Os autores não têm nada para divulgar.

1. preparar o meio de crescimento Nota: A composição química do mínimo M63 médio é a seguinte: 62 mM K 2 HPO 4, 39 milímetros KH 2 PO 4, 15mm (NH 4) 2 SO 4, 1,8 µM Filipa 4, 15 µM tiamina-HCl, 0,2 mM de MgSO 4 e glicose de 22 mM. M63 é feita pela mistura de três soluções estoque: solução X cinco, 20% de glicose e MgSO 4 solução de tiamina. Armazene todas as soluções a 4 ° C.
<ol><li>Preparar a solução de 5 X <ol><li>para preparar a solução de 4 Filipa, use uma pipeta elétrica e uma pipeta sorológica descartável para adicionar ddH 2 O tubo de centrífuga de 50 mL. Use um P-200 para adicionar 0,06 mL HCl para obter 0,01 M HCl. Adicione 36 mg Filipa Ferreira 4-7 H 2 O e misturar bem.</li>
		<li>Medir 160 mL ddH 2 O em uma proveta graduada e adicioná-lo para um copo de 500 mL. Adicione o seguinte nesta ordem: 10,72 g K 2 HPO 4, g 5,24 KH 2 PO 4, 2,0 g (NH 4) 2 SO 4 e 0,5 mL de solução de 4 de Filipa (preparada na etapa 1.1.1).</li>
		<li>Usando um medidor de pH de precisão, ajustar o pH a 7,0 adicionando 2 M KOH. Despeje a solução em uma proveta graduada e adicionar O ddH 2 para um volume total de 200 mL. Esterilizar a solução usando uma unidade de filtração de 250 mL (PVDF, 0,22 µM).</li>
	</ol></li> <li>Preparar a solução de glicose 20% <ol><li>medir 200ml ddH 2 O em uma proveta graduada e derramá-lo para um copo de 500 mL. Enquanto mistura utilizando um agitador magnético, adicione 50 g de glicose. Dilua a solução em uma proveta graduada para um volume total de 250 mL. Esterilizar a solução, conforme descrito na etapa 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>Preparar a solução de tiamina MgSO 4 <ol><li>Adicionar 150 mL ddH 2 O para um copo de 500 mL. Enquanto mistura com um agitador magnético, adicione 1,0 g de tiamina-HCl e 10 g de MgSO 4-7 H 2 O. Dilua a solução em uma proveta graduada para um volume total de 200 mL. Esterilizar a solução, conforme descrito na etapa 1.1.3.</li>
	</ol></li> <li>M63 médio mínimo de preparação <ol><li>Coloque a solução de 5 X, a solução de glicose de 20%, a solução de tiamina MgSO 4, uma pipeta eletrônica, uma pipeta P-200 e pontas de pipetas de 200 µ l sobre uma bancada limpa.</li>
		<li>Medir 155,8 mL ddH 2 O em uma proveta graduada e despeje em um copo de 500 mL.</li>
		<li>Usando a pipeta eletrônica e pipeta sorológica descartável, adicionar 40 mL de solução X 5 e 4 mL de solução de glicose 20% para o ddH medido 2 O. Em seguida, adicione 0,2 mL de solução de tiamina MgSO 4 com o P-200. Esterilizar a solução, conforme descrito na etapa 1.1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparando o estoque de glicerol cultura <ol><li>celular Nota: as cepas bacterianas (por exemplo, W3110 e seus genomas reduzidas) estão disponíveis a partir de organizações bancárias de estirpe. As cepas são geralmente obtidas sob a forma de colônias em placas de ágar.
