We would like to thank Gero Miesenb&#246;ck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.

The authors declare no competing interests.

Anwendungen von pHluorin zur Quantifizierung von endocytischen Ereignisse in Hefezellen macht von Transmembran- cargos in der die fluoreszierende Markierung an den zytoplasmatischen Schwanz des Proteins (1A) fusioniert ist. Für die Tests hier beschriebenen Frachten sind hell fluoreszierende, wenn die pHluorin Tag neutralen Umgebungen ausgesetzt ist, aber abgeschreckt werden, wenn die pHluorin Tag sauren Bedingungen trifft. So a pHluorin-markierte endocytic Ladung leicht an der zytoplasmatischen Gesicht der Plasmamembran detektiert und auf frühe Endosomen, aber &quot;dim&quot;, wenn sie in luminalen MVB Bläschen oder bei der Lieferung an die Vakuole Lumen eingebaut wird. In der Regel neu synthetisierten endocytic Frachten wahrscheinlich Endoplasmatischen Retikulum (ER) verlassen und in die Plasmamembran vor GFP erreichen und viele seiner Varianten voll ausgereift sind; Somit cargos-pHluorin markiert, die noch nicht an die Zelloberfläche erreicht wird vorhergesagt, nicht detektierbar zu bleiben, es sei denn Austritt aus dem ER oder Golgi i istmpaired. Verwendung pHluorin-tagged endocytic cargos wie STE3 und MUP1 wurde in den Hefe - CIE - Weg (1B) 8,18 beteiligt Charakterisierung einer Anzahl von Proteinen erleichtert. Genauer gesagt, der in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren verwendet wurden mit Defekten in CME 8 auf, die erhöhte Produktion des Aktin-modulierende GTPase Rho1 und seine GEF Rom1 fördern Endozytose in einer Vielzahl von Hefemutanten zu demonstrieren. Darüber hinaus wurden pHluorin-getaggt Frachten vor kurzem , dass α-Arrestine quantitativ zu demonstrieren verwendet, die haben gut etablierte Rolle in der CME 13-15,34-36, Fracht selektive Rollen sowohl in der CME und CIE und haben mechanistisch unterschiedliche Funktionen spielen in den beiden Bahnen 18. Für die Protokolle in diesem Papier dargelegt, mehrere wichtige Faktoren sollten berücksichtigt werden, um zu erhalten, konsistente, quantitative Ergebnisse. Zunächst MUP1-GFP oder MUP1-pHluorin Expression und Fluores-zenz abnehmen kann, wenn Hefezellen nähern oder die stationäre Wachstumsphase (nicht veröffentlichte Ergebnisse) eingeben; So wird aus einer Übernachtkultur gezüchtete Zellen sollte verdünnt werden, und für weitere 3 h (siehe Schritte 3,1-3,2 und 6,1-6,2)-re gezüchtet. Darüber hinaus, wenn mehrere experimentelle Bedingungen oder Dehnungen in Endpunkt-Assays oder für die Analyse durch Durchflusszytometrie Staffelung ist es wichtig, Daten für alle Proben nach der gleichen Dauer von Methionin Behandlung zu sammeln, um Vergleiche zwischen den individuellen Gegebenheiten zu ermöglichen. Für Post-Akquisitions-Analyse sollte Quantifizierung durchgeführt werden, um 16-Bit-Bilder verwenden, da Umwandlung in 8-Bit-Format zu Datenverlust führt, der die Fluoreszenzintensität Werte beeinflussen können. Außerdem sollte Hintergrundsubtraktion (Schritt 5.3) vor der Quantifizierung durchgeführt werden, da das Hintergrundsignal wesentlich Intensitätsunterschiede zwischen den Proben okkludieren kann. Während pHluorin-getaggt STE3 und MUP1 haben zugänglich Quantifizierung bewiesen, nichtalle Frachten werden pHluorin Tagging gut geeignet sein. Zum Beispiel versucht, den α-Faktor-Rezeptor Ste2 ergeben haben inkonsistent quantitative Ergebnisse zu markieren, möglicherweise aufgrund einer geringeren Fluoreszenzintensität von Ste2-pHluorin im Vergleich zu der STE3 oder MUP1 (nicht veröffentlichte Ergebnisse), obwohl es möglich ist, dass Tandem pHluorin Tags verbessern könnte die