werden. Jedoch hat die KBE-Assay eine untere Nachweisgrenze, 103 - 104 Zellen/mL, so dass es mindestens zwei Größenordnungen empfindlicher als die optische Trübung-Assay (OD600= 0.001, hat eine Nachweisgrenze von ca. 105 -106 Zellen/mL). Das beschriebene Verfahren bietet ein praktisches und effizientes experimentelles Werkzeug für Systemebene Studien zur Wachstumsdynamik.
Ein entscheidender Vorteil dieses Protokolls ist, dass es wiederholte Messungen aus einem gemeinsamen Glycerin bestand. Mit mehreren Zellkulturen an verschiedenen Verdünnungsraten in frühen exponentiellen Wachstumsphase ist sehr nützlich, weil es ermöglicht die Kulturzeit auf einer Zeitskala abschätzen und vermeidet, dass Kulturen aufgrund von unvorhersehbaren Ereignissen gesättigt. Kultivierung und Messungen von Stammaktien, die aus einer der fünf Kulturen mit unterschiedlichen Verdünnungsraten gemäß Protokoll Abschnitt 2.2 (Abbildung 2A), präsentiert sehr ähnliche Ergebnisse des Wachstums initiiert wurden wiederholt Dynamik-Analyse. Mehreren Wachstumskurven wiederholte und unabhängige Messungen (N = 6) gut überlappt (Abb. 2 boben), mit wenig Varianz (Abbildung 2 bBodenplatte), insbesondere in der exponentiellen Phase ( Abbildung 2 b, schattierter Bereich). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das beschriebene Verfahren hoch reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Schätzung der globalen Vorspannung des 96-Well lautet wird dringend empfohlen. In dem vorliegenden Verfahren die globale Vorspannung wird geschätzt durch die Überwachung des Wachstums des Wildtyp E. Coli Stamm W3110, wie im Protokoll Abschnitt 5 beschrieben. Zum Beispiel berechnet die Wachstumsraten von Wachstumskurven zeigte erhebliche Unterschiede unter den 96 Wells (Abbildung 3A), Vertreter der globalen Fluktuation der Datenmanipulation und Gerätefehler abgeleitet. Dieser Fehler können durch das Laden der gleichen Probe in mehreren Brunnen an verschiedenen Orten auf der Platte maskiert werden. Hingegen die maximale OD600 zeigte eine klare ortsabhängigen Voreingenommenheit für die Ergebnisse als schleichende Veränderungen in der vertikalen Richtung beobachtet wurden, erhöht d. h. die maximale OD600 allmählich aus den Brunnen der Spalte 2 derjenigen Spalte 11 auf der 96-Well-Platte (Abb. 3 b). Um die verzerrte Ergebnisse zu vermeiden, empfiehlt sich die gleiche Probe in den Brunnen befindet sich auf beiden Seiten der 96-Well-Platte für wiederholte Messungen geladen werden. Wird angenommen, dass die standortbezogene Vorspannung in maximaler OD600 Werte aus der Variation in Verdunstungsraten, entstehen, die durch Heizung und Abdichtung Effizienz bestimmt sind. Verglichen mit dem Brunnen in der Mitte der 96-Well-Mikrotestplatte, tendenziell der Brunnen befindet sich an den Rändern relativ höhere Werte, spiegelt die vielfältigen Verdunstungsraten infolge die Dichtwirkung der Mikrotestplatte zeigen. Darüber hinaus da andere 96-Well-Mikroplatten dem gleichen Bias Test unterworfen ähnliche Richtungsänderungen zeigten, basierend auf dem Brunnen auf der Platte befand, kann das Ausmaß des Bias auf der Platte Leser abhängen. Daher ist es wichtig, die globale Vorspannung des 96-Well lautet in Studien zu bewerten, die maximale Bevölkerungsdichte zu bestimmen. Handelsübliche Platte Leser, die alle ihre spezifischen globalen Voreingenommenheit haben, verursacht durch die Heizung und schütteln der Effizienz und der 96-Well-Mikroplatten unterscheiden sich vor allem durch die Dichtwirkung.
Diese Methode eignet sich für die systematische Analyse des Bakterienwachstums und es kann zur Analyse von zwei wichtigen Parameter, d. h., Wachstum Rate und Zelle Dichte, die häufig in den unterschiedlichsten Bereichen, wie Systembiologie, Evolution, gelten und Ökologie-16,-17. Die manuelle Berechnung mit Tabellenkalkulation wird eingeführt, um die Verarbeitung des raw lautet die ausgewerteten Parameter des Wachstums Rate und Zelle Dichte produzieren zu zeigen. Die stündliche Wachstumsraten werden zuerst von der rohen lautet der Wachstumskurve (Abb. 4A) laut Protokoll Abschnitt 4.6 als ein Dataset sequentielle Veränderungen in Wachstumsraten (Abbildung 4 b) berechnet. Die Mittel und die Standardabweichungen der alle fünf aufeinander folgende Wachstumsraten gegenüber dem Vorquartal erworben werden (Abbildung 4-D), und die größte durchschnittliche Wachstumsrate mit der kleinsten Standardabweichung ist definiert als die maximale Wachstumsrate des Wachstums Kurve (Abbildung 4-D, hervorgehoben). Die maximale Zelldichte (OD600) wird in ähnlicher Weise analysiert (Abbildung 4E-F). Die berechnete Wachstum Rate und Zelle Dichte werden anschließend weitere Analyse unterzogen. Beachten Sie, dass die beschriebenen Berechnungen automatisch durchgeführt werden können, mit Computer-Plattformen (Programmiersprachen), z. B.R und Python.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig1.jpg"> 