	<ol><li>Coloque cinco tubos de vidro esterilizado com rolhas de borracha de silicone, uma pipeta eletrônica, P-1,000, pontas de pipetas de 1.000 µ l, P-200, pontas de pipetas de 200 µ l e as estirpes alvo (colônias em placas) sobre uma bancada limpa.</li>
		<li>Expor a boca do tubo de vidro para um bico de Bunsen antes de abrir a tampa de borracha do silicone. Expor a rolha de borracha do silicone da chama depois que o tubo é aberto e em seguida levemente Coloque a tampa de volta no tubo de vidro.</li>
		<li>Usar o eletrônica pipeta e pipeta sorológica descartável para adicionar 5ml M63 para um dos tubos de vidro e 4,5 mL M63 aos outros quatro tubos.</li>
		<li>Use a ponta de P-200 para escolher uma colônia e inoculá-lo no tubo de vidro contendo 5ml M63.</li>
		<li>o tubo de vórtice tornar-se uma suspensão. Em seguida, diluir a solução 10-fold ao transferir 0,5 mL desta solução para um dos quatro tubos contendo 4,5 mL M63.</li>
		<li>Repetir o processo descrito na etapa 2.1.5 para os tubos restantes. Uma série de diluição com cinco diferentes concentrações (diluições de 1, 10, 100, 1000 e 10.000) está agora pronto.</li>
		<li>Esterilizar as bocas dos tubos de vidro e as rolhas de borracha do silicone, conforme descrito na etapa 2.1.2. Tampa os tubos com as rolhas. Evitar a contaminação por não enrugar-se as rolhas de borracha de silicone.</li>
		<li>Coloque os cinco tubos numa incubadora de agitação previamente aquecido a 37 ° C e agitar a 200 rpm. Incubar a cultura durante a noite ou para 10 a 30 h.</li>
	</ol></li> <li>Seleção da cultura para o estoque de glicerol <ol><li>Coloque o médio pré-aquecido temperatura M63, P-1,000, pontas de pipetas de 1.000 µ l e uma cubeta descartável sobre uma bancada limpa.</li>
		<li>Adicionar 1000 µ l M63 para uma cubeta descartável com uma P-1, 000. Coloque a cubeta descartável em um espectrofotômetro, iniciar o programa em um comprimento de onda fixo de 600 nm e medir o espaço em branco.</li>
		<li>Mover os tubos de vidro de cinco de incubadora tremendo para o banco limpo.</li>
		<li>M63 descartar da cubeta descartável e adicionar 1.000 cultura µ l para a mesma cubeta descartável com uma P-1, 000. Medir a turbidez óptica da cultura de pilha (OD 600), conforme descrito na etapa 2.2.2. 
		Nota: Para evitar qualquer contaminação e para conseguir uma medição precisa, expor os tubos de vidro e as rolhas à chama conforme descrito e vórtice a cultura antes da amostragem. Para garantir resultados confiáveis, medidas repetidas são recomendadas, particularmente quando a densidade celular é baixa.</li>
		<li>Dos cinco culturas de células, escolha um que está em fase inicial de crescimento exponencial (OD 600 = 0,01 - 0,05) para o estoque de glicerol. 
		Nota: Se múltiplas culturas têm densidade dentro da faixa ideal, o mais próximo de 0,05 é comumente selecionado.</li>
	</ol></li> <li>As existências de glicerol para testes repetidos. 
	Nota: Isto é descrito para a preparação de dez ações. Quantidades maiores ou menores podem ser feitas de acordo com as condições experimentais.
	<ol><li>Coloque a solução de glicerol 60% esterilizada, dez esterilizados microtubos de 1,5 mL, P-1,000 e P-200, pontas de pipetas de 1.000 e 200 µ l e um microtubo pisar um banco limpo.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l esterilizado 60% solução de glicerol e 750 µ l a cultura de célula selecionada para o microtubo de 1,5 mL e misture pipetando. 
		Nota: O volume de ações é variável, mas sempre manter uma relação de 1:3 de 60% de glicerol para cultura de células; Isso resulta em uma concentração final de 15% de glicerol.</li>
		<li>Coloque os restantes nove microtubos no stand microtubo e dispensar 100 µ l da mistura preparada na etapa 2.3.2 a cada tubo. Agora, existem dez unidades populacionais de glicerol idênticos para uso futuro.</li>
		<li>Armazenar os estoques em um congelador a -80 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 3. Adquirindo as curvas de crescimento <ol><li>configurar o leitor de microplacas. 
	Nota: Os termos mostrados em aspas mostrar o fraseado específico usado na leitora de placa usado aqui (veja a tabela de materiais).
	<ol><li>Abrir o software. Aberto &#34; protocolos de &#34; em &#34; Gerenciador de tarefas &#34; e escolha &#34; criar nova &#34;. Escolha &#34; protocolo padrão &#34;.</li>
		<li>Open &#34; procedimento &#34; e ajustar as configurações. Aberto &#34; temperatura definida &#34; e selecione &#34; incubadora na &#34;. Conjunto &#34; temperatura &#34; a 37 ° C e &#34; gradiente &#34; para 0 ° C. Check &#34; Preaqueça &#34; antes de continuar com a próxima etapa. Aberto &#34; começar a cinética &#34;, conjunto &#34; tempo de execução &#34; para 24:00:00 ou 48:00:00, e &#34; intervalo de &#34; para 00:30:00 ou 01:00. 
