We sincerely thank Thomas Howe and J&#246;rg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.

<ol>
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Polysaccharids Detektion mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren: Verschiedene Monosaccharide zeigen unterschiedliche Absorptionsmaxima und molare Extinktionskoeffizienten durch Anwendung dieser Methode 9. Daraus ergeben sich unterschiedliche Absorptionsmaxima von Polymeren, die in unterschiedlichen Mengen mehrerer Zucker enthalten. Die verschiedenen Wellenlängen der Absorptionsmaxima für 16 verschiedene handelsübliche Polymere sind in Tabelle 5 angegeben. Die Polymere gelöst (1 g / L) in ddH 2 O, gerührt (150 rpm) über Nacht und mit dem Phenol-Schwefelsäureverfahren gemessen . Diutan Gummi zeigte die niedrigsten Absorptionsmaxima bei 470 nm und Scleroglucan und Hyaluronsäure höchsten bei 484 nm. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde 480 nm für diese Screening-Plattform entschieden. Die relative Absorption der Polymere wurde auf der Basis der Absorption mit 1 g / l Glucose (eingestellt als 100%) erhalten wurde, berechnet. Die niedrigsten Ergebnisse wurden mit Scleroglucan und Succinoglycans erhalten, beide mit 92%. Dies war expektiert weil Scleroglucan nur Glucose enthält und Succinoglycan enthält Glucose und Galactose in einem Verhältnis von 7: 1. Beide kommerziellen Polymere unterschiedliche Verluste der Trocknung und unterschiedliche Aschegehalte haben, ist dies der Grund, warum der theoretische Wert von ~ 110% wurde nicht erreicht. Xylan zeigte die höchste relative Absorption bei 311%. Der Grund dafür liegt in der hohen molaren Extinktionskoeffizienten von Xylose erreicht aufgrund der dominanten Furanose Form. In einer Menge von 0,1 g / l Glucose wurde die Bestimmungsgrenze erreicht hat, sowie die Nachweisgrenze in einer Konzentration &lt;0,05 g / L. Jedoch ist die Nachweisgrenze für positive Spannungen in dem Screening von mehr als 0,7 g / L, und daher der Assay zeigte eine gute Leistung. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten, die verbleibende Glucose nach Gelfiltration wurde mit einem Glucose-Assay bestimmt und dieser Wert wurde aus dem Wert aus der Phenol-Schwefelsäure-Verfahren abgezogen. Automatisierte Glucose-Assay Verdünnung: Die Leistungder Glucosebestimmung nach der Kultivierung (Verdünnung 1: 100) untersucht. Hierzu wurden 10 ul Überstand wurden auf 990 &amp; mgr; l ddH 2 O in einem tiefen Well - Platte überführt und über zehnmal gemischt Ansaugen und Abgeben von 180 &amp; mgr; l aus dieser Verdünnung. Der zweite entscheidende Schritt war die richtige Pipettieren von nur 5 ul Aliquot für die Verdünnung von 1:10 aus der Glucose-Test nach Gel-Filtration. Um die Verdünnung 25 ul ddH 2 O übertragen wurden mit einer 50 &amp; mgr; l-Spitze zu erzeugen , wurden zusammen abgesaugt zuerst, danach 20 ul ddH 2 O und 5 ul Gel-Filtrat. Dies gewährleistet eine bessere Entfernung der 5 ul-Aliquot aus der Spitze. Beide Verdünnungsschritte wurden mit verschiedenen Glukosestandards über einen Glucose-Assay überprüft. Die Ergebnisse für zwei beispielhafte Konzentrationen sind in Tabelle 6 gegeben , um die . 1: 100 - Verdünnung für die Bestimmung der Glucosegehalt nach der Kultivierung hoher Präzision für beide Standards mit einem CV &amp; # zeigten60; 1,2%. Zur gleichen Zeit wird die Genauigkeit für die höheren Standard betrug bis zu 11,6 (% Fehler). Dies ist jedoch vernachlässigbar, da die Glukose-Bestimmung nur die verbleibenden Glucosegehalt nach der Kultivierung darstellt, und daher ist nicht wichtig für die Polymerdetektion. Die Verdünnung von 1:10 für die restliche Glucose nach Gel-Filtration zeigte eine sehr zuverlässige Ergebnisse mit einem CV &lt;1,4% und einer Genauigkeit &lt;2,1% Fehler. Berücksichtigung der Verdampfung: Das Screening erfordert 3,5 Stunden aus dem ersten Schritt zu dem ersten glucose-Assays. Um zu erfahren, ob dieser Zeitrahmen einen Einfluss auf die nicht begrenzten MTP Lagerung hat, 50 ul Glucose-Test Kalibrierungsstandards wurden für 3,5 Stunden in der Roboter-Karussell mit und ohne Deckel gespeichert. Im Kalibrierungsbereich (45 bis 4,5 mg / l) die Probenkonzentration kaum erhöht. Eine Erhöhung - verursacht durch Verdunstung - lag unter 2,1% und nur für die beiden niedrigsten Konzentrationen (1,8 und 0,9 mg / l) erreichte bis zu 12,4% ( <strOng&gt; Tabelle 7). Gel-Filtration: Hohe Mengen an nicht-metabolisierten Glucose stören die quantitative Bestimmung von Glukose aus dem hydrolysierten