Ringraziamo il Dr. Vladana Vukojević, Centro di Medicina Molecolare, Karolinska Institutet per la manutenzione dello strumento Zeiss ConfoCor 3 e per suggerimenti utili per quanto riguarda le misure di cella. Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal Vetenskapsrådet (concessione numero 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, e da Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+(mICS).">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435 (2016).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo per FCS può essere utilizzato per la valutazione delle dinamiche molecolari di molecole di superficie su tutti i tipi di cellule immunitarie (murina, umana, o altre specie). Misure FCS spazio-temporali dinamica molecolare fino a risoluzione di una singola molecola in cellule vive. La densità molecolare, nonché le dinamiche dei tassi di diffusione e di clustering delle proteine ​​di interesse, possono essere estratte dalle curve di autocorrelazione. L&#39;etichettatura fluorescente è di fondamentale importanza per gli esperimenti FCS successo. Proteine ​​di interesse sulla membrana cellulare sono tradizionalmente etichettati utilizzando anticorpi e gli anticorpi sono spesso più conveniente per l&#39;uso su proteine ​​di superficie nelle cellule immunitarie naive. Gli anticorpi non etichettati devono essere direttamente coniugati a coloranti fluorescenti foto-stabile con una luminosità molecolare. La selezione del fluoroforo per l&#39;anticorpo coniugazione è importante per la qualità delle misurazioni. etichette standard per citometria a flusso,come la fluoresceina e coloranti ficoeritrina-based, non sono raccomandati a causa della rapida sbiancamento. Foto-stabile coloranti per coniugazione diretta di anticorpi sono attualmente forniti da diverse società. I produttori di solito forniscono protocolli soddisfacenti per coniugazione e purificazione dell&#39;anticorpo coniugato risultante, e questo può essere fatto in poche ore. È anche possibile eseguire FCS utilizzando proteine ​​fluorescenti, ma particolare attenzione deve essere presa per minimizzare la potenza del laser, poiché le proteine ​​fluorescenti sono in generale più inclini allo sbiancamento del più fotostabili fluorofori chimici. Secondo l&#39;esperienza precedente, sovra-espressione di proteine ​​spesso porta ad una notevole diminuzione della velocità di diffusione a causa di affollamento, il che rende l&#39;uso di proteine ​​fluorescenti non idoneo. taratura Pinhole prima delle misure è anche un passo fondamentale. I fluorofori utilizzati per determinare la dimensione del volume focale dovevano sapere coefficiente di diffusiones (vedi Equazione 2). Utilizzare fluorofori liberi corrispondenti strettamente alla spettri di emissione delle etichette anticorpi per determinare la dimensione del volume focale. Questo deve essere fatto per assicurare l&#39;efficienza ottimale del segnale e la corretta rilevazione dei potenziali correlazioni incrociate tra canali di colore. Eseguire una serie di potenze laser FCS dei fluorofori liberamente diffusori per garantire che il sistema dà il segnale di output previsto su una gamma di potenze. Confrontare il CPM a parità di potenza del laser tra esperimenti per garantire la coerenza tra esperimenti. Nella fase di analisi, è essenziale mettere intervalli ragionevoli e valori iniziali per le variabili durante il montaggio dei modelli. Utilizzare conoscenze precedentemente pubblicato da sistemi cellulari simili a trovare buoni punti di partenza. Teoricamente, FCS è una tecnica quantitativa, ma dal momento che le condizioni ottimali si verificano raramente, un certo grado di cautela deve essere presa quando si interpretano i risultati. saranno registrati tutti i tipi di fluttuazioni,indipendentemente dall&#39;origine di tali fluttuazioni. Pertanto, è utile disporre di quante più informazioni possibili sul sistema sperimentale per escludere possibili fonti di errore. Per esempio, movimento dell&#39;intera membrana cellulare darà luogo a fluttuazioni con più TAUD (Figura 3A), considerando che i contaminanti putativi dei fluorofori liberi nella soluzione diffonderanno con almeno dieci volte più breve TAUD. Questo protocollo di base può essere modificata in diversi modi. Se due proteine ​​sono etichettati con