		Nota: Demora cerca de 1 min para ler um inteiro 96 placa bem.</li>
		<li>Open &#34; Shake &#34; e defina &#34; Shake modo &#34; como &#34; Linear &#34;. Verificar &#34; Cosalvaguardar o Shake &#34; e defina &#34; frequência &#34; em 567 cpm. Aberto &#34; leitura &#34;, verificar &#34; absorvância &#34;, &#34; Endpoint/cinética &#34;, e &#34; Monochromators. &#34; conjunto &#34; comprimento de onda &#34; a 600.</li>
		<li>Clique &#34; Validate &#34; para confirmar que o procedimento está correto. Clique em &#34; salvar &#34; para salvá-lo como um novo programa para uso futuro.</li>
	</ol></li> <li>Em tempo real, gravação de crescimento <ol><li>desenhar um pictograma placa de 96 poços (8 × 12 tabela) para indicar as posições das amostras de cultura inoculado na placa de 96 poços. Imprima a tabela e usá-lo como uma referência para o experimento. 
		Nota: Os poços localizados nas bordas do microplate devem conter apenas médio em branco por causa da evaporação.</li>
		Microplacas de fundo <li>lugar um apartamento 96 poços esterilizado com tampa, P-1000, pontas de pipetas de 1000 µ l, P-200, pontas de pipetas de 200 µ l, vários microtubos de 1,5 mL, uma pipeta multicanal-8, um reservatório de reagente esterilizado, temperatura M63 e o glicerol estoques (preparados no passo 2.3) sobre uma bancada limpa.</li>
		<li>Adicionar cerca de 25 mL M63 para o reservatório de reagente. Use este estoque de reservatório para todas as etapas a seguir.</li>
		<li>µ L adicionar 900 M63 para os microtubos em preparação para fazer diluições em série.</li>
		<li>Descongelar o estoque de glicerol em temperatura ambiente. Adicionar 900 µ l M63 para o estoque de glicerol descongeladas e vortex. Isso resulta em uma diluição de 10 vezes da unidade populacional de glicerol original.</li>
		<li>Transferir 100 µ l da diluição 10 vezes para outro microtubo contendo 900 µ l de M63 e vortex. Isso resulta em uma diluição de 100 vezes.</li>
		<li>Repita o passo 3.2.6 até o número desejado de diluições é alcançado.</li>
		<li>Encher os poços na borda do microplate com 200 µ l M63 usando uma pipeta de 8 canais (P-200). 
		Nota: Estes poços podem ser usados como o espaço em branco.</li>
		<li>Carga 200 µ l de cada diluído amostra preparada em etapas 3.2.4 - 3.2.7 para os poços da microplaca de acordo com a tabela de referência (passo 3.2.1). Vórtice a prévia de amostras diluídas para carga e carga a mesma amostra em vários poços em variados locais na placa.</li>
		<li>Coloque o leitor de microplacas de 96 poços.</li>
		<li>Open &#34; Leia agora &#34; em &#34; Gerenciador de tarefas &#34; e escolha o programa (seção 3.1). Clique &#34; Okey &#34; para iniciar a medição. Salve a gravação como um novo arquivo experimental para análise de dados (seção 4).</li>
	</ol></li></ol> 4. Análise de dados <ol><li>exportação dos resultados dos dados em tempo real de taxa de crescimento (seção 3.2) para uma memória USB vara como um arquivo de texto. 
	Nota: Um resultado formatado 96 poços (curvas) irá exibir na leitora de placa em tempo real. Os registros de hora em hora (valores de OD) podem ser exportados como uma tabela; as linhas e colunas representam os números bem (por exemplo, A1, B1) e o tempo de medição (por exemplo, 00:00:59), respectivamente.</li>
	<li>Abrir o arquivo de texto com um software de planilha eletrônica.</li>
	<li>Copie o lê de 600 OD horário de microplacas de 96 poços para uma nova planilha para uma análise mais aprofundada.</li>
	<li>Subtrair o fundo lê no tempo zero das leituras horárias de cada amostra bem. 
	Nota: Para sua conveniência, o valor médio do branco poços contendo M63 (etapa 3.2.8) pode ser usada como o valor de background.</li>
	<li>Calcular a média de cinco consecutivos OD 600 leituras para estimar a densidade populacional máxima. 
