Wir danken Dr. Vladana Vukojević, Zentrum für Molekulare Medizin, Karolinska Institutet für die Aufrechterhaltung des Zeiss Confocor 3 Instrument und hilfreiche Tipps in Bezug auf Zellmessungen. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Vetenskapsrådet (Grant-Nummer 2012- 1629) finanziert werden, Magnus Bergvalls Stiftelse und von Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

<ol>
	<li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes:+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model.">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li><li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells.">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein/lipid+interactions.">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li><li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+vivo.">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li><li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+act:+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells.">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).</li><li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+correlation+spectroscopy:+principles+and+applications.">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li><li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImFCS:+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization.">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li><li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-techniques:+advances+in+receptor+protein+studies.">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+principles+and+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li><li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+novel+variations+of+an+established+technique.">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li><li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities.">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li><li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells.">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li><li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy.">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li><li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li><li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li><li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes.">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li><li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+of+Triplet-States+in+Solution+-+a+Theoretical+and+Experimental-Study.">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li><li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li><li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II:+application+to+simulated+and+in+vitro+data.">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li><li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li><li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+(mICS).">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435 (2016).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll für FCS kann für die Bewertung der molekularen Dynamik von Oberflächenmolekülen auf allen Arten von Immunzellen (murine, menschliche oder andere Arten) verwendet werden. FCS Maßnahmen räumlich-zeitliche Molekulardynamik bis auf Einzelmolekülauflösung in lebenden Zellen. Die molekulare Dichte sowie die Diffusionsgeschwindigkeit und clustering Dynamik der Proteine ​​von Interesse, aus den Autokorrelationskurven extrahiert werden. Die Fluoreszenzmarkierung ist von zentraler Bedeutung für eine erfolgreiche FCS-Experimente. Proteine ​​von Interesse auf der Zellmembran wurden traditionell unter Verwendung von Antikörpern markiert und Antikörper sind häufig am bequemsten für den Einsatz an Oberflächenproteine ​​in naiven Immunzellen. Unbeschriftet Antikörper müssen direkt mit einem hohen Molekular Helligkeit photostabile Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert werden. Die Auswahl des Fluorophors für Antikörperkonjugation ist für die Qualität der Messungen wichtig. Standard-Etiketten für die Durchflusszytometrie,wie Fluorescein und Phycoerythrin-Farbstoffe sind nicht auf schnelle Bleiche empfohlen. Foto stabile Farbstoffe für die direkte Konjugation an Antikörper werden derzeit von mehreren