Signalintensität. Zusätzlich cargos mit sehr langsamen Raten von Liganden-induzierte Endozytose sein kann nicht zugänglich pHluorin zur Quantifizierung etikettieren, vor allem, wenn die Halbwertszeit der Internalisierung ist länger als die Hefezelle Zyklus (ca. 90 min). Für solche cargos könnte eine Abnahme der Fluoreszenz ergeben sich aus Endocytose und / oder aus Unterteilung der Fracht zwischen Mutter- und Tochterzellen bei der Zellteilung. So testet einzelne Frachten von Interesse empfohlen, um zu bestimmen, ob ihre Expression und Kinetik geeignet sind für pHluorin-Tagging und Quantifizierung. Obwohl die jüngsten Studien unter Verwendung von PHLuorin konzentriert sich hauptsächlich auf endocytic Ereignisse an der Plasmamembran, pHluorin-markierte Frachten können später Handel Ereignisse zu studieren im endocytischen verwendet werden. Zum Beispiel hat MUP1-pHluorin wurde in Durchflusszytometrie basierenden Assays von ESCRT-vermittelter Ladungs Sortierung in MVBs 37, da die pHluorin tag gequencht wird beim Einarbeiten in MVB luminalen Vesikel 20 erfolgreich eingesetzt. Dieser Ansatz ist ähnlich wie die in jüngerer Zeit beschriebenen Luciferase - Reporter der intraluminale Ablagerung (LUCID) Assay, der ein Biolumineszenz - Signal in Gegenwart von 38,39 Verwendung von Frachten mit einem zytoplasmatische Luciferase - Tag macht Luciferin zu erzeugen. Ähnlich wie bei der Abschreckung pHluorin Fluoreszenz bei der Einarbeitung in MVB luminalen Vesikeln, Biolumineszenz im LUCID Test wird bei der Gründung der Luciferase-Tag in MVB Vesikel gedämpft. Während pHluorin und LUCID Assays konzeptionell ähnlich sind, können pHluorin-markierte Frachten eingesetzt werden Endozytose und MVB Reifung zu studieren in intakten Zellen. Alternative Methoden existieren für die Quantifizierung der Endozytose, und haben in Wildtyp und endocytic mutierten Zellen wertvolle Informationen über die Preise der Ladung Internalisierung zur Verfügung gestellt. Beispiele umfassen die Überwachung Aufnahme von radiomarkiertem Liganden, wie α-Faktor (das dem Pheromon - Rezeptor bindet Ste2) und Uracil 40,41 oder Überwachung der Geschwindigkeit des Abbaus für endozytische cargos wie STE3 (die durch die Permease Fur4 internalisiert wird) , wie sie internalisiert und 42 zur Vakuole transportiert. Diese biochemischen Ansätze erfordern Zelllyse, und sind daher nicht geeignet für die direkte Quantifizierung in lebenden Zellen. Alternativ fluoreszenz α-Faktor markiert, um das Fluid-Phase Farbstoff Lucifer Yellow, oder die Styrylfarbstoffs FM4-64 verwendet werden können Endozytose in lebenden Zellen sichtbar zu machen, aber nicht zulassen , eine direkte Überwachung von endogen exprimierten Proteine Fracht 40,43,44. Für diese Ansätze, Persistenz der Fluoreszenz im vacuole Lumen kann Quantifizierung erschweren, wie mit GFP gesehen. Es ist auch möglich GFP-markiertes cargos zur Quantifizierung von Endozytose zu verwenden, indem Ganzzellfluoreszenzintensität zu messen und das Signal von cytoplasmatischen und endosomalen / vakuolären Kompartimente Subtrahieren; jedoch Endosomen und Vakuolen sind oft in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran. Im Gegensatz dazu sind pHluorin-tagged endocytic Frachten in MVB / Vakuole Fächer abgeschreckt, die einen deutlichen Vorteil für die Quantifizierung des Handels Ereignisse im Vergleich zu den mehr verbreiteten GFP-Tag sein kann. Unsere zukünftigen Studien wird nach heutigem Kenntnisstand von endocytic Wege und Frachtsortierung in Hefe erweitern zusätzliche Faktoren zu identifizieren, die CME und CIE beitragen, und die Mechanismen zu verstehen, die Fracht-Sortier Entscheidungen regeln.