	Nota: O maior valor médio das cinco leituras consecutivas de 600 OD é definido como o máximo de OD 600 da curva de crescimento correspondente.</li>
	<li>Calcular a taxa de crescimento, μ (h -1), aplicando-se a seguinte equação para todos os pares de valores consecutivos de OD 600: 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56197/56197eq1.jpg" /> Nota: nesta equação, C eu e C i + 1 representam os valores de 600 de OD de quaisquer dois pontos de tempo consecutivos (t eu e t i + 1, respectivamente). LN indica o logaritmo natural.</li>
	<li>Calcular as alterações na taxa de crescimento ao longo do tempo com base na cada hora OD 600 lê conforme item 4.6. Calcular a média e o desvio padrão das taxas de crescimento consecutivo cinco para estimar a taxa de crescimento máxima. 
	Nota: A maior média com o menor desvio padrão é definida como a taxa de crescimento máxima da curva de crescimento correspondente.</li>
</ol> 5. Confirmando o viés Global das leituras de 96 poços (opcional) Nota: tanto a placa leitor e a placa de 96 poços consumível podem causar medições tendenciosas. Para conseguir resultados quantitativos altamente precisos e reprodutíveis, confirmando a tendência global da placa de 96 poços é altamente recomendado.
<ol><li>Preparar a placa de 96 poços e o leitor para o teste de bias, conforme descrito na seção 3.2.2.</li>
	<li>Adicionar 20 mL M63 para um tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado. Adicione o caldo de glicerol para o mesmo tubo de centrífuga e vortex. Transferir a solução de suspensa para um reservatório de reagente esterilizado.</li>
	<li>Utilizar uma pipeta de 8 canais para transferir 200 µ l da solução de suspensão para a placa de 96 poços.</li>
	<li>Colocar a placa de 96 poços na leitora de placa e iniciar a medição.</li>
	<li>Registro de hora em hora OD 600 lê e analisar como descrito na seção 4. Comparar a densidade de população e taxa de crescimento máximo calculado de cada poço para determinar a localização viés das leituras de 96 poços.</li>
</ol>

<ol>
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Agradecemos Kohei Tsuchiya fornecendo o exemplo de ensaio de UFC. Este trabalho foi parcialmente financeiramente apoiado por um subsídio para investigação científica (C) no. 26506003 (para BWY) do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia, Japão.

Passos críticos no protocolo incluem a preparação de um estoque comum de células e a replicação das mesmas amostras em vários poços em várias posições na microplate exponencialmente crescentes. Anteriormente, microbiólogos começaram a cultura de uma pre-cultura durante a noite. Enquanto este método pode reduzir o tempo de retardo de crescimento bacteriano, é difícil conseguir-se curvas de crescimento podem ser reproduzidos. Como mostrado na Figura 2, as medições independentes usando as ações comuns de glicerol resultaram em curvas de crescimento quase idênticos, que fornecem resultados precisos e reprodutíveis. Como mostrado na Figura 3, poços em várias localidades dar leituras ligeiramente diferentes, que é considerado o fundo global das medições. Para a avaliação quantitativa do crescimento bacteriano, deve ser considerado neste contexto. Inoculação de amostras de vários poços em locais variados placa para replicação experimental é altamente recomendada para contabilizar a polarização global.
Além de lidar com erros, devem ser consideradas a modificação e resolução de problemas derivados dos dispositivos experimentais e suprimentos. Vários leitores de microplacas avançados estão disponíveis comercialmente. Eles mostram uma grande variação de características, tais como o método de ajustar o comprimento de onda de luz, o modo de aquecimento ou de arrefecimento e a forma e frequência de agitação. Baseado em nossa experiência, evaporação deve ser dirigida em estudos de alta produtividade porque as variações de volume líquido influenciam grandemente OD600 leituras. Evaporação é causada pelo método de aquecimento usado pelos leitores de microplacas e a arquitetura das microplacas. Os dois modos de aquecimento comumente implementado em leitores de microplacas comercial são de aquecimento por ar quente e de aquecimento com uma chapa quente. O leitor de microplacas utilizado neste protocolo usado a chapa como um método de aquecimento para diminuir a evaporação porque o meio em microplate iria rapidamente secar no ar quente soprando. As microplacas também devem ser cuidadosamente selecionadas. Diferente de 96 poços microplacas (com tampas) causam diferentes níveis de evaporação. O método descrito utiliza o formato de placa com uma tampa coberta profunda, que reduz a evaporação.
Além disso, se o estudo requer análise de fase estacionária da curva de crescimento, então a forma e a frequência de tremer no leitor de microplacas devem ter em conta. Agitação durante a cultura garante que as células de crescimento estão suspensos uniformemente na mídia. Agitação inadequada ou baixa frequência pode causar as células a pilha em torno da borda bem ou no centro em uma densidade alta, resultando em leituras falsas que são inferior ou superior leituras reais. O método descrito usos bidirecional linear, tremendo. Enquanto o modo tremendo em forma de 8 é provavelmente suficiente, não é recomendável o modo circular de tremer.
