我々はツァイスConfocor 3機器のメンテナンスのため、およびセル測定に関する役立つヒント博士Vladanaブコエビッチ、分子医学センター、カロリンスカ研究所に感謝します。この研究はVetenskapsrådet（承認番号2012- 1629年）、マグナスBergvallsのstiftelseから、とStiftelsenクレスGroschinskysのminnesfondからの助成金によって賄われていました。

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The authors have nothing to disclose.

FCSのためのこのプロトコルは、免疫細胞（マウス、ヒト、または他の種）のすべてのタイプの表面分子の分子動力学の評価のために使用することができます。生細胞における単一分子の解像度にダウンFCS対策時空間分子動力学を。分子密度、ならびに目的のタンパク質の拡散速度とクラスタリングのダイナミクスは、自己相関曲線から抽出することができます。 蛍光標識は、成功したFCS実験のために極めて重要な重要です。細胞膜上で目的のタンパク質は、従来の抗体を用いて標識され、抗体はしばしば、ナイーブ免疫細胞における表面タンパク質の使用のために最も便利です。非標識抗体は、直接、高分子明るさと光安定性の蛍光色素に結合させなければなりません。抗体結合のための蛍光体の選択は、測定の質のために重要です。フローサイトメトリーのための標準的なラベル例えばフルオレセインおよびフィコエリトリン系染料として、急速な漂白に推奨されていません。抗体に直接結合するフォト安定染料は、現在、いくつかの企業によって提供されています。製造業者は、通常、得られたコンジュゲート抗体のコンジュゲーション及び精製のために十分なプロトコルを提供し、これは数時間で行うことができます。蛍光タンパク質を使用してFCSを行うことも可能であるが、蛍光タンパク質は、ほとんどの光安定な化学フルオロフォアより漂白一般的傾向にあるので、特別な注意が、レーザーパワーを最小化するために取られるべきです。以前の経験によれば、過剰発現タンパク質の多くの場合、蛍光タンパク質の使用が適さないによる混雑の拡散速度のかなりの減少をもたらします。 測定の前にピンホールの校正も重要なステップです。焦点体積の大きさを決定するために使用されるフルオロフォアは、拡散係数を知っていなければなりませんS（式2を参照）。焦点体積の大きさを決定するために、抗体の標識の発光スペクトルに密接に対応する遊離フルオロフォアを使用してください。これは、最適な信号効率と色チャネル間の潜在的相互相関の適切な検出を保証するために行わなければなりません。システムは電力の範囲にわたって予想される出力信号を与えることを確実にするために自由に拡散する蛍光団のFCSレーザパワーシリーズを実行します。実験間の一貫性を確保するための実験の間に同じレーザパワーでCPMを比較。 分析工程では、モデルをフィッティングするときの変数のための合理的な範囲や初期値を置くことが不可欠です。良い出発点を見つけるために、同様の細胞系からの以前に発表された知識を使用してください。注意ある程度の結果を解釈する際に注意しなければならない、理論的には、FCSは、定量的な技術であるが、最適な条件はほとんど発生しないからです。変動のすべての種類が記録されます、かかわらず、このような変動の起源の。したがって、可能な誤差源を排除するために実験システムに関するできるだけ多くの情報を有することが有用です。溶液中の遊離蛍光体の推定上の汚染物質が少なくとも10倍短いTAUDに拡散するのに対し、例えば、全細胞膜の動きは、長いTAUD（ 図3A）との変動を生じさせます。 