Vesikeltransport spielt eine wichtige Rolle Organell Identität und Funktion in eukaryontischen Zellen beibehalten wird, und ist ein Schlüsselmechanismus Protein und Membranzusammensetzung der einzelnen zellulären Kompartimenten zur Regulierung. An der Plasmamembran, Fusion von Vesikeln Exozytose liefert neue Proteine ​​und Membranen auf der Oberfläche der Zelle, während die erzeugten Bläschen durch Endozytose Membran und Proteine ​​von der Oberfläche zum Lysosom zur anschließenden Wiederverwertung oder Targeting entfernen. Somit ist Endozytose wichtig für die Nährstoffaufnahme und für Reaktionen auf die extrazelluläre Umgebung. Exozytose und Endozytose werden ausgewogen Plasmamembranoberfläche zu regulieren, und der Umsatz von beschädigten Proteinen zu ermöglichen. Studien in Hefe und Säugerzellen haben eine große Anzahl von Proteinen in der Endozytose, sowie mehrere endocytic Wegen beteiligt identifiziert, die zu einer Vielzahl von en Internalisierung spezifischer Frachten oder diese Handlung als Reaktion fördernbungsbedingungen. Die am besten untersuchten Weg ist Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), in der Clathrin und zytosolischen akzessorischen Proteine ​​in einer Schichtstruktur zusammenstellen, die im Entstehen begriffenen endocytic Vesikel zu stabilisieren. Experimente in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae haben wichtige Einblicke in die Dynamik und die Reihenfolge der Rekrutierung ergab für viele endocytic Proteine 1-3. Bemerkenswerterweise wird die CME Maschinen stark durch die Evolution konserviert, so dass die Mehrheit der CME-verwandten Proteinen in Hefe menschliche Orthologe haben; Somit Hefe Knospung hat ein wichtiges Werkzeug für das Verständnis der Mechanismen der Endozytose gegeben, die in höheren Eukaryonten konserviert sind. Zum Beispiel Studien Bäckerhefe mit bestimmt, dass die Bildung und Reifung von CME-Strukturen (als kortikalen Aktin-Patches in Hefe bezeichnet) umfasst die schrittweise Einstellung vieler Proteine, beginnend mit Clathrin und Fracht-bindenden Adapterproteine, gefolgt von Einstellung zusätzlicher endocytic Zubehör Proteine,Aktivierung von Arp2 / 3-vermittelte Aktin - Polymerisation und die Rekrutierung von Proteinen in Vesikel scission 1,2 beteiligt. Die Rekrutierung von CME Maschinen Proteine ​​Aktin-Patches zu kortikalen ist eine hoch geordnete und stereotypisch Prozess, und die genaue Reihenfolge der Rekrutierung für viele Proteine ​​in Bezug auf andere Komponenten der CME Maschinen etabliert. Wichtig ist , dass die jüngsten Studien haben eine ähnliche Reihenfolge der Rekrutierung für CME Proteine bei Clathrin beschichteten Gruben in Säugetierzellen 4 bestätigt. Neben CME besitzen viele Zelltypen eine oder mehrere Clathrin-unabhängige endocytic (CIE) Wege , die auf alternative Mechanismen beruhen Vesikelbildung und Internalisierung von der Plasmamembran 5-7 zu fördern. In Hefe identifizierten wir vor kurzem eine CIE - Weg, der die kleine GTPase Rho1 und seine Aktivierung Guaninnukleotidaustauschfaktor (GEF), Rom1 8,9 verwendet. Rho1 aktiviert die formin Bni1 Actinpolymerisation 1 zu fördern0,11, die für diese Form der Clathrin-unabhängige Endozytose in Hefe 12 erforderlich ist. Außerdem rekrutieren die α-Arrestin Familie von Proteinen , die Ubiquitin - Ligase Rsp5 zur Ladung Ubiquitinierung und anschließende Internalisierung durch CME 13-17, und auch fördern Ladung Internalisierung über den CIE - Weg, möglicherweise durch direkte Interaktion mit Proteinen beteiligt in CIE 18 fördern. Eine Vielzahl von CIE Wege existieren auch in Säugerzellen, einschließlich Clathrin-unabhängige und phagozytischen Bahnen , die