A grande limitação desse método é a evaporação do meio de cultura celular. Desde que o volume máximo de cultura é pequeno, ou seja, 200 µ l, incubação a 37 ° C provoca evaporação significativa. Assim, esse método é inadequado para o cultivo de mais de 48 h. Além disso, culturas de células de baixa densidade devem ser evitadas porque a detecção óptica (OD600) está limitada a essas densidades. Quando considerados em conjunto, células/estirpes de crescimento muito lentas ou muito baixa concentração inicial culturas não são preferidas, como eles exigem mais tempo e estão abaixo do limite de detecção de OD600.
Este método produz medições precisas, alta produtividade, que são altamente vantajosas para pesquisas sistemáticas. Como um resultado representativo, este método permite avaliar uma variedade de cepas de Escherichia coli com várias sequências genômicas e/ou médio facilmente e reproducibly5. Quando comparado aos métodos tradicionais de cultivo em tubos e amostras em pontos diferentes do tempo de medição manualmente, o método descrito é menos trabalho e tempo intensivo. Desenvolvimento do método e aplicações futuras são assumidos como envolvem a automação de manipulação experimental e análise computacional. Aplicação automática de medição e robótica vai levar a um método altamente eficiente e confiável de avaliar o crescimento celular e realizando testes de sobrevivência usando células bacterianas e de mamíferos.

Estudos microbiológicos muitas vezes começam com a cultura de células bacterianas e a avaliação das curvas de crescimento bacteriano, que representam um fenômeno fundamental da fisiologia bacteriana1,2,3. Princípios básicos de cultura estão amplamente disponíveis na literatura de pesquisa publicados e livros didáticos, porque a cultura bacteriana é uma metodologia fundamental. No nível do banco, substancial atenção tradicionalmente tem sido focada na otimização de meios de crescimento e condições de cultivo, mas controlando a taxa de crescimento, que provavelmente proporcionará maior compreensão da fisiologia microbiana, não foi extensivamente estudados4. Para bactérias de crescimento exponencial, um parâmetro chave do estado celular é a taxa de crescimento, o que foi relatada para ser coordenado com o genoma, transcriptoma e proteoma5,6,7,8 . Assim, a avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é crucial para a compreensão fisiologia microbiana.
Para avaliar o crescimento bacteriano, os métodos experimentais utilizados para estimar a biomassa são bem estabelecida9,10 e baseiam-se na detecção de parâmetros bioquímicos, físicos ou biológicos, tais como turbidez óptica. Além disso, os métodos analíticos utilizados para capturar as propriedades dinâmicas de mudanças de crescimento comumente são baseados em modelos não-lineares estabelecida11,12,13, por exemplo, as equações logísticas. Dinâmica de crescimento geralmente é adquirida por amostragem cronometrada do crescimento celular em cultura por medição óptica turbidez ou realizando ensaios de unidade (CFU) formadoras. A limitação destes métodos de cultivo e deteção é que os pontos de dados não são um verdadeiro reflexo da dinâmica populacional, porque os intervalos de medição são muitas vezes em horas e a condição da cultura (por exemplo, mudanças na temperatura e aeração) é perturbada no momento da amostragem. Técnicas de cultura e análise devem ser atualizadas usando o desenvolvimentos recentes na tecnologia e na compreensão. Avanços recentes em leitores de microplacas permitem a observação em tempo real de crescimento bacteriano e diminuem significativamente os custos trabalhistas. Usando estes dispositivos avançados, os últimos estudos sobre crescimento bacteriano relataram métodos analíticos para medições de alta produtividade14,15.