differenti fluorofori, co-diffusione (una misura indiretta di interazione) può essere valutata espandendo la metodologia per rilevare la correlazione incrociata. La misura in cui queste proteine ​​si legano l&#39;uno all&#39;altro nella membrana cellulare è rappresentata dall&#39;altezza della cross-correlazione curva relativa all&#39;altezza delle curve di autocorrelazione dei singoli canali di colore. Correlazione incrociata è indicata come Ch1 Ch2-in software di misura. il preanalisi CISE di cross-correlazione richiede controlli per cross-talk ed è quindi un po &#39;più complicato del protocollo presentato qui. Una descrizione dettagliata di come procedere, come un&#39;estensione questo protocollo di base, può essere trovato in Strömqvist et al. 13. Per ottimizzare il posizionamento nella direzione z, z-scansione FCS possono essere utilizzati 22. Secondo l&#39;esperienza precedente, è stato soddisfacente per farlo manualmente. È anche possibile montare più coefficienti di diffusione ad una curva di autocorrelazione FCS 23. Ciò richiede precedente conoscenza del numero di sottopopolazioni con differenti velocità di diffusione e delle velocità di diffusione approssimativo di almeno una delle sottopopolazioni. In caso contrario, ci saranno troppe variabili liberi, che renderanno l&#39;inaffidabile raccordo. Un esempio tipico è una proteina di superficie la cui velocità di diffusione è sensibilmente rallentato dal legame di un ligando. Infine, depurazng la traccia di valori anomali senza interamente rimozione ripete è possibile 24. La mancanza di un segnale fluorescente è un problema comune per risolvere. Per diffondere liberamente fluorofori, utilizzare la lampada alogena per verificare se il calo è fluorescente. Se la caduta non è fluorescente, mescolare un nuovo lotto di fluorofori con un lieve aumento della concentrazione (all&#39;interno della gamma nM) e riprovare. Verificare che la messa a fuoco è all&#39;interno della goccia fluorescente, i laser sono accesi nel software, la potenza del laser è sufficiente, i filtri e rilevatori di emissione corretti vengono scelti, ed i canali destro nella finestra &quot;FCS misura&quot; sono attivati ​​(vedere il passaggio 3.6). Avviare il laser e guardare dal lato per confermare visivamente che la luce laser raggiunge il campione. Evitare di guardare direttamente nella sorgente laser. Se il filtro di emissione selezionato comprende la lunghezza d&#39;onda del laser, un otturatore blocca automaticamente il percorso della luce per evitare danni al rivelatore. iof tutte le impostazioni vanno bene, ma arriva nessuna luce, riavviare il laser, il sistema FCS, e il computer. Chiedi un esperto se la mancanza di un segnale fluorescente persiste. Una procedura semplificata si applica se le cellule etichettate non vengono visualizzati fluorescenza. Confermare la presenza della fluorescenza con la lampada alogena; attivare i laser, selezionare i canali laser, e regolare la potenza del laser. Selezionare una posizione sulla membrana cellulare, sia utilizzando l&#39;opzione &quot;Aggiungi posizione&quot; (vedi punto 6.4) &quot;Crosshair&quot; o. Passare al campione successivo se il segnale è ancora troppo basso. Un aspetto importante della base fluttuazione della tecnica è che le molecole devono essere ragionevolmente mobili da rilevare. frazioni di molecole o molecole intrappolate all&#39;interno di aree più piccole del fuoco durante tutto il tempo di misura molto lentamente movimento non può quindi essere misurata. Questo porta ad una possibile sottostima della densità di superficie e una sovrastima del tasso di diffusione. candeggiopossono anche contribuire ad una sottostima putativo sia della densità e TAUD, poiché le molecole avrà una maggiore probabilità di essere sbiancato il tempo più lungo trascorso nel volume focale laser illuminata. Influenza dallo sfondo (fluorescenza dall&#39;esterno del piano focale) avrebbe, invece, artificialmente aumentare il numero di molecole identificati e diminuire il CPM misurata. In precedenza, l&#39;errore massimo totale nella determinazione della densità assoluta è stata stimata essere circa il 40% 20. Tuttavia, di solito è possibile confrontare diversi campioni biologici tra loro, dal momento che le fonti di errore sono, nella maggior parte dei casi, uguali in tutto