auf der Rho1 Ortholog verlassen, RhoA 9,19. Die Rolle von RhoA in Säuger CIE ist wenig bekannt; also Studien in Bäckerhefe kann zusätzliche mechanistische Erkenntnisse liefern, die auf Säugetier CIE anwendbar sind. Eine genaue Quantifizierung von endocytic Ereignisse können, Endozytose bei der Regulierung der wichtige Informationen über die Rollen von spezifischen Proteinen liefern und die Auswirkungen der Mutationen auf die Ladung Verinnerlichung oder progressio offenbarenn durch den endocytischen. Zu diesem Zweck können biochemische Verfahren verwendet werden, Liganden-Aufnahme zu überwachen oder Abbauraten von endocytischen Frachtproteinen zu messen. In lebenden Zellen Fusion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und dessen Varianten Frachten von Interesse ermöglicht die direkte Visualisierung von Frachtverkehr. Allerdings GFP-markierten Frachten sind von begrenztem Nutzen für die Quantifizierung der Endozytose, weil GFP zu einem Abbau in den Lysosomen (oder Vakuole in Hefe) resistent ist. Außerdem ist GFP - Fluoreszenz nur teilweise empfindlich gegenüber Änderungen in pH und bleibt innerhalb der Vakuole Lumen 20,21 nachweisbar. Folglich Fluoreszenz des GFP-Tag besteht in der Vakuole, lange nachdem der Rest der Ladung abgebaut worden ist, und ganze zellbasierten Quantifizierung von Ladungsintensität kann durch langfristige GFP-Fluoreszenz in die Vakuole ungenau sein. Um die Nachteile von vakuolären GFP-Fluoreszenz zu überwinden, wir zuvor Verwendung superecliptic pH gemachtluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP , die hell bei neutralem pH fluoresziert, verliert aber Fluoreszenz in sauren Umgebungen , wie beispielsweise das Lumen der Vakuole / Lysosomen 20,22,23. Eine pHluorin Tag auf der zytoplasmatischen Schwanz von endocytischen cargos Platzierung erlaubt die Visualisierung der Frachten an der Plasmamembran und am frühen Endosomen, in denen die pHluorin Tag in das Zytoplasma (1A) ausgesetzt bleibt. Bereits Endosomen reifen, die Endosomen Sortierkomplexe , die für Transport (ESCRT) Maschinen - Pakete oberflächen lokalisierte Frachten in Vesikeln, die in das Lumen des Endosomen Knospe, Erzeugung multivesicular Körper (MVBs) 24. Für Frachten, die in interne MVB Vesikel aufgenommen wurden, steht die pHluorin Tag in Richtung der Vesikel Lumen. Interne MVB Vesikel werden angesäuert; so verlieren pHluorin-markierte Frachten Fluoreszenz auf frühe Endosomen , wie sie reifen in MVBs 20. Die anschließende Verschmelzung der MVB mit der Vakuole liefert die MVB luminalen Inhaltefür den Abbau und pHluorin Tags bleiben in der sauren Umgebung der Vakuole Lumen gequencht. Dieses Dokument enthält detaillierte Beschreibungen der quantitativen endocytic Assays Cargos mit zytoplasmatischen pHluorin Tags in Hefe verwendet. Die Stämme pHluorin-markierte Frachten exprimieren, können in kinetische und / oder Endpunkt-Assays verwendet werden, abhängig von den Eigenschaften und den Handel Verhalten der spezifischen Ladung. Darüber hinaus sind einige pHluorin-tagged cargos zugänglich Hochdurchsatz-Analyseverfahren, einschließlich Durchflusszytometrie. Wichtig ist, dass die pHluorin Tag ein vielseitiges Werkzeug für die in lebenden Zellen endocytic Ereignisse zu studieren, so dass eine Quantifizierung der Endozytose und den Vergleich von endocytic Funktion in Wildtyp und Mutantenstämmen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Adenine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8626-25G</td>
			<td style="width:167px;">Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacto-agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-2</td>