O propósito do presente protocolo é avaliar a dinâmica de crescimento precisa de uma forma de alto rendimento, que será valiosa para estudos quantitativos que, finalmente, abordar as questões de como a taxa de crescimento é determinada e que fatores afetam a taxa de crescimento. O protocolo aborda todos os fatores que devem ser tomados em consideração para a quantificação precisa e repetível de crescimento bacteriano. O método experimental e a análise são descritas em detalhes no texto principal. Este método permite a análise precisa e reprodutível de crescimento bacteriano de uma forma de alta produtividade. Microbiologistas podem usar este protocolo para derivar resultados quantitativos adicionais de suas evidências experimentais. Este protocolo também pode ser usado para estudos em biologia de sistemas que tentam tirar conclusões conceituais ou para alcançar uma visão teórica de crescimento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>164-04295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>166-04255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-03435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td>Wako</td>
			<td>138-00415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiamine-HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>201-00852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>049-31165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O)</td>
			<td>Wako</td>
			<td>094-01082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-21815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>075-00611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (50 mL, sterilized)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>1342-050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 200 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-705Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>110-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube (1.5 mL)</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>131-715C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 multichannel-pipette</td>
			<td>WATSON</td>
			<td>NT-8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PASORINA STIRRER</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>2-4990-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cylinder (200 mL)</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>1-8562-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision pH mater</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>AS800 / 1-054-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-200</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman P-1000</td>
			<td>GILSON</td>
			<td>1-6855-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (10 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Serolocical Pipettes (25 mL)</td>
			<td>SANPLATEC</td>
			<td>SAN27015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtube stand</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>801-02Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>BM Bio</td>
			<td>BM-V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 3370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar reagent reservoir (50 mL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 &#181;M)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGVU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>DRUMMOND</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioshaker (BR-23UM MR)</td>
			<td>TAITEC</td>
			<td>0053778-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposal cell (1.5 mL)</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>1938 / 2-478-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A23616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPOCH2</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>2014-EP2-002 / EPOCH2T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>82-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIO clean bench</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCV-B131F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>NICHIDEN RIKA GLASS</td>
			<td>P-10M~P-30 /101019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone rubber stoppers</td>
			<td>ShinEtsu Polymer</td>
			<td>T-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains</td>
			<td>Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precise, high-throughput analysis of bacterial growth

Crescimento bacteriano é um conceito central no desenvolvimento da moderna fisiologia microbiana, bem como na investigação da dinâmica celular a nível de sistemas. Estudos recentes têm relatado correlações entre o crescimento bacteriano e eventos de todo o genoma, tais como reorganização de redução e transcriptoma do genoma. Analisar corretamente o crescimento bacteriano é crucial para a compreensão da coordenação de crescimento dependente de gene funções e componentes celulares. Nesse sentido, a avaliação quantitativa precisa de crescimento bacteriano em forma de alto rendimento é necessária. Desenvolvimentos tecnológicos emergentes oferecem novas ferramentas experimentais que permitem atualizações dos métodos utilizados para estudar o crescimento bacteriano. O protocolo introduzido aqui emprega um leitor de microplacas com um procedimento experimental altamente otimizado para a avaliação do crescimento bacteriano preciso e reprodutível. Este protocolo foi utilizado para avaliar o crescimento de vários descrito anteriormente estirpes de Escherichia coli . As principais etapas do protocolo são os seguintes: a preparação de um grande número de ações de célula em pequenos frascos para testes repetidos com resultados reprodutíveis, o uso de placas de 96 poços para avaliação de crescimento elevado-throughput e o cálculo manual de duas principais parâmetros (ou seja, densidade de população e taxa de crescimento máxima) que representa a dinâmica de crescimento. Em comparação com o tradicionais formadoras unidade (CFU) do ensaio, que conta as células que são cultivadas em tubos de vidro ao longo do tempo em placas de ágar, o presente método é mais eficiente e fornece registros temporais mais detalhados das alterações de crescimento, mas tem um mais rigorosas limite de deteção em densidades de população baixas. Em resumo, o método descrito é vantajoso para a análise da elevado-produção precisa e reprodutível de crescimento bacteriano, que pode ser usado para tirar conclusões conceituais ou fazer observações teóricas.

O método descrito fornece um meio de capturar dinâmico crescimento bacteriano de forma contínua, alta produtividade, utilizando um leitor de formato de 96 poços que leva várias medições de densidade óptica em vários intervalos de tempo (de minutos a horas e dias). As curvas de crescimento de uma variedade de cepas de Escherichia coli expressando vários genomas podem ser adquiridas precisamente em uma única experiência (figura 1A). Em comparação com o método descrito, o método tradicional (o ensaio CFU) geralmente exige mais longos intervalos de tempo de amostragem (figura 1B) e trabalho intensivo se cultura múltiplas é necessária. Além disso, cada cultura tempo de amostragem para o ensaio CFU requer o uso de um pequeno volume de cultura de células que não pode ser usado para medidas repetidas. Além disso, um número limitado de pontos de tempo para a deteção pode perder os pontos de amostragem que são necessários para o cálculo correto da taxa de crescimento e o OD máximo600. No entanto, o ensaio da UFC tem um limite de detecção inferior, 103 - 104 células/mL, tornando-se pelo menos duas ordens de magnitude mais sensível do que o ensaio de turbidez óptica (OD600= 0,001, que tem um limite de detecção de aproximadamente 105 -106 células/mL). O método descrito fornece uma ferramenta experimental prática e eficiente para sistemas de nível estudos sobre a dinâmica de crescimento.