Polymer. Daher wurde eine Gel-Filtrationsschritt erforderlich, um die verbleibende Glucose nach der Kultivierung zu entfernen. Zudem reinigt die Gelfiltration des Polymers aus Salzen und monomeren Kohlenhydratverbindungen, andere als Glucose enthaltenden Überstand, die analytische Hintergrund in der Monomer-Analyse zu minimieren. Bei dem Gel-Filtrationsschritt 35 &amp; mgr; l des Filtrats wurden in der Mitte des Bohrloches angeordnet. Zur Validierung der Robustheit der Gel-Filtration in dem automatisierten System acht Kalibrierstandards von 0,045 bis zu 9 g / l Glucose wurden filtriert (n = 8). Die Glucose jeder Konzentration wurde stets um mehr als 95% des Ausgangswertes (Tabelle 8) reduziert. so zeigte das Gel-Filtration sehr gute Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von Glucose zu tun. Zusätzlich kann die verbleibende Glucose nach Gel-ffast filtration wurde auch mit einem Glukoseassay und subtrahiert von dem Phenol-Schwefelsäure-Bestimmung zu empfangen, die richtige Menge an Glucose-Äquivalent für das hydrolysierte Polymer bestimmt. Pyruvat-assay: Erstens, wurde untersucht, ob die neutralisiert und verdünnt (1:10) TFA-Matrix aus dem Hydrolyseschritt mit der enzymatischen Reaktion stört. Daher wurde die vollständige Test zweimal durchgeführt, einmal mit und einmal ohne Matrix und zeigte zuverlässige Ergebnisse. Schließlich wurde die Pyruvat - Gehalt von 16 im Handel erhältlichen Polymeren erfolgreich gemessen und ist in Figur 3 dargestellt ist . Es ist allgemein bekannt , dass nur aus diesen Polymeren 16 Succinoglycan und Xanthan natürlich Pyruvat enthalten. Mit unserem Pyruvat-Assay beide dieser Polymere wurden korrekt identifiziert. In Scleroglucan, Welangummi und Xylan Pyruvat wurde auch in signifikanten Mengen nachgewiesen. Insgesamt wurde die Fähigkeit des Ansatzes validiert und das Pyruvat-Assay showed eine hohe Leistung. Es erwies sich als in der Lage sein Pyruvat in verschiedenen Polymeren nach der Hydrolyse zu detektieren. Carbohydrate Fingerabdruck: Nach Durchführung aller analytischen Module im automatisierten Screening, potenzielle EPS Produzenten wurden für den Kohlenhydratfingerabdruckanalyse ausgewählt. Hierzu wurden mehrere Kriterien gelten: 1) Positive Beobachtung der Viskositäts nach Zentrifugation und / oder nach der Filtration. 2) Niederschlag vor und nach der Filtration. Beobachtete Fasern und Flocken wurden als positiv bewertet. 3) Glucose-Äquivalentwert aus dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren. Werte&gt; 700 mg / l wurden als positiv und Werte zwischen 300 und 700 mg / l wurden als mutmaßliche EPS Produzenten bewertet bewertet. Wenn zwei oder drei Kriterien als positiv bewertet wurden, wurden die Stämme zur weiteren Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse ausgewählt. Die Kriterien können an den individuellen Zweck der EPS - Screening (zB niedrige Viskosität EPS) angepasst werden. Unser Ansatz bei der Suche nach effici Zielent EPS Produzenten. Wenn für die Stämme zu suchen, die nur geringe Mengen an EPS die Bewertungsgrenze des Glucoseäquivalent produzieren sollte reduziert werden. Technische Nutzen und zukünftige Anwendungen: Ein interessantes Merkmal dieses Protokolls ist der modulare Charakter der Schritte und die verschiedenen Analysemodulen. Sie können auf verschiedene Weise kombiniert werden, angepasst auf die individuellen Anforderungen und neue Module leicht implementiert werden kann. Darüber hinaus können die Analysemodule separat verwendet werden, beispielsweise die Hydrolyse - Modul in Verbindung mit dem HT-PMP-Derivatisierung Modul kann eine monomere Zusammensetzungsanalyse von verschiedenen Polymerlösungen (1 g / l) in 96-Well - Format durchzuführen. Für Laboratorien, ohne die vollständige Abschirmung manuell Zugriff auf ein Flüssigkeitshandhabungssystem, ohne Änderungen in dem Pipettierschema gehandhabt werden kann. Jedoch ein Flüssigkeitshandhabungssystem erhöht den Durchsatz bis zu 768 Stämmen (anstelle von 192 Stämmen wenn Screened manuell) pro Tag. Das Protokoll , das hier beschrieben wird , ist in der Lage ein Screening für verschiedene Gattungen und daher für das Screening von großen Stammsammlungen neuartige EPS Hersteller zu identifizieren und deren Kohlenhydrat - Fingerabdrucks analysiert in einem Ansatz (Abbildung 4). Weiterhin ist ein gezieltes Screening für Polysaccharide mit seltenen Zucker wie Fucose, können Uronsäuren oder sogar unbekannte Zucker über die detaillierte Monosaccharid-Analyse durchgeführt werden. Außerdem können verschiedene Zuckerkombinationen in definierten Verhältnissen nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die einfache Identifizierung von strukturell verwandten Varianten bereits bekannter EPS oder neuartige EPS.