gli esperimenti. Un&#39;altra potenziale fonte di errore è che gli anticorpi sono bivalenti, che significa che ogni anticorpo può potenzialmente legarsi a due molecole bersaglio. Gli autori non hanno osservato questo fenomeno, ma non possono essere garantite che questa è una caratteristica globale per altri anticorpi. Il potenziale influenza della bivalenza devepertanto essere testato singolarmente per ciascun anticorpo. La combinazione di specifici anticorpi primari e secondari etichettati non deve mai essere utilizzato a causa dell&#39;elevato rischio di indurre cluster artificiali da due successive etichette bivalenti. Se le cellule sono state trasfettate con invece versioni fluorescenti proteina marcata della proteina di interesse, ogni proteina avrà una sola etichetta. Tuttavia, ciò richiede trasfezione, che non è sempre desiderabile e potrebbe anche non essere possibile (ad esempio, se si utilizza cellule immunitarie isolate direttamente da sangue umano). Infine, un unico punto FCS non registra le immagini. Se sono immagini per la pubblicazione o per altri scopi, questi devono essere catturate separatamente utilizzando la parte di imaging del software. catturare sempre immagini dopo misurazioni FCS al fine di evitare inutili sbiancamento della superficie cellulare. A differenza di FCS, la microscopia confocale tradizionale a base, come ad esempio FRAP, e le metodologie di correlazione immagine non può quantificare le fluttuazioni di fluorescenzaa livello di singola molecola 6. Metodologie correlazione Immagine misurano il numero di molecole indirettamente e con una risoluzione inferiore, ma possono valutare la variabilità di diffusione molecolare e clustering sull&#39;intera area immagini stampate 25. Standard SPT misurata mediante microscopia confocale ha un livello ideale di etichettatura, ordini di grandezza inferiore rispetto FCS 7. Pertanto, la densità di proteine ​​marcate non può essere misurata dalla norma SPT. La combinazione di SPT con altre tecniche di microscopia (ad esempio, stocastico microscopia ottica ricostruzione o fotoattivazione localizzazione microscopia) permette la densità e il movimento da valutare, ma richiede coloranti molto specializzati o proteine 11. tecniche di Super-risoluzione, come ad esempio i campioni spesso richiedono fisse strutturato illuminazione microscopia e di emissione stimolata esaurita la microscopia, e una combinazione di primaria e anticorpi secondari per labeling 26. La localizzazione è quindi molto precisa, mentre la dinamica del sistema non possono spesso essere valutati. Rispetto a SPT e tecniche di super-risoluzione, FCS richiede anche molto meno potenza di calcolo e tempo per l&#39;analisi e l&#39;estrazione dei risultati. Citometria a flusso è il cavallo di battaglia di Immunologia e può essere favorevolmente combinato con FCS. Cell sorting può, per esempio, essere seguita da successive misure su popolazioni di cellule selezionate se coloranti fotostabili erano stati utilizzati prima della cernita. FCS è quindi una metodologia che può essere utilizzato da solo o in combinazione con altri metodi stabiliti. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare le caratteristiche attualmente sconosciuti della dinamica delle cellule immunitarie e interazioni all&#39;interno della membrana cellulare a livello di singola molecola. Inoltre, le caratteristiche di intere popolazioni contro sottoinsiemi selezionati possono essere confrontati. Essa ha anche un ruolo potenziale come un passo di selezione per la terapia delle cellule immunitarie. Dal momento che le misure fannoNon consumare il cellulare, a differenza di molti altri metodi di analisi della funzionalità delle cellule immunitarie, le singole cellule possono potenzialmente essere recuperati e colto. Così, dopo l&#39;analisi delle curve FCS, cellule promettenti possono essere estratte ed espanse per ulteriori applicazioni, tra cui applicazioni cliniche putativi.