Unternehmen zur Verfügung gestellt. Die Hersteller bieten gewöhnlich zufriedenstellende Protokolle für die Konjugation und Reinigung des resultierenden konjugierten Antikörper, und dies kann in einigen Stunden durchgeführt werden. Es ist auch möglich FCS unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen durchzuführen, aber besondere Sorgfalt sollte die Laserleistung, da fluoreszierende Proteine ​​sind im Allgemeinen anfälliger für Bleich- als die meisten photo stabile chemische Fluorophore zu minimieren. Nach den bisherigen Erfahrungen, Überexpression von Proteinen führt oft zu einer erheblichen Abnahme der Rate Diffusion aufgrund crowding, die die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen ungeeignet macht. Pinhole-Kalibrierung vor der Messung ist auch ein entscheidender Schritt. Die Fluorophore zur Bestimmung der Größe des Brennvolumens verwendet wird, muss Diffusionskoeffizienten bekannt sinds (siehe Gleichung 2). freie Fluorophore verwenden eng an die Emissionsspektren der Antikörper markiert entspricht, um die Größe des Brennvolumens zu bestimmen. Dies muss geschehen, um die optimale Signaleffizienz und korrekte Erkennung potentieller Kreuzkorrelationen zwischen den Farbkanälen zu gewährleisten. Führen Sie eine FCS Laserleistung Serie der frei diffundierenden Fluorophore, um sicherzustellen, dass das System das erwartete Ausgangssignal über einen Bereich von Zuständigkeiten gibt. Vergleichen Sie die CPM bei der gleichen Laserleistung zwischen den Experimenten Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten. In der Analyseschritt ist es wichtig, angemessene Bereiche und Startwerte für die Variablen zu setzen, wenn die Modelle passen. Verwenden Sie bisher veröffentlichten Erkenntnisse aus ähnlichen Zellsystemen gute Ansatzpunkte zu finden. Theoretisch ist FCS eine quantitative Technik, aber da optimalen Bedingungen selten auftreten, muss ein gewisses Maß an Vorsicht geboten, wenn der Interpretation der Ergebnisse. Alle Arten von Schwankungen werden aufgezeichnet,unabhängig von der Herkunft derartiger Schwankungen. Daher ist es sinnvoll, so viele Informationen wie möglich über das Versuchssystem zu haben, um auf mögliche Fehlerquellen auszuschließen. Zum Beispiel wird die Bewegung der gesamten Zellmembran wird führen zu Schwankungen bei längeren Taud (3A), wohingegen putative Verunreinigungen der freien Fluorophore in der Lösung mit mindestens zehnmal kürzer Taud diffundieren. Dieses Basisprotokoll kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Wenn zwei Proteine ​​mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, Co-Diffusion (ein indirektes Maß der Wechselwirkung) kann durch Erweiterung der Methode zum Nachweis der Kreuzkorrelation bewertet werden. Das Ausmaß, in dem diese Proteine ​​miteinander in der Zellmembran binden, wird durch die Höhe der Kreuzkorrelationskurve relativ zu der Höhe der Autokorrelationskurven der einzelnen Farbkanäle dargestellt. Kreuzkorrelation bezeichnet als Ch1-Ch2 in der Messsoftware. die preübungs Analyse der Kreuzkorrelation erfordert Kontrollen für Übersprechen und ist somit etwas komplizierter als das Protokoll hier vorgestellt. Eine ausführliche Beschreibung, wie die , als eine Erweiterung dieses Grundprotokoll ablaufen können in Strömqvist et al. 13. Zur Optimierung kann die Positionierung in der z-Richtung, z-Abtastung FCS 22 verwendet werden. Nach den bisherigen Erfahrungen ist es zufriedenstellend gewesen, dies manuell zu tun. Es ist auch möglich , mehrere Diffusionskoeffizienten zu einer FCS Autokorrelationskurve 23 zu passen. Dies erfordert vorherige Kenntnis der Anzahl von Subpopulationen mit unterschiedlichen Diffusionsraten und der ungefähren Diffusionsraten von mindestens einer der Subpopulationen. Ansonsten wird es zu viele freie Variablen, die die passende unzuverlässig machen wird. Ein typisches Beispiel wäre ein Oberflächenprotein, dessen Diffusionsgeschwindigkeit sein wird erheblich durch die Bindung eines Liganden verlangsamt. Schließlich Reining die Spur von Ausreißern , ohne vollständig zu entfernen Wiederholungen möglich ist 24. Das Fehlen eines Fluoreszenzsignals ist ein häufiges Problem zu beheben. Für frei Fluorophore diffundieren, verwenden Sie die Halogenlampe zu prüfen, ob der Tropfen fluoresziert. Wenn