Mikrobielle Exopolysaccharide (EPS) sind eine strukturell sehr heterogene Gruppe von Polymeren, die verschiedene biologische Funktionen erfüllen. Sie sind meist aus komplexen Wiederholungseinheiten aufgebaut, die von verschiedenen Arten von Monomeren (Zucker, Zuckerderivate, Zuckersäuren) auszeichnen, die Bindungen zwischen den Monomeren und deren Substitutionen. Die strukturelle Vielfalt von mikrobiellen Polysacchariden verleiht eher unterschiedlichen Eigenschaften an die Mitglieder dieses Moleküls Klasse, die in verschiedenen Bereichen wie Lebensmittel 1, Kosmetika 2,3 ihre Anwendung ermöglicht es , bauchemische 4 oder Wasseraufbereitung 5. Zur Erweiterung auf dem Gebiet der Anwendung dieser biobasierten und so eine nachhaltige Polymere die Identifizierung von neuen natürlichen mikrobiellen Polysacchariden sowie das Engineering von Strukturvarianten vielversprechende Ansätze darstellt. So oder so, ein schnelles Screening-Verfahren ist erforderlich, schnell eine große Anzahl von Mikrobenstämme für thei scannenr Polysaccharid-Bildung und ihre Produkte zu analysieren. Daher haben wir kürzlich eine 96-Well - HT-Screening - Plattform für die Analyse von mikrobiellen Polysaccharid - Produktion aus natürlichen Isolaten oder künstlich Stammvarianten entwickelt, die die Identifizierung der monomeren Zusammensetzung umfasst 6. Die Anwendung dieser Plattform für einen ersten Screeningrunde von ~ 500 natürlichen Isolaten konnten wir nur etwa 10 bis 20% der isolierten Stämme zu identifizieren, in der Lage, EPS zu produzieren (Daten nicht gezeigt). Dies bedeutet, dass 80-90% der analysierten Stämme produzieren nicht EPS unter den Bedingungen angewendet wird, und daher wird eine weitere Analyse des Fingerabdrucks detaillierten Kohlenhydrat war nicht erforderlich. Da diese hochentwickelte Identifizierung der monomeren Zusammensetzung ist ein zeitaufwendiges Verfahren, insbesondere für die Datenanalyse, eine schnelle Vor-Screening-Verfahren mit den Stämmen positiv in EPS Produktion zu identifizieren, würde die Effizienz drastisch erhöhen. Weiterhin Reagenzien,Verbrauchsmaterialien und Messzeit an der UHPLC-UV-ESI-MS würde reduziert werden. Darüber hinaus werden die verschiedenen Analysemodule, während einerseits die Methode sehr zuverlässig machen, sind auf der anderen Seite die manuelle Handhabung von mehr als zwei 96-Well-Platten parallel zu komplizieren, und als solche, das volle Potenzial des Verfahrens beschränken. Aus diesen Gründen haben wir uns entschlossen, ein automatisiertes Screening-Plattform zu entwickeln. Daher kombinierten wir die modularen Format des vorhandenen Kohlenhydratfingerabdrucktechnik mit einem vollautomatischen Schnellnachweisverfahren der Gesamtzuckergehalt, bezogen auf die Absorptionsmessung. Das Phenol-Schwefelsäure-Methode stellt immer noch das Mittel der Wahl für die schnelle Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalt von bakteriellen und pflanzlichen Polysacchariden 7,8. Diese Methode wurde erstmals von Dubois et al. 9 und für verschiedene Anwendungen und Probengrößen angepasst, auch bei kleinen Maßstab in 96-Well - Platten 10,11. Die phenol-Schwefelsäureverfahren misst die Gesamtkohlenhydratgehalt um einen Wert, Summieren aller monomeren, oligomeren und polymeren Kohlehydraten der Proben. Unter diesen Aspekten Rechnung zu tragen, ist die Wahl eines geeigneten Kultivierungsmedium wichtig, diese Methode anzuwenden. Komplexen Medien oligomeres oder polymeres Kohlenhydratverbindungen wie Hefeextrakt könnte zu einer veränderten Polymergehalt führen und daher unbedingt vermieden werden sollte. Weiterhin werden als C-Quelle für die Kultivierung der Stämme hohe Mengen an Zuckern verwendet. Hohe Konzentrationen von restlichen Kohlenhydrate aus dem Kultivierungsprozess könnte negativ mit der Messung des EPS-Gehalt stören. Daher wird die Verwendung von definierten und reine Zucker empfohlen. In unseren Experimenten verwendeten wir Glukose zur Kultivierung der Zellen. Der verbleibende Glucose nach der Kultivierung wurde über eine Gelfiltration verringert und über einen Glucose-Assay bestimmt. Schließlich ist die Glucose äquivalents der Polysaccharide wurden durch Subtrahieren der verbleibenden Glucose nach der Gel-Filtration von der Gesamtkohlenhydratgehalt berechnet, die mit dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren nachgewiesen worden war. Gel-Filtration und Glucose-Assay in Kombination mit dem Phenol-Schwefelsäure-Methode zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten und imstande sind, das erste, vollständig automatisierte Erfassungssystem ist. Zwei neue Analysemodule wurden in der automatisierten Screening-Plattform enthalten, die Menge von Informationen von dem EPS-Erkennungssystem zu erhöhen: die Fällung und die Beobachtung einer Erhöhung der Viskosität. Viele verschiedene EPS - zB Succinoglycans, Xanthan und Kolon - Säure 12 - berichtet , mit einem nicht-Kohlenhydrat - Pyruvat - Ketal auf Zucker Positionen C4 und C6 modifiziert werden. Diese Pyruvat Ketale (wie Succinyl Halbester und Uronsäuren) tragen zur polyanionische Natur und daher auf die physische properties des Polymers durch über zweiwertige Kation Brücken 13 zusammenwirkt. Um diese speziellen Polymere die Bestimmung von Pyruvat zu identifizieren wurde als ein weiteres zusätzliches Analysemodul etabliert. Dadurch erhöht sich die Information über die Polysaccharid-Substituenten und ihre möglichen makroskopischen Eigenschaften. sowie eine schnelle und effiziente Bestimmung der EPS-Hersteller alle Module Kombination ermöglicht die Identifizierung verschiedener EPS. Durch diesen Ansatz kann die Screening - Plattform in zwei Hauptteile (1) aufgeteilt werden. Im Rahmen der automatisierten Screening (Teil I) tritt der Workflow vollautomatisiert (Tabelle 1) , um schnell die EPS - produzierenden Stämme vorgewählt werden . Das Kohlenhydrat Fingerabdruckanalyse (Teil II) bestimmt quantitativ die Monomerzusammensetzung der durch den vorgewählten Stämme produzierten EPS. Dadurch wurde die Datenanalyse minimiert, um das Screening von großen Stammsammlungen zu optimieren. Diesbietet die Möglichkeit, 384 Stämme in einem einzigen automatisierten Screening-Lauf und mit zwei Läufen zu analysieren, die pro Tag von 768 Stämme pro Tag möglich sind. Darüber hinaus gibt der Kohlenhydrat-Fingerprint-Analyse einen noch detaillierteren Überblick über alle identifizierten EPS. Dies ermöglicht die gezielte Analyse und Identifizierung von nur leicht unterschiedlichen EPS-Varianten oder ganz neue im Vergleich zu den bereits beschriebenen chemischen Strukturen von EPS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="887">
	<tbody>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:335px;">96 well deep well plate 2.0 mL (DWP)</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:143px;">780271</td>
			<td style="width:224px;">Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the&#160; glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990&#181;l of ddH2O</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td style="width:185px;">Axygen</td>
			<td style="width:143px;">BF-400-S</td>
			<td style="width:224px;">Incubation film for pre- and main-culture DWP</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Aluminum Sealing Film</td>
			<td style="width:185px;">Axygen</td>
			<td style="width:143px;">PCR-AS-200</td>
			<td style="width:224px;">-80 &#176;C storage film for glycerol-stock plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">MCA96 Nested Disposable Tips 200 &#181;l</td>
			<td style="width:185px;">TECAN</td>
			<td style="width:143px;">30038619</td>
			<td style="width:224px;">Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">A/B glass-filter-plate 1&#181;m</td>
			<td style="width:185px;">Pall Corporation</td>
			<td style="width:143px;">PN 8031</td>
			<td style="width:224px;">Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well micro titer plate V-Bottom</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:143px;">651201</td>
			<td style="width:224px;">Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well SpinColumn G-25</td>
			<td style="width:185px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:143px;">74-5612</td>
			<td style="width:224px;">Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well micro titer plate V-Bottom</td>
			<td style="width:185px;">Nunc</td>
			<td style="width:143px;">249944</td>
			<td style="width:224px;">Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Nested Disposable Tips SBS 50 &#181;l tips</td>
			<td style="width:185px;">TECAN</td>
			<td style="width:143px;">30038609</td>
			<td style="width:224px;">Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:335px;">Trough 250 ml</td>
			<td style="width:185px;">Axygen</td>
			<td style="width:143px;">Res-SW96-HP</td>