A principal vantagem deste protocolo é que toma medidas repetidas de um estoque comum de glicerol. Ter várias culturas de células em várias taxas de diluição na fase inicial de crescimento exponencial é altamente útil porque permite que os pesquisadores determinar o tempo de cultura em qualquer escala de tempo e evita ter saturado culturas devido a acontecimentos imprevisíveis. Repetiu o cultivo e as medições das populações comum, que foram preparadas a partir de uma das cinco culturas iniciadas usando taxas de diluição diferente, conforme descrito no protocolo seção 2.2 (Figura 2A), apresentado resultados altamente semelhantes do crescimento análise dinâmica. Várias curvas de crescimento de medições repetidas e independentes (N = 6) sobrepostas bem (Figura 2Bpainel superior), com pouca variação (Figura 2Bpainel de fundo), particularmente durante a fase exponencial ( Figura 2B, área sombreada). Estes resultados sugerem que o método descrito oferece resultados altamente reprodutíveis.
Estimar o viés global das leituras de 96 poços é altamente recomendado. No presente método, a tendência global é estimada pelo monitoramento do crescimento do selvagem-tipo e. coli estirpe W3110 conforme descrito no protocolo, seção 5. Por exemplo, as taxas de crescimento calculado a partir das curvas de crescimento mostrou variação significativa entre os 96 poços (Figura 3A), que representa a flutuação global derivada tanto a manipulação de dados e os erros de dispositivo. Esses erros podem ser mascarados por carregar a mesma amostra em vários poços em locais variados na placa. Por outro lado, o OD máximo600 revelou um viés claramente dependente de localização para os resultados, como observaram-se mudanças graduais ao longo da direção vertical, ou seja, o OD máximo600 aumentado gradualmente dos poços da coluna 2 para aqueles de coluna 11 na placa de 96 poços (Figura 3B). Para evitar resultados tendenciosos, recomenda-se a mesma amostra para ser carregado em poços localizados em ambos os lados da placa de 96 poços para medidas repetidas. O preconceito locacionais no máximas valores de600 OD presume-se decorrente da variação nas taxas de evaporação, que são determinados por aquecimento e selagem eficiências. Em comparação com os poços no meio da microplaca de 96 poços, dos poços localizados nas bordas tendiam a mostrar valores relativamente maiores, refletindo as taxas de evaporação variadas resultantes do efeito da selagem do microplate. Além disso, desde que outros microplacas de 96 poços, submetidas ao mesmo ensaio viés mostraram mudanças direcionais semelhantes baseadas em onde o poço foi localizado na placa, na medida do bias pode depender o leitor. Assim, é importante avaliar o viés global das leituras de 96 poços em estudos que determinam a densidade populacional máxima. Leitores de placa disponível comercialmente, que todos têm sua tendência global específica causada por aquecimento e agitação eficiências e as microplacas de 96 poços em grande parte são diferenciados pela eficiência de vedação.