der Tropfen nicht fluoreszierend ist, mit einer leicht erhöhten Konzentration (im nM-Bereich) und versuchen Sie es erneut eine neue Charge von Fluorophore mischen. Überprüfen Sie, ob der Fokus innerhalb des Fluoreszenzabfall werden die Laser in der Software eingeschaltet ist, wird die Laserleistung ausreichend ist, die richtigen Emissionsfiltern und Detektoren sind so gewählt, und die richtigen Kanäle in der &quot;FCS-Messung&quot; Fenster werden aktiviert (siehe Schritt 3.6). Starten Sie den Laser und sucht von der Seite, um visuell zu bestätigen, dass das Laserlicht die Probe erreicht. Vermeiden Sie direkt in die Laserquelle suchen. Wenn die gewählte Emissionsfilter der Laserwellenlänge umfasst, blockieren eine Blende automatisch den Lichtweg Beschädigung des Detektors zu vermeiden. ichf alle Einstellungen sind in Ordnung, aber kein Licht kommt, Re-Start die Laser, die FCS-System und den Computer. Fragen Sie einen Experten, wenn das Fehlen eines Fluoreszenzsignals weiterhin besteht. Ein vereinfachtes Verfahren gilt, wenn die markierten Zellen nicht Fluoreszenz zeigen. Bestätigen Sie die Anwesenheit von Fluoreszenz mit der Halogenlampe; Schalten Sie den Laser, wählen Sie die Laserkanäle, und stellen Sie die Laserleistung. Wählen Sie eine Position auf der Zellmembran, entweder mit dem &quot;Fadenkreuz&quot; oder &quot;In Position&quot; Option (siehe Schritt 6.4). Wechseln Sie auf die nächste Probe, wenn das Signal immer noch zu niedrig ist. Ein wichtiger Aspekt der Schwankung aufgrund der Technik ist, dass Moleküle maßen mobil sein detektieren. Sehr langsam in Bereichen kleiner ist als der Fokus während der gesamten Messzeit kann daher nicht gemessen werden gefangen Fraktionen von Molekülen oder Moleküle bewegen. Dies führt zu einer möglichen Unterschätzung der Oberflächendichten und einer Überschätzung der Diffusionsgeschwindigkeit. Bleichenkann auch auf eine putative Unterschätzung der Dichte und Taud sowohl beitragen, da Moleküle eine höhere Wahrscheinlichkeit hat, gebleicht die längere Zeit werden sie in den Laser-beleuchteten Fokalvolumen verbringen. Einfluss von dem Hintergrund (Fluoreszenz von außerhalb der Brennebene) würde, andererseits erhöht künstlich die Anzahl der erkannten Moleküle und verringern den gemessenen cpm. Bisher wurde der gesamte maximale Fehler in der absoluten Dichtebestimmung schätzungsweise 20 etwa 40% sein. Jedoch ist es in der Regel möglich, verschiedene biologische Proben miteinander zu vergleichen, da die Fehlerquellen sind in den meisten Fällen gleich in allen Experimenten. Eine weitere potentielle Fehlerquelle ist, dass Antikörper bivalent sind, was bedeutet, dass jeder Antikörper potenziell zu zwei Zielmoleküle binden können. Die Autoren haben dieses Phänomen nicht beobachten, aber es kann nicht garantiert werden, dass dies eine globale Funktion für andere Antikörper ist. Der mögliche Einfluss von Zweiwertigkeit mussdaher individuell für jeden Antikörper getestet werden. Die Kombination von spezifischen primären und sekundären Antikörpern markiert darf niemals induzieren künstlichen Cluster aus zwei aufeinanderfolgenden bivalent Etiketten aufgrund der hohen Risiko verwendet werden. Wenn Zellen statt mit fluoreszierendem Protein-markierte Versionen des Proteins von Interesse transfiziert worden sind, wird jedes Protein nur ein Label. Dies erfordert jedoch die Transfektion, die nicht immer erwünscht ist und auch nicht möglich sein kann (beispielsweise , wenn Immunzellen direkt isoliert aus menschlichem Blut verwendet wird ). Schließlich ist Single-Point-FCS keine Bilder aufgenommen werden. Wenn Bilder für die Veröffentlichung oder für andere Zwecke benötigt werden, müssen diese separat mit dem Abbildungsteil der Software erfasst. Immer erfassen Bilder nach der FCS-Messungen unnötig Bleichen der Zelloberfläche zu vermeiden. Anders als FCS, traditionellen konfokalen Mikroskopie-basierte, wie FRAP und Bildkorrelationsmethoden können nicht Fluoreszenzfluktuationen quantifizierenauf der Einzelmolekülebene 6. Bildkorrelationsmethoden messen die Anzahl der Moleküle indirekt und mit geringerer Auflösung, aber sie können die Variabilität der molekularen Diffusion und Clustering über den gesamten Bildbereich 25 zu beurteilen. Standard - SPT durch konfokale Mikroskopie gemessen