			<td style="width:224px;">Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7)</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:335px;">96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)</td>
			<td style="width:185px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:143px;">655101</td>
			<td style="width:224px;">precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">96-well silicon cap mat&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Whatmann</td>
			<td style="width:143px;">7704-0105</td>
			<td style="width:224px;">Cover mat for MTP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">200 &#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">70.760.002</td>
			<td style="width:224px;">For manually handling</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">1000 &#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:185px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:143px;">70.762</td>
			<td style="width:224px;">For manually handling</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">96-well-PCR micro titer plate&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Brand</td>
			<td style="width:143px;">781350</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatisation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">TPE (thermoplastic elastomer) cap mat&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Brand</td>
			<td style="width:143px;">781405</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatisation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:335px;">Filter plate 0.2&#160;&#181;m Supor,&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Pall Corporation</td>
			<td style="width:143px;">PN 8019</td>
			<td style="width:224px;">Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Pipette Tips LHS 5-300 &#181;l</td>
			<td style="width:185px;">Brand</td>
			<td style="width:143px;">732150</td>
			<td style="width:224px;">Brand LHS system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">ABTS (2.2-azino&#8209;bis-(3&#8209;ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic&#160;acid)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A1888</td>
			<td style="width:224px;">Glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Glucose oxidase&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">G2133</td>
			<td style="width:224px;">Glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Horseradish peroxidase&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P6782</td>
			<td style="width:224px;">Glucose-assay, pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:335px;">DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4&#39;-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)</td>
			<td style="width:185px;">Wako Chemicals GmbH</td>
			<td style="width:143px;">043-22351</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Pyruvate oxidase&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">P4591</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">P749.3</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat- and glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">3904.3</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat- and glucose-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Thiamine pyrophosphate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">C8754</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">31413</td>
			<td style="width:224px;">Pyruvat-assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">2-Propanol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20922.466</td>
			<td style="width:224px;">Precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Phenol</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20599.231</td>
			<td style="width:224px;">Phenol-sulfuric-acid method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Sulfuric acid</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">4623.4</td>
			<td style="width:224px;">Phenol-sulfuric-acid method</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">T6508</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Ammonium solution</td>
			<td style="width:185px;">Carl-Roth</td>
			<td style="width:143px;">P093.1</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Ethanol absolut</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20821.321</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:335px;">Phenol red&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:143px;">B21710</td>