この基本的なプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。二つのタンパク質は、異なる蛍光体で標識されている場合、共拡散（相互作用の間接的な尺度）は、相互相関を検出する方法を拡張することによって評価することができます。これらのタンパク質は、細胞膜において互いに結合する程度は、個々のカラーチャネルの自己相関曲線の高さに対する相互相関曲線の高さで表されます。相互相関は、測定ソフトウェアでCH1〜Ch2のように表されます。プレ相互相関のcise分析は、クロストークのコントロールを必要とするので、やや複雑ここに提示プロトコルよりなります。この基本的なプロトコルの拡張として、続行する方法の詳細な説明は、Strömqvist らに見出すことができます。 13。 z方向の位置決めを最適化するために、z-スキャンFCS 22を使用することができます。これまでの経験によれば、手動でこれを行うには満足しています。 FCSの自己相関曲線23に複数の拡散係数を適合することも可能です。これは、異なる拡散速度を有すると亜集団の少なくとも一つのおおよその拡散速度の亜集団の数の事前知識を必要とします。それ以外の場合は、フィッティング信頼できないをレンダリングしますあまりにも多くの自由変数が存在するであろう。典型的な例は、その拡散速度はかなりリガンドの結合によって減速された表面タンパク質であろう。最後に、cleani完全反復配列を除去することなく、外れ値のトレースをngのは、24可能です。 蛍光シグナルの欠如は、トラブルシューティングするための共通の問題です。自由に蛍光団を拡散させるために、ドロップが蛍光性であるかどうかを確認するためにハロゲンランプを使用します。ドロップが蛍光でない場合、（nM範囲内で）わずかに増加濃度のフルオロフォアの新しいバッチをミックスして、再試行してください。フォーカスが蛍光ドロップ内にある、レーザはレーザパワーが十分であり、ソフトウェアでオンになっていることを確認し、（正しい発光フィルターと検出器が選択され、そして「FCS測定」ウィンドウで右チャンネルが活性化されるステップを参照してください3.6）。レーザーを起動し、視覚的にレーザ光がサンプルに到達したことを確認する側から見て。ストレートレーザ光源に探して避けてください。選択された放射フィルタは、レーザ波長を含む場合は、シャッターが自動的に検出器への損傷を避けるために、光路を遮断します。私Fすべての設定は大丈夫ですが、何の光が、到着していないレーザー、FCSシステム、およびコンピュータを再起動してください。蛍光シグナルの欠如が解消されない場合は、専門家に依頼してください。標識された細胞が蛍光を表示しない場合は簡略化の手順が適用されます。ハロゲンランプと蛍光の存在を確認してください。 、レーザーをオンにしたレーザチャンネルを選択して、レーザーパワーを調整します。いずれかの「十字」または「位置を追加」オプションを（ステップ6.4を参照）を使用して、細胞膜上の位置を選択します。信号は依然として低すぎる場合には、次のサンプルに切り替えます。 技術の変動基準の1つの重要な態様は、分子を検出することが合理的に移動しなければならないことです。非常にゆっくりと全体の測定時間中にフォーカスよりも小さな領域内に捕捉された分子または分子の画分を動かす従って測定することはできません。これは、表面密度の可能な過小評価と拡散率の過大評価をもたらします。漂白分子は、それらがレーザー照射焦点体積内で過ごす時間が漂白されているのより高い確率を持っていますので、また、密度とTAUD両方の推定上の過小評価に寄与することができます。