Abbildung 1 Wachstumskurven mit vielfältigen Methoden erworben. (A) mehrere Übernahmen von Wachstumskurven. Wachstumskurven von vier unterschiedlichen E. Coli -Stämme, die mit dem Ausdruck verschiedener Genome wurden in gewissem Sinne Hochdurchsatz-erhalten. Die E. Coli -Zellen wurden in minimalen mittleren M63 angebaut, und die Änderungen in OD600 mal gelesen wurden durch ein Lesegerät Mikrotestplatte in 1 h Abständen aufgenommen. Die Stämme von links, rechts sind die Wildtyp E. Coli W3110 (Nummer 0) und seine reduzierte Genomen Zahlen 1, 10 und 18 beschriebenen (zuvor5), beziehungsweise. (B) die Wachstumskurve mittels des KBE-Tests gewonnen. Wildtyp- E. Coli Zellen (Nummer 0) kultiviert wurden und wurden über mehrere Stunden zu den angegebenen Zeitpunkten beprobt. Die Wachstums-Änderungen wurden anhand der KBE-Assay geschätzt. Offenen Kreise zeigen die Aufnahme oder Probenahmestellen. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Reproduzierbare Messungen wiederholt. (A) über Nacht Kulturen der abwechslungsreichen Verdünnungs. E. Coli Zellen wurden in Röhren an mehreren Verdünnungsraten geimpft, die variiert von 1 bis zur 10,000-fold, wie angegeben. Die Zellen wurden bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 u/min für ca. 12 h kultiviert. OD600 Endwerte von fünf Zellkulturen (von links nach rechts) waren 1,51, 0,74, 0.05, 0,008 0,001, beziehungsweise. Die Kultur mit OD600 von 0,05 wurde für den gemeinsamen Glycerin Bestand verwendet. (B) hoch reproduzierbare Messungen. Sechs unabhängige Wachstumskurven (oben, graue Linien) von der gleichen E. Coli -Stamm wurden erworben und auf die Mikrotestplatte und zwei Fläschchen mit der gemeinsamen Glycerin bestand aus sechs Positionen berechnet. Die schwarze Linie entspricht dem Durchschnitt der sechs Wachstumskurven. Die Koeffizienten der Variation (CV) von den sechs wiederholten Messungen waren berechneten (unten), und die stetige Tiefpunkte sind in rosa überschattet. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig3.jpg"> 
Abbildung 3 globale Vorspannung des 96-Well-Format. (A) Heatmap Wachstumsraten. Der E. Coli Zelle bestand war in minimalen mittleren M63 suspendiert und ebenso in den 96 Vertiefungen der die Mikrotestplatte (dargestellt als Tabelle 12 × 8) geladen. Die Änderungen im OD600 erhielten mit dem Mikrotestplatte Reader, wie in Abschnitt 5 des Protokolls beschrieben. Die Abstufung von weiß bis rot zeigt die Wachstumsraten von 0,7 bis 0,9 h-1. (B) Heatmap des maximalen OD600. Die Abstufung von weiß bis rot zeigt die maximale OD600 Werte von 0,9 bis 1,2. Die Berechnungen für die Wachstumsrate und maximale OD600 sind wie in Abbildung 4beschrieben. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig4.jpg"> 
Abbildung 4 Analyse der Wachstumskurven. (A) Rohdaten von Wachstumskurven. Der stündliche OD600 liest sind gegen die Kulturzeit aufgetragen. Offenen Kreise zeigen die Abtastzeiten. (B) zeitliche Veränderung der Wachstumsraten. Stündliche Wachstumsraten zwischen zwei aufeinander folgenden OD600 mal gelesen werden gemäß der Gleichung in 4.6 beschrieben berechnet. Bedeuten Sie (C) hohe Wachstumsraten. Der Mittelwert der fünf aufeinander folgenden Wachstumsraten werden berechnet, um glatte Wachstumsraten geben. (D) Standardabweichungen vom Mittelwert Wachstumsraten. Die Standardabweichung der gleichen fünf aufeinander folgende Wachstumsraten wird berechnet. Die maximale Wachstumsrate mit der kleinsten Standardabweichung ist rot hervorgehoben. (E) bedeutet OD600. Der Mittelwert der fünf aufeinander folgende OD600 Werte errechnet sich die glatte OD600bestimmen. (F) Standardabweichungen der Mittelwerte OD600 . Standardabweichung der gleichen fünf aufeinander folgenden OD600 Werte errechnet. Die maximale OD600 mit der kleinsten Standardabweichung ist rot hervorgehoben. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Präzise, Hochdurchsatz-Analyse des Bakterienwachstums

Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Aufrufe.  University of Tsukuba. Quantitative Bewertung des Bakterienwachstums unbedingt mikrobielle Physiologie als Systemebene Phänomen zu verstehen. Ein Protokoll für experimentelle Manipulation und ein analytischer Ansatz eingeführt, ermöglicht präzise, Hochdurchsatz-Analyse der bakteriellen Wachstum, das ist ein zentrales Thema des Interesses in der Systembiologie.

Serie: Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Forschung

Biologie

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

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Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

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Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

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Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...