			<td style="width:224px;">Hydrolysis, PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M70800</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Methanol LC-MS</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">83638.320</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Acetonitril LC-MS</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">83040.320</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">338826</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Ethanol absolut</td>
			<td style="width:185px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">20821.321</td>
			<td style="width:224px;">PMP-derivatization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:335px;">Methyl red&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:143px;">36667</td>
			<td style="width:224px;">pH-value</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robotic liquid handling system&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Freedom EVO</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid handling station LHS</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709400</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tip-Adapter&#160;</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709434</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Ends MC 20-300&#181;L</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709416</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adapter 60mm</td>
			<td>Brand</td>
			<td>709430</td>
			<td style="width:224px;">Worktable setup in Figure 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated modular high throughput exopolysaccharide screening platform coupled with highly sensitive carbohydrate fingerprint analysis

Viele Mikroorganismen sind in der Lage zu erzeugen und zu sekretieren Exopolysaccharide (EPS), die wichtige Auswirkungen in medizinischen Bereichen, Lebensmittelanwendungen oder in den Ersatz von petro basierten Chemikalien haben. Wir beschreiben ein analytisches Plattform auf einem Flüssigkeitshandhabungssystem automatisiert werden, die eine schnelle und zuverlässige Analyse des Typs und der Menge an EPS von Mikroorganismen hergestellt werden können. Es ermöglicht dem Benutzer, neue natürliche mikrobielle Exopolysaccharid Hersteller zu identifizieren und die Kohlenhydrat Fingerabdrucks der entsprechenden Polymere innerhalb eines Tages in Hochdurchsatz (HT) zu analysieren. Mit Hilfe dieser Plattform, Stammsammlungen sowie Bibliotheken von Stammvarianten, die in technischen Ansätzen gewonnen werden könnten kann gescreent werden. Die Plattform hat einen modularen Aufbau, der eine Trennung des Protokolls in zwei Hauptteile ermöglicht. Erstens gibt es ein automatisiertes Screening-System, das verschiedene Polysaccharid Detektionsmodule kombiniert: a semi-quantitative Analyse von viscosity Bildung über einen Zentrifugationsschritt, einer Analyse der Polymerbildung durch Alkoholfällung und die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehalts über eine Phenol-Schwefelsäure-Transformation. Hier ist es möglich, bis zu 384 Stämme pro Lauf zu screenen. Der zweite Teil enthält eine detaillierte Monosaccharid-Analyse für alle ausgewählten EPS Produzenten im ersten Teil die von zwei wesentlichen Module kombinieren: die Analyse der gesamten Monomerzusammensetzung über ultra Hochleistungs-Flüssigchromatographie gekoppelt mit UV-und Elektrospray-Ionisations-Ionenfalle Erkennung ( UHPLC-UV-ESI-MS) und die Bestimmung von Pyruvat als Polymer Substituent (Vorhandensein von Pyruvat-Ketal) durch enzymatische Oxidation, die zu einer Farbbildung gekoppelt ist. Alle analytischen Module dieser Screening-Plattform kann auf unterschiedliche Weise und angepasst auf die individuellen Anforderungen kombiniert werden. Zusätzlich können sie alle mit einer Flüssigkeitshandhabungssystem oder manuell durchgeführt gehandhabt werden. Dadurch wird das Screening plaTForm ermöglicht eine enorme Flexibilität, um verschiedene EPS zu identifizieren.

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Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

automated-modular-high-throughput-exopolysaccharide-screening

Nanyang Technological University

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Molecular Biology

Biology

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

11.4K Aufrufe.  Technische Universität München. We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Serie: Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...