背景（焦点面の外側からの蛍光）の影響は、一方で、人工的に検出された分子の数を増加させ、測定されたCPMを減少させるであろう。これまでは、絶対密度の決意で合計最大誤差は約40〜20％であると推定されました。誤差源は、ほとんどの場合、実験を通して等しいので、お互いに異なる生物学的サンプルを比較することが通常可能です。別の潜在的なエラー源は、抗体は、各抗体は、潜在的に2つの標的分子に結合することができることを意味し、二価であることです。著者らは、この現象を観察しなかったが、これは他の抗体のための世界的な機能があることを保証することはできません。二価の潜在的な影響なければなりませんしたがって、各抗体について個別に試験すること。特定の一次および標識二次抗体の組み合わせは、2つの連続した二価のラベルから人工クラスタを誘発する危険性が高いために使用してはなりません。細胞ではなく、目的のタンパク質の蛍光タンパク質で標識されたバージョンでトランスフェクトされた場合は、すべてのタンパク質は、1つのラベルだけを持つことになります。しかし、これは必ずしも望ましくないとさえ可能でないかもしれない、トランスフェクションを必要とする（ 例えば、直接にヒト血液から単離された免疫細胞を使用する場合）。最後に、シングルポイントFCSは、画像を記録しません。画像が公開または他の目的のために必要とされる場合、これらは、ソフトウェアの撮像部を用いて別々に捕捉されなければなりません。常に細胞表面の不要な漂白を避けるために、FCS測定後の画像を取り込みます。 FCSは異なり、例えば、FRAP、画像相関方法として、従来の共焦点系顕微鏡は、蛍光の変動を定量化することができません単一分子レベル6で。画像相関法が間接的に低い解像度を有する分子の数を測定するが、それらは全体の画像化された領域25の上に分子拡散およびクラスタリングのばらつきを評価することができます。共焦点顕微鏡により測定した標準SPTは、標識の理想的なレベル、FCS 7よりも低い桁違いを持っています。したがって、標識されたタンパク質の濃度は、標準的なSPTによって測定することができません。他の顕微鏡技術とSPTの組み合わせ（ 例えば、確率的光学再構築顕微鏡または光活性化局在顕微鏡）は、密度と動きを評価することができますが、それは非常に特殊な染料やタンパク質11が必要です。このような構造化照明顕微鏡などの超解像技術、および発光枯渇顕微鏡を刺激し、多くの場合、固定したサンプルとlabelinのための一次および二次抗体の組み合わせを必要としますグラム26。システムのダイナミクスが頻繁に評価することはできないが局在化は、したがって、非常に正確です。 SPTと超解像技術と比較すると、FCSはまた、結果の分析および抽出のために大幅に少ないコンピュータパワーと時間を要します。フローサイトメトリーは、免疫学の主力であり、良好FCSと組み合わせることができます。光安定性色素が選別前に使用された場合、細胞選別は、例えば、選択された細胞集団のその後の測定によって追跡することができます。 FCSは、このように、単独で、または他の確立された方法と組み合わせて使用​​することができる方法です。 このプロトコルは、単一分子レベルでの細胞膜内の免疫細胞の動態との相互作用の現在未知の機能を同定するために用いることができます。また、選択されたサブセット対全集団の特徴を比較することができます。それはまた、免疫細胞療法の選択ステップとして潜在的な役割を有しています。測定は行うので、電池を消費し、免疫細胞の機能を調べるための最も他の方法とは異なり、個々の細胞は、潜在的に回収して培養することができるではありません。したがって、FCS曲線の分析の後、有望な細胞を抽出することができると推定される臨床用途を含む付加的な用途に拡大しました。