Esse método destina-se a análise sistemática de crescimento bacteriano, e pode ser usada para analisar dois parâmetros principais, ou seja, densidade de crescimento taxa e células, que são comumente aplicados em uma ampla variedade de campos, tais como a biologia de sistemas, evolução, e Ecologia16,17. O cálculo manual, usando a planilha é apresentado para mostrar o processamento do cru diz para produzir os parâmetros avaliados do crescimento taxa e célula de densidade. As taxas de crescimento a cada hora calculam-se primeiro do lê cru da curva de crescimento (Figura 4A), de acordo com o protocolo seção 4.6 como um conjunto de dados de alterações sequenciais nas taxas de crescimento (Figura 4B). Os meios e os desvios-padrão de todas as taxas de crescimento consecutivo cinco são adquiridos sequencialmente (Figura 4-D), e a maior taxa de crescimento média com o menor desvio padrão é definida como a taxa de crescimento máxima do crescimento curva (Figura 4-D, destacada). A densidade celular máxima (OD600) é analisada da mesma forma (Figura 4E-F). A densidade de taxa e células de crescimento calculado posteriormente são submetidos a uma análise mais aprofundada. Observe que os cálculos descritos podem ser executados automaticamente usando plataformas computacionais (linguagens de programação), por exemplo, R e Python.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig1.jpg"> 
Curvas de crescimento Figura 1 adquiridas com diversos métodos. (A) várias aquisições de curvas de crescimento. Curvas de crescimento de quatro diferentes estirpes de Escherichia coli expressando vários genomas foram obtidas de uma forma de alta produtividade. As células de e. coli foram cultivadas em M63 médio mínimo, e as mudanças no OD600 leituras foram registradas por um leitor de microplacas com intervalos de 1-h. As cepas da esquerda para a direita estão o selvagem-tipo e. coli W3110 (número 0) e seus genomas reduzidas números 1, 10 e 18 (descrito anteriormente5), respectivamente. (B) curva de crescimento obtida usando o ensaio de UFC. O selvagem-tipo células de Escherichia coli (número 0) foram cultivadas e foram amostradas nos pontos de tempo indicado por várias horas. As alterações de crescimento foram estimadas usando o ensaio de UFC. Abrir círculos indicam a gravação ou pontos de amostragem. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig2.jpg"> 
Figura 2. Reprodutíveis repetidas medições. (A) culturas durante a noite da taxa de diluição variados. as células de e. coli foram inoculadas em tubos em várias taxas de diluição, que variaram de 1-para 10,000-fold, conforme indicado. As células foram cultivadas a 37 ° C com agitação a 200 rpm por aproximadamente 12 h. Os valores de600 OD finais das culturas de cinco célula (da esquerda para a direita) foram 1,51, 0,74, 0.05, 0,008 e 0,001, respectivamente. A cultura com OD600 de 0,05 foi utilizada para o estoque comum de glicerol. (B) medições altamente reprodutíveis. Seis curvas de crescimento independente (linhas de topo, cinza) da mesma estirpe Escherichia coli foram adquiridas e calculadas a partir de seis posições na microplate e dois frascos do estoque comum de glicerol. A linha preta representa a média das curvas de crescimento de seis. Os coeficientes de variação (CV) das seis medições repetidas foram calculado (inferior), e os pontos de baixos constantes são sombreados em rosa. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig3.jpg"> 
Figura 3 viés Global do formato de 96 poços. Mapa de calor (A) das taxas de crescimento. O estoque de células de Escherichia coli foi suspenso no mínimo médio M63 e carregado igualmente em 96 poços do microplate (representado como uma tabela de 12 × 8). As mudanças no OD600 foram obtidas usando o leitor de microplacas, conforme descrito na seção 5 do protocolo. A gradação do branco ao vermelho indica as taxas de crescimento de 0,7 a 0,9 h-1. (B) mapa de calor do OD máximo600. A gradação do branco ao vermelho indica os valores de600 OD máximas de 0,9 a 1,2. Os cálculos da taxa de crescimento e de máxima OD600 são conforme descrito na Figura 4. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56197/56197fig4.jpg"> 
Figura 4 análise das curvas de crescimento. (A) dados brutos de curvas de crescimento. As cada hora OD600 leituras são plotadas contra o tempo de cultura. Abrir círculos indicam os tempos de amostragem. Temporal (B) mudanças nas taxas de crescimento. Taxas de crescimento de hora em hora entre duas leituras consecutivas de600 de OD são calculadas de acordo com a equação descrita em 4.6. (C) significa taxas de crescimento. A média das taxas de crescimento consecutivo cinco são calculadas para dar taxas de crescimento suave. (D) os desvios-padrão das taxas de crescimento médio. É calculado o desvio padrão das taxas de crescimento consecutivo cinco mesmo. A taxa de crescimento máxima com o menor desvio-padrão é destacada em vermelho. (E) quer dizer OD600. A média dos cinco valores consecutivos de600 OD é calculada para determinar a suave OD600. (F) desvios-padrão dos valores de600 de OD médios. Desvio-padrão dos mesmos cinco consecutivos OD600 valores é calculado. O OD máximo600 com o menor desvio-padrão é destacada em vermelho. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56197/56197fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Preciso, elevado-throughput análise do crescimento bacteriano

Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

precise-high-throughput-analysis-of-bacterial-growth

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K visualizações.  University of Tsukuba. Avaliação quantitativa do crescimento bacteriano é essencial para a fisiologia microbiana como um fenômeno de sistemas-nível de compreensão. Um protocolo para uma abordagem analítica e manipulação experimental são introduzidos, permitindo a análise precisa, elevado-throughput de crescimento bacteriano, que é um tema chave de interesse em biologia de sistemas.

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High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Biologia

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperação de Zebrafish Adulto Corações para aplicações de alto rendimento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...