			<td>Use for preparation of plate media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids)</td>
			<td>BD</td>
			<td>291920</td>
			<td>Use for preparation of liquid and plate media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concanavalin A</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5275-5MG</td>
			<td>Use for coating of chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP350-1</td>
			<td>Use for preparation of liquid and plate media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP382-100</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>Acros</td>
			<td>125121000</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP386-100</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP388-100</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP395-100</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tyrosine</td>
			<td>Acros</td>
			<td>140641000</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155411</td>
			<td>Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>Use for preparation of amino acid mixture and stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axiovert 200 inverted microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Custom Build</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Objective should be 100X, 1.4NA or higher</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sensicam</td>
			<td style="width:71px;">Cooke Corporation</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Camera should have 12-bit or higher dynamic range</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">X-Cite 120PC Q Illumination Source</td>
			<td style="width:71px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Slidebook 5 software</td>
			<td style="width:71px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:71px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of phluorin for quantitative, kinetic and high-throughput analysis of endocytosis in budding yeast

Das grün fluoreszierende Protein (GFP) und seine Varianten sind Werkzeuge zur Untersuchung von Proteinlokalisierung und Dynamik von Ereignissen wie Zytoskelett-Umbau und Vesikeltransport in lebenden Zellen weit verbreitet. Quantitative Methoden unter Verwendung von chimären GFP-Fusionen wurden für viele Anwendungen entwickelt; jedoch GFP ist etwas resistent gegen Proteolyse, wodurch seine Fluoreszenz bleibt im Lysosom / Vakuole, die Quantifizierung von Frachthandels in der endocytischen behindern können. Ein alternatives Verfahren zur Quantifizierung Endozytose und post-endocytic Handel Ereignisse nutzt superecliptic pHluorin, eine pH-sensitive Variante von GFP, die in sauren Umgebungen abgeschreckt wird. Chimäre Fusion von pHluorin zum Zytoplasmaschwanz von Transfracht-Proteine ​​führt zu einer Dämpfung der Fluoreszenz bei der Gründung der Ladung in multivesicular Körper (MVBs) und Auslieferung an die Lysosomen / Vakuole Lumen. Somit Löschung der Vakuole Fluoreszenz erleichtert quantifiKation der Endozytose und der frühen Ereignisse im endocytischen. Dieses Papier beschreibt Methoden pHluorin-markierte Frachten für die Quantifizierung der Endozytose über Fluoreszenzmikroskopie sowie populationsbasierten Assays Durchflusszytometrie verwendet wird.

Watch this Scientific Journal Video about Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast at JoVE.com

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

applications-phluorin-for-quantitative-kinetic-high-throughput

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Aufrufe.  The Johns Hopkins University. Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Serie: Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...