Molte funzioni cellule immunitarie si affidano a diffusione molecolare e interazioni all&#39;interno delle membrane. Membrane biologiche sono complesse, e molti fattori che possono essere importanti per la funzione delle cellule immunitarie possono influenzare la velocità di diffusione traslazionale delle proteine all&#39;interno delle membrane cellulari 1. Abbiamo recentemente dimostrato che le cellule natural killer (NK), i linfociti appartenenti al sistema immunitario innato, mostrano la diffusione differenziale delle due proteine studiate a livello della membrana cellulare a seconda dello stato di attivazione delle cellule NK 2. correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica che è in grado di quantificare le velocità di diffusione molecolare all&#39;interno delle membrane biologiche. Riporta la velocità di diffusione media di fluorescente molecole in un volume fisso, in genere al centro di un microscopio confocale. Si basa sulla misura delle fluttuazioni della fluorescenza che si verificano al movimento molecolareun sistema in stato stazionario. FCS è stato ampiamente utilizzato per studiare la diffusione di coloranti fluorescenti e proteine, sia in soluzione che all&#39;interno delle membrane lipidiche. Altri parametri di output che influenzano la velocità di diffusione può anche essere studiati indirettamente in questo modo (ad esempio, i cambiamenti conformazionali di proteine o interazioni delle molecole sulle membrane delle cellule) 3, 4. FCS distingue rispetto ad altre tecniche grazie alla sua elevata sensibilità, consentendo la possibilità per il rilevamento singola molecola. Funziona bene per concentrazioni molecolari nel nanomolari alla gamma millimolare, che è tipico per livelli di espressione endogeni di maggior parte delle proteine 5. Inoltre, FCS può dare un&#39;approssimazione del numero assoluto delle proteine ​​all&#39;interno del volume studiati, mentre la maggior parte altre tecniche solo dare informazione relativa livelli di espressione della proteina. Altri metodi per misurare i tassi di diffusione molecolare all&#39;interno delle membrane includono fluorecupero rescence dopo photobleaching (FRAP), singola particella di monitoraggio (SPT), multipla pinhole FCS, e di correlazione immagine metodi. FRAP e correlazione immagine metodi sono tecniche di ensemble, che in genere non danno informazioni sul numero assoluto di molecole 10. Rispetto al SPT, il throughput di FCS è maggiore per quanto riguarda caratterizzare la media della popolazione. L&#39;analisi è anche meno impegnativa in quanto il tasso medio di diffusione delle molecole presenti nel fuoco del laser viene misurata, piuttosto che il tasso di singole molecole. Inoltre, a meno microscopi specializzati sono disponibili 11, SPT non può fornire alcuna informazione circa concentrazioni, poiché etichettatura serie SPT deve essere molto bassa per consentire l&#39;identificazione di molecole singole. D&#39;altra parte, FCS richiede le molecole sotto studio per essere mobili. E &#39;semplicemente non rilevare eventuali frazioni immobile putativi o molecole si muovono molto lentamente. La velocità di diffusione delle molecole cherisiede nel fuoco più di circa un decimo del tempo di acquisizione non verrà rappresentata correttamente misurazioni FCS 3, 12. Pertanto, coefficienti di diffusione registrati da FCS tendono ad essere più veloce di velocità di diffusione riportati da tecniche come FRAP e SPT, dove le frazioni close-to-immobile e molto lenti sono presi in considerazione pure. SPT darà anche una descrizione più dettagliata della variabilità dei tassi di diffusione nella popolazione molecolare di FCS sarà. FCS quantifica la fluttuazione di intensità di fluorescenza nel tempo all&#39;interno del volume eccitato. Nel caso di misure di membrana, questo si traduce in zona illuminata della membrana. In questo lavoro, utilizziamo il fatto che tali fluttuazioni sono indotti da molecole espongono diffusione browniano e si muovono quindi in e fuori del volume di eccitazione. Ci sono anche diverse altre possibili fonti per il fluctuazioni nel segnale di fluorescenza, come lampeggiante o la presenza di uno stato di tripletto nei fluorofori, effetti ambientali, vincolante unbinding del ligando, o movimento di tutta la membrana cellulare. Queste fonti di errore putativi devono essere presi in considerazione quando si progetta un esperimento FCS al fine di interpretare con precisione i risultati di 12, 13. In genere, i tassi di diffusione laterale nelle membrane biologiche sono bassi a causa di affollamento e le interazioni, sia tra proteine ​​di membrana e tra le proteine ​​e il citoscheletro. Storicamente, l&#