多くの免疫細胞の機能は、分子拡散し、膜内の相互作用に依存しています。生体膜は複雑であり、免疫細胞の機能に重要であり得る多くの因子が細胞膜1内のタンパク質の並進拡散の速度に影響を与えることができます。我々は最近、自然免疫系に属するナチュラルキラー（NK）細胞、リンパ球、NK細胞活性化2の状態に応じて、細胞膜の2つの研究のタンパク質の差拡散を示すことが示されました。 蛍光相関分光法（FCS）は、生体膜内の分子の拡散速度を定量化することが可能な技術です。これは、固定されたボリューム内の蛍光標識された分子の平均拡散速度、共焦点顕微鏡の一般的に焦点を報告します。これは、中分子運動の際に発生する蛍光の変動の測定に基づいています定常状態でのシステム。 FCSは、溶液中及び脂質膜の中に両方の蛍光色素とタンパク質の拡散を研究するために広く使用されています。拡散速度に影響を与える他の出力パラメータは、また、間接的にこの方法で研究することができる（ 例えば、タンパク質または細胞膜上の分子の相互作用の立体構造変化）3、4。 FCSは、単一分子検出のための可能性を可能にする、その高い感度のために他の技術に比べて際立っています。これは、ほとんどのタンパク質5の内因性発現レベルに典型的なミリモルの範囲にナノモル、中の分子の濃度に適しています。他のほとんどの技術が唯一のタンパク質発現レベルについての相対的な情報を提供しながら、さらに、FCSは、研究ボリューム内のタンパク質の絶対数の近似値を与えることができます。膜内の分子拡散速度を測定する他の方法は、フルオが含まれます（FRAP）を光退色後のrescence回復、単一粒子追跡（SPT）は、複数のピンホールFCS、および画像相関方法。 FRAPと画像相関法は、一般の分子10の絶対数についての情報を与えていないアンサンブル技術です。 SPTと比較すると、FCSのスループットは、母集団の平均を特徴付けるの点で高くなっています。レーザー焦点内に存在する分子の平均拡散速度がなく、1つの分子の速度よりも、測定されているので分析も負担が小さいです。特殊な顕微鏡は11用意されていない限り、標準的なSPTの標識は、単一分子の同定を可能にするために非常に低くなければならないためにも、SPTは、濃度に関する情報を与えることはできません。一方、FCSは、研究中の分子がモバイルであることが必要です。それは単に非常にゆっくりと移動し、任意の推定される不動の分画または分子を検出しません。その分子の拡散速度取得時間の10分の1程度が正しくFCS測定3、12で表現されることはありませんよりも長い焦点内に存在します。したがって、FCSによって記録された拡散係数がto-不動-近く、非常に遅い画分も同様に考慮されFRAPとSPT、のような技術から報告拡散速度よりも速くなる傾向があります。 SPTはまた、FCSの意志よりも分子集団内での拡散速度の変動のより詳細な説明を行います。 FCSは興奮ボリューム内の経時的な蛍光強度の変動を定量化します。膜測定の場合には、これは、膜の照明領域に変換されます。本稿では、そのような変動はブラウン拡散を示す分子によって誘導されるため、および励起体積の外に移動しているという事実を利用しています。 fluctuaのためのいくつかの他の可能なソースもあります。このような結合バインド解除、全細胞膜のリガンド、または運動の、点滅またはフルオロフォア、環境への影響で三重項状態の存在のような蛍光シグナルのン、。これらの推定上の誤差源は、正確な結果12、13を解釈するためにFCS実験を設計する際に考慮される必要があります。一般的に、生体膜における横方向の拡散率は、膜タンパク質の間にタンパク質および細胞骨格間の両方、混雑との相互作用に起因する低いです。歴史的には、膜中のFCSを使用することは、従って、励起焦点14を貫通通過時間中に退色を避けるために必要な光安定性蛍光体の欠如によって妨げられてきました。しかし、今日、適切な光安定性染料のためのオプションがたくさんあります。検出器および他のハードウェアの大幅な改善はまた、蛍光proteの検出を可能にします低輝度のインおよび染料。ここでは、目的のタンパク質は、蛍光タグ化抗体で標識されたマウス初代リンパ球を用いたFCSの適用のための基本的な手順について説明します。拡散係数および分子密度を抽出するために自己相関曲線を適合させる手法も示されています。プロトコルは、簡単に分子の拡散を研究するための技術の以前の経験を持つ免疫学者が続くことを目指しています。しかし、共焦点顕微鏡の基本的な理解が期待されている（参照15を参照して 、この基本的な理解を得るために）。このプロトコルは、比較的容易に他の懸濁細胞、細胞株および初代細胞の両方に適合させることができます。より洗練された分析方法が存在し、より経験豊富なFCSユーザーの場合、そのうちのいくつかは、議論に記載されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1206">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td>
			<td style="width:367px;">Miltenyi Biotec NordenAB</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:337px;">Negative selection of NK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Adlrich</td>
			<td style="width:181px;">F7524</td>
			<td style="width:337px;">Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:367px;">-</td>
			<td style="width:181px;">-</td>
			<td style="width:337px;">Made in house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td>
			<td style="width:367px;">PAA The Cell Culture Company&#160;</td>
			<td style="width:181px;">E15-848</td>
			<td style="width:337px;">Transparent medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Antibody clone 2.4G2</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:181px;">553140</td>
			<td style="width:337px;">For blocking Fc-receptors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-Ly49A antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone JR9.318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-H-2Dd antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;">BD Pharmingen</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">558915</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Conjugated in house to MFP488</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone 34.5.8S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">MFP488</td>
			<td style="width:367px;">Mobiotech</td>
			<td style="width:181px;">MFP-A2181</td>
			<td style="width:337px;">Fluorescent dye for antibody conjugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in distilled water (1.10)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:321px;">Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td>
			<td style="width:367px;">SuSoS AG</td>
			<td style="width:181px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Rhodamine 110 chloride</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">432202</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 3.3 &#215; 10&#8722;10 m2/s 19</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Alexa fluor 647</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">A20006</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 4.4 &#215; 10&#8722;10 m2/s 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;">LSM510</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Confocor 3</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Matlab with curve fitting toolbox</td>
			<td style="width:367px;">Matlab</td>
			<td style="width:181px;">Version R2013b</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:367px;">Thermo-scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">155411</td>
			<td style="width:337px;">8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