hat eine ideale Höhe der Etikettierung, um Größenordnungen niedriger als FCS 7. Daher kann die Dichte der markierten Proteine ​​nicht durch Standard-SPT gemessen werden. Die Kombination von SPT mit anderen Mikroskopietechniken (zB stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie oder Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie) kann die Dichte und Bewegung beurteilt werden, aber es erfordert eine sehr spezielle Farbstoffe oder Proteine 11. Superauflösungstechniken, wie zum Beispiel strukturierte Beleuchtung Mikroskopie und stimulierte Emission Mikroskopie erschöpft ist, erfordern oft fixierten Proben und einer Kombination von primären und sekundären Antikörper für Labeling 26. Localization ist daher sehr präzise, ​​während die Dynamik des Systems kann nicht oft beurteilt werden. Im Vergleich zu den SPT und Superauflösungstechniken, FCS erfordert auch deutlich weniger Rechenleistung und Zeit für die Analyse und Extraktion der Ergebnisse. Die Durchflusszytometrie ist das Zugpferd der Immunologie und kann vorteilhaft mit FCS kombiniert werden. Zellsortierung kann, beispielsweise durch nachfolgende Messungen an ausgewählten Zellpopulationen gefolgt werden, wenn photostabile Farbstoffe vor der Sortierung verwendet worden war. FCS ist daher eine Methode, die allein oder in Kombination mit anderen etablierten Methoden verwendet werden können. Dieses Protokoll kann verwendet werden, ist derzeit nicht bekannt Funktionen der Immunzelldynamik und Wechselwirkungen innerhalb der Zellmembran auf Einzelmolekülebene zu identifizieren. Darüber hinaus verfügt der gesamten Bevölkerung gegenüber ausgewählten Untermengen verglichen werden. Es hat auch eine mögliche Rolle als Selektionsschritt für die Immunzelltherapie. Da die Messungen tunnicht verbrauchen die Zelle, im Gegensatz zu den meisten anderen Methoden, um die Funktionalität von Immunzellen werden kann potenziell gewonnen und kultiviert für die Untersuchung, einzelne Zellen. Somit wird nach der Analyse der FCS-Kurven können vielversprechende Zellen für zusätzliche Anwendungen extrahiert und erweitert werden, einschließlich der putativen klinischen Anwendungen.

Viele Immunzellen Funktionen basieren auf der molekularen Diffusion und Wechselwirkungen innerhalb Membranen. Biologische Membranen sind komplex und viele Faktoren, die für die Funktion von Immunzellen wichtig sein kann , um die Geschwindigkeit der Translationsdiffusion von Proteinen in Zellmembranen 1 beeinflussen kann. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die natürliche Killer (NK) Zellen, gehören , Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, weisen differentielle Diffusion von beiden untersuchten Proteine an der Zellmembran in Abhängigkeit von dem Zustand der NK - Zell - Aktivierung 2. Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine Technik, die zur Quantifizierung molekularen Diffusionsraten innerhalb biologischer Membranen fähig ist. Es zeigt die durchschnittliche Diffusionsrate von fluoreszenz Moleküle in einem festen Volumen markiert, üblicherweise im Mittelpunkt eines konfokalen Mikroskops. Es basiert auf der Messung der Schwankungen in der Fluoreszenz, die auf Molekularbewegung auftreten inein System im stationären Zustand. FCS wurde zur Untersuchung der Diffusion von fluoreszierenden Farbstoffen und Proteinen sowohl in Lösung als auch in Lipidmembranen verwendet. Andere Ausgabeparameter die Diffusionsgeschwindigkeit zu beeinflussen auch indirekt werden kann auf diese Weise (zB Konformationsänderungen von Proteinen oder Wechselwirkungen von Molekülen auf Zellmembranen) untersuchten 3, 4. FCS zeichnet sich im Vergleich zu anderen Verfahren aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, so dass die Möglichkeit zur Einzelmolekül-Detektion. Es funktioniert gut für die molekulare Konzentrationen im nanomolaren bis millimolaren Bereich, der für die endogene Expressionsniveaus der meisten Proteine 5 typisch ist. Weiterhin FCS kann eine Approximation der absolute Anzahl von Proteinen innerhalb des untersuchten Volumen geben, während die meisten anderen Techniken nur relative Informationen über die Proteinexpressionsniveaus ergeben. Andere Methoden molekularen Diffusionsraten zu messen, in Membranen Fluo umfassenzenz Erholung nach dem (FRAP), Einzelpartikelverfolgung (SPT), mehrere Pinhole FCS und Bildkorrelationsphotobleaching Methoden. FRAP und Bildkorrelationsverfahren sind ensemble Techniken, die im allgemeinen keine Informationen über die absolute Anzahl der Moleküle 10 geben. Im Vergleich zu SPT ist der Durchsatz von FCS höher in Bezug auf die Bevölkerungsdurchschnitt zu charakterisieren. Die Analyse ist auch weniger anspruchsvoll, da die durchschnittliche Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle innerhalb des Laserfokus wird gemessen, eher als die Geschwindigkeit der einzelnen Moleküle. Auch, es sei denn spezielle Mikroskope sind 11 verfügbar, SPT können keine Informationen über Konzentrationen geben, da Standard - SPT Kennzeichnung sehr gering sein muss für die Identifizierung von einzelnen Molekülen zu ermöglichen. Auf der anderen Seite erfordert FCS die Moleküle untersucht, mobil zu sein. Es wird einfach keine vermeintlichen immobile Fraktionen oder Moleküle sehr langsam bewegen erkennen. Die Diffusionsgeschwindigkeit von Molekülen, diebefinden sich innerhalb der Fokus mehr als etwa ein Zehntel der Akquisitionszeit 3, in FCS - Messungen werden 12 nicht korrekt dargestellt. Daher ist es durch FCS aufgezeichnet Diffusionskoeffizienten sind in der Regel schneller als die Diffusionsraten von Techniken wie FRAP und SPT berichtet werden, wo die Nähe zu unbeweglich und sehr langsam Fraktionen als auch berücksichtigt werden. SPT wird auch eine detailliertere Beschreibung der Variabilität von Diffusionsraten innerhalb der molekularen Population als FCS geben. FCS quantifiziert die Schwankung der Fluoreszenzintensität über die Zeit innerhalb des angeregten Volumens. Im Falle von Membran Messungen bedeutet dies zu der beleuchteten Fläche der Membran. In diesem Papier nutzen wir die Tatsache, dass solche Schwankungen durch Moleküle aufweisen Brownsche Diffusion induziert werden und somit in und aus dem Anregungsvolumen bewegt. Es gibt auch mehrere andere mögliche Quellen für die schwankungentionen im Fluoreszenzsignal, wie Blinken oder Gegenwart eines Triplett-Zustand in der Fluorophore, Umweltauswirkungen, bindungs ​​unbinding des Liganden, oder die Bewegung der gesamten Zellmembran. Diese vermeintliche Fehlerquellen müssen in Betracht gezogen werden , wenn ein FCS - Experiment , um die Gestaltung , um genau die Ergebnisse 12, 13 zu interpretieren. Typischerweise seitliche Diffusionsraten in biologischen Membranen sind gering durch Crowding und Interaktionen, sowohl zwischen den Membranproteinen und zwischen Proteinen und dem Zytoskelett. Historisch gesehen , wurde die Verwendung von FCS in Membranen somit durch das Fehlen von photostabilen Fluorophore behindert, die erforderlich sind , während der verlängerten Laufzeiten durch die Anregungsfokus 14 Bleichen zu vermeiden. Doch heute gibt es viele Möglichkeiten für geeignete photostabile Farbstoffe. Signifikante Verbesserungen in Detektoren und anderer Hardware ermöglicht auch die Detektion von fluoreszierenden ProteIns und Farbstoffe von geringer Helligkeit. Hierbei wird ein Basisprotokoll für die Anwendung von FCS murine primären Lymphozyten verwendet, wobei das Protein von Interesse mit einem fluoreszierend markierten Antikörper markiert ist, wird beschrieben. Ein Ansatz, um die Autokorrelationskurven, um zu passen den Diffusionskoeffizienten und die molekulare Dichte wird auch gezeigt, zu extrahieren. Das Protokoll zielt darauf ab, wird leicht gefolgt von Immunologen ohne vorherige Erfahrung von Techniken, um die Diffusion von Molekülen zu untersuchen. Es ist jedoch ein grundlegendes Verständnis für die konfokale Mikroskopie erwartet (um diese grundlegende Verständnis gewinnen, siehe Referenz 15). Dieses Protokoll kann relativ leicht auf andere Suspensionszellen adaptiert werden, die beide Zelllinien und Primärzellen. Für erfahrene Anwender FCS, verfeinerte Analysemethoden existieren, von denen einige in der Diskussion beschrieben werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1206">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td>
			<td style="width:367px;">Miltenyi Biotec NordenAB</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:337px;">Negative selection of NK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Adlrich</td>
			<td style="width:181px;">F7524</td>