蛍光相関分光法（FCS）は、高い空間及び時間分解能で生体膜内の分子の拡散を研究するための強力な技術です。 FCSは、細胞膜に蛍光標識された分子の分子濃度及び拡散係数を定量化することができます。この技術は、（プロセスは実際の測定時に結果に影響を与えることなく、すなわち、）定常状態における免疫細胞の原形質膜中の分子の分子拡散特性を探索する能力を有します。 FCSは、ほとんどの内因性タンパク質のための典型的なレベルで発現されるタンパク質の拡散を研究するのに適しています。ここでは、一次リンパ球上の細胞膜タンパク質の拡散速度を決定するための簡単かつ堅牢な方法が示されています。抗体染色生細胞と買収後の一般的に存在する観測に測定を実行するための効果的な方法が記載されています。最近の進歩フォト安定した蛍光色素の開発に測定中に広範囲に漂白しない染料を適切なために目的の抗体を結合することにより利用することができます。また、これは、細胞膜に発現したタンパク質の共通の特徴である、ゆっくりと拡散するエンティティの検出を可能にします。生成された自己相関曲線から分子濃度と拡散パラメータを抽出するための分析手順が強調表示されます。要約すると、FCS測定のための基本的なプロトコルが提供されます。それは、共焦点顕微鏡の理解ではなく、このような分子の拡散速度などの動的パラメータを測定するための技術の無い他の以前の経験と免疫学者を続けることができます。

典型的な結果は、膜タンパク質のための400ミリ秒に10ミリ秒の範囲内の通過時間との自己相関曲線を生成します。分子の数は、内因的に発現するタンパク質を約200μmの2あたりに0.5の間で変化することができます。 CPMが予想より低くないことを慎重に確認してください。これは、バックグラウンド信号の影響があることを意味します。経験則として、分析のために受理された細胞上のCPM信号が自由に同一のレーザパワーで抗体を拡散させるためのCPMの33％よりも低くするべきではありません。 CPMは、レーザパワーで直線的に拡張する必要があります。一次免疫細胞表面受容体に対する自己相関曲線は0.001と1秒との間の最も急な部分と、滑らかであることが期待されます。代表的な自己相関曲線とそのタイム・トレースについては、 図2を参照してください。 導入部で簡単に述べたように、再FCSが原因で信号を交絡するために貢献する蛍光変動の他の供給源の影響で分子拡散を測定するのに適していないいくつかの例です。 図3は、特定の細胞または測定の繰り返しを破棄すべき例の例を示しています。すでに非常に低い信号（非常に低いCPM）は、セルを廃棄するための原因であることが言及されています。個々のセルを廃棄するための別の理由は、セルが（ 図3A）に移動していることです。効果は測定全体を通してかなりまたは存在する場合に漂白の場合（ 図3B）、または大規模なクラスタが存在する場合（ 図3C）では、測定値は破棄されるべきです。この機能は、1つまたは2つの反復中にのみ存在する場合、これらの個々の反復は、廃棄することができるが、残りの反復はまだ使用されてもよいです。 両方が正しい使用することが重要ですデータに合わせて、また、フィット感が密接に自己相関曲線と重なっていることを慎重に確認するためのモデル。 図4では、良好な悪いカーブフィットの例が示されています。拡散を表す曲線（最も急傾斜部分）の部分には細心の注意を払ってください。開始と曲線の傾斜部分の両端は、モデルによってよくフィットしていることを確認することも重要です。フィットは、細胞を廃棄する最終決定を行う前に、開始値及び/又は（合理的な範囲内）に上限値と下限値を変更する、移動、漂白、又はクラスターのような明白な問題もなく、不良である場合。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> 図1：FCSソフトウェアインターフェイス。ここに示されているプロトコールに記載されているように、FCS取得および画像化のためのソフトウェアツールを動作させるために必要なメインウィンドウです。ウィンドウA、「構成のControl」ウィンドウには、イメージング用のビーム経路、レーザー・チャネル、およびフィルタのための制御ウィンドウです。ウィンドウBは「スキャン制御」スキャンの設定イメージング用のウィンドウと表示されます。ウィンドウCが「測定」ウィンドウのための窓FCSの測定設定のセットアップ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> 図2：H-2D D 主要組織適合性クラスを 拡散の代表的なトレースと自己相関曲線は、 私は新たに単離したマウスNK細胞内の分子表面。図の上のパネルは7倍10秒測定の全体時間トレース全体で時間の関数としての蛍光の変動を示しています。下のパネルは表しこれらの7つの反復からの平均自己相関曲線です。自己相関曲線の高さが焦点体積内の移動、蛍光標識されたH-2D dのエンティティの濃度に反比例します。 x軸曲線の傾きの最も急な部分の値が、振幅の半分は、焦点体積内の蛍光標識されたH-2D dの分子の平均滞留時間を表します。提示された測定は、文献2に公開されたデータセットの一部です。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> 図3： 問題のあるセルのトレースの例 。トレースによって例示されるような（A）移動する細胞、安定した基礎ルを有していませんVEL。上部パネルは、この時点の後、非常に低い信号によって表されるような全細胞は、約35秒後焦点外に移動した例を示しています。下のパネルでは、効果は数秒の間隔で見かけのうねりで、より微妙です。 （B）細胞は、漂白、時間とともに減少するトレースの高さを表示します。測定終了時と、測定開始時のトレースの高さを比較してください。 （C）大規模なクラスタの存在、微量の急増によって表されます。上のパネルでは、20〜25秒で一つの大きなクラスタが存在しています。下のパネルでは、複数のクラスタは、測定全体に存在しています。提示測定は、参考文献2に公開されたデータセットの一部です。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図4： カーブフィッティングと残差を持つ代表的自己相関曲線。赤と青の縦線は、フィッティングのために使用される時間ウィンドウの範囲を表します。試料の自己相関曲線の2次元拡散モデルの代表的な適合の（A）の例。上のパネルでは、緑の曲線（モデル）は、良好なフィット感を示し、青い曲線（取得自己相関）をオーバーレイします。下のパネルは、カーブフィッティングから残留を示しています。うまく装着されていない1秒の周りの変動は、セル測定のための典型的であり、許容されています。 （B）と同じ自己相関曲線に2次元拡散の悪いフィットの例。フィットされたモデルは、自己相関曲線をオーバーレイしません。また、（AとB）1.下のパネルで収束しないフィッティング曲線からの残留を示しました。残差特にカーブの拡散部のため、悪いフィット感を大幅に大きくなっています。提示された測定は、文献2に公開されたデータセットの一部です。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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蛍光相関分光法で測定した初代リンパ球の細胞膜における分子拡散 |免疫学と感染症 |ビデオ

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

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Nanyang Technological University

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10.8K ビュー.  Karolinska Institutet. A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

免疫・感染学

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

レシオメトリック蛍光顕微鏡によってファゴソームのpHを測定します

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...