			<td style="width:337px;">Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:367px;">-</td>
			<td style="width:181px;">-</td>
			<td style="width:337px;">Made in house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td>
			<td style="width:367px;">PAA The Cell Culture Company&#160;</td>
			<td style="width:181px;">E15-848</td>
			<td style="width:337px;">Transparent medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Antibody clone 2.4G2</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:181px;">553140</td>
			<td style="width:337px;">For blocking Fc-receptors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-Ly49A antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone JR9.318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-H-2Dd antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;">BD Pharmingen</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">558915</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Conjugated in house to MFP488</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone 34.5.8S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">MFP488</td>
			<td style="width:367px;">Mobiotech</td>
			<td style="width:181px;">MFP-A2181</td>
			<td style="width:337px;">Fluorescent dye for antibody conjugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in distilled water (1.10)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:321px;">Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td>
			<td style="width:367px;">SuSoS AG</td>
			<td style="width:181px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Rhodamine 110 chloride</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">432202</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 3.3 &#215; 10&#8722;10 m2/s 19</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Alexa fluor 647</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">A20006</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 4.4 &#215; 10&#8722;10 m2/s 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;">LSM510</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Confocor 3</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Matlab with curve fitting toolbox</td>
			<td style="width:367px;">Matlab</td>
			<td style="width:181px;">Version R2013b</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:367px;">Thermo-scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">155411</td>
			<td style="width:337px;">8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der Diffusion von Molekülen in biologischen Membranen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. FCS kann die molekulare Konzentration und Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in der Zellmembran zu quantifizieren. Diese Technik hat die Fähigkeit , die molekularen Diffusionseigenschaften von Molekülen in der Plasmamembran von Immunzellen im eingeschwungenen Zustand (dh ohne Prozesse beeinflussen das Ergebnis bei der tatsächlichen Messzeit) zu erforschen. FCS ist für die Diffusion von Proteinen zu studieren, die typisch für die meisten endogenen Proteinen in Konzentrationen exprimiert werden. Hier wird eine einfache und robuste Methode, um die Diffusionsgeschwindigkeit von Zellmembranproteinen auf primären Lymphozyten zu bestimmen, wird demonstriert. Ein effektiver Weg, Messungen an Antikörper gefärbten lebenden Zellen durchzuführen und häufig auftretende Beobachtungen nach dem Erwerb werden beschrieben. Die jüngsten Fortschrittebei der Entwicklung von photostabile Fluoreszenzfarbstoffe können durch Konjugieren der Antikörper von Interesse verwendet werden Farbstoffe geeignet, dass während der Messungen nicht extensiv bleichen. Zusätzlich erlaubt dies für die Detektion von langsam diffundierenden Einheiten, die ein gemeinsames Merkmal der Proteine ​​in Zellmembranen exprimiert wird. Das Analyseverfahren Molekülkonzentration und Diffusionsparameter aus den erzeugten Autokorrelationskurven zu extrahieren, wird markiert. Zusammenfassend ist ein Basisprotokoll für die FCS-Messungen vorgesehen sind; sie kann durch Immunologen mit einem Verständnis für die konfokale Mikroskopie, aber mit keiner anderen bisherigen Erfahrungen von Techniken zur Messung von dynamischen Parametern, wie Molekulardiffusionsraten folgen.

Ein typisches Ergebnis wird eine Autokorrelationskurve mit einer Durchlaufzeit in dem Bereich von 10 msec bis 400 msec für Membranproteine ​​erzeugen. Die Anzahl der Moleküle können zwischen 0,5 bis etwa 200 pro &amp; mgr; m 2 für endogen exprimierte Proteine variieren. Prüfen Sie sorgfältig, dass die CPM ist nicht geringer als erwartet. Dies kann bedeuten, dass es einen Einfluss des Hintergrundsignals. Als Daumenregel gilt, das CPM-Signal auf Zellen, die für die Analyse angenommen wird, sollte nicht weniger als 33% des CPM für frei Antikörper mit der gleichen Laserleistung diffundieren. Die CPM sollte linear mit der Laserleistung zu skalieren. Die Autokorrelationskurve für primäre Immunzelloberflächenrezeptoren soll glatt sein, mit dem steilsten Teil zwischen 0,001 und 1 Sek. Siehe Abbildung 2 für eine repräsentative Autokorrelation Kurve und deren Zeitverlauf. Wie kurz in der Einleitung erwähnt, diere gibt mehrere Fälle, in denen FCS zur Messung der molekularen Diffusion durch den Einfluss von anderen Quellen von Fluoreszenzfluktuationen nicht geeignet ist, die dazu beitragen, um das Signal zu verwechseln. Figur 3 zeigt Beispiele von Fällen , in denen eine bestimmte Zelle oder Mess repeat verworfen werden sollte. Es wurde bereits erwähnt, dass ein extrem niedriges Signal (sehr niedrige CPM) für wird bewirken, dass die Zelle zu verwerfen. Ein weiterer Grund für die einzelne Zelle zu verwerfen ist , dass die Zelle (3A) bewegt. Im Fall von Bleich (3B) , oder wenn große Cluster vorhanden sind (3C), sollten die Messungen verworfen werden , wenn die Wirkung beträchtlich oder Gegenwart während der gesamten Messung ist. Wenn diese Funktion nur in einem oder zwei Wiederholungen ist, diese einzelnen Wiederholungen können verworfen werden, aber die restlichen Wiederholungen immer noch verwendet werden können. Es ist wichtig, sowohl für die korrekte VerwendungModell, um die Daten zu passen, und auch sorgfältig prüfen, ob die Passung eng mit der Autokorrelationskurve überlappt. In Abbildung 4 sind Beispiele für gute und schlechte Kurvenanpassungen gezeigt. Achten Sie besonders auf den Teil der Kurve, die Diffusion (die steil abfallenden Teil). Es ist auch wichtig festzustellen, dass sowohl der Beginn und das Ende des abfallenden Teil der Kurve sind durch das Modell gut ausgestattet. Wenn die Passform ist schlecht, ohne offensichtliche Probleme wie bewegend, Bleichen oder Cluster, ändern Sie die Startwerte und / oder die obere und untere Grenze (innerhalb einer angemessenen Bereich), bevor sie eine endgültige Entscheidung um die Zelle zu verwerfen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> Abbildung 1: FCS Software - Schnittstelle. Gezeigt sind hier die Hauptfenster notwendig, die Software-Tool für FCS Erfassung und Abbildungs ​​zu arbeiten, wie in dem Protokoll beschrieben. Fenster A, die &quot;Konfiguration Control &quot;Fenster ist das Kontrollfenster für den Strahlengang, Laserkanäle und Filter für die Bildgebung. Fenster B ist der&quot; Scan Control &quot;Fenster für die Bildgebung und zeigt die Scan-Einstellungen. Fenster C ist die&quot; Messung &quot;Fenster, das Fenster für die Aufbau der Messeinstellungen FCS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Spur und Autokorrelation Kurven von H-2D d Major Histocompatibility Klasse Diffundieren I Oberflächenmoleküle in frisch isolierten murinen NK - Zellen. Die obere Platte in der Figur zeigt die Fluoreszenzschwankung als Funktion der Zeit während des gesamten Zeitverlaufs von 10 sec Messungen 7x. Das untere Feld darstellens die gemittelte Autokorrelation Kurve aus diesen sieben Wiederholungen. Die Höhe der Autokorrelationskurve ist umgekehrt proportional zur Konzentration des mobilen fluoreszenzmarkierten H-2D d Entitäten innerhalb des Fokalvolumens. Die x-Achsen - Wert am steilsten Teil der Steigung der Kurve, die Hälfte der Amplitude, stellt die durchschnittliche Verweilzeit von fluoreszenzmarkierten H-2D d Moleküle im fokalen Volumen. Die Messung dargestellt ist ein Teil des Datensatzes in Bezug auf 2 veröffentlicht. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispiele für problematische Zellspuren. (A) Eine bewegliche Zelle, wie sie beispielhaft durch die Spur keine stabile aufweist basal level. Das obere Feld zeigt ein Beispiel, bei dem die gesamte Zelle wurde nach etwa 35 sec unscharf bewegt, wie durch den sehr niedrigen Signal nach diesem Zeitpunkt dargestellt. In der unteren Platte ist die Wirkung subtiler, mit Wellungen offensichtlich in einem Abstand von mehreren Sekunden. (B) Zell Anzeige Bleichen, um die Höhe der Spur mit der Zeit abnimmt. Vergleichen der Höhe der Spur zu Beginn der Messung an, daß am Ende der Messung. (C) Das Vorhandensein von großen Clustern, die von Spitzen in der Spur dargestellt. In der oberen Platte ist ein großer Cluster bei 20-25 sec vorhanden. In der unteren Platte sind mehrere Cluster während der Messung vorhanden. Die Messungen vorgestellt werden sind ein Teil des Datensatzes in Bezug auf 2 veröffentlicht. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 4: Repräsentative Autokorrelation Kurven mit Kurvenanpassung und Residuen. Die roten und blauen vertikalen Linien stellen die Grenzen des Zeitfensters für den Einbau verwendet. (A) Beispiel eines repräsentativen Sitz eines 2-dimensionalen Diffusionsmodell zu einer Probe Autokorrelationskurve. In der oberen Platte, die grüne Kurve (das Modell) überlagert die blaue Kurve (die erworbenen Autokorrelation), eine gute Passform anzeigt. Das untere Feld zeigt die Rest aus der Kurvenanpassung. Die Schwankungen um 1 Sekunde, die nicht gut ausgerüstet sind, sind typisch für Zellmessungen und sind erträglich. (B) Beispiel für eine schlechte Passform von 2-dimensionale Diffusion zur gleichen Autokorrelationskurve. Das angepasste Modell überlagern nicht die Autokorrelation Kurve, und es konvergiert nicht bei 1. Die unteren Platten in (A und B) zeigen den Rest aus der Kurvenanpassung. Die Residuensind für die schlechte Passform deutlich größer, insbesondere für die Diffusion des Kurventeils. Die Messung dargestellt ist ein Teil des Datensatzes in Bezug auf 2 veröffentlicht. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Molekulare Diffusion in Plasmamembranen primärer Lymphozyten, gemessen durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie | Immunologie und Infektion | Video

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

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10.8K Aufrufe.  Karolinska Institutet. A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Serie: Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Forschung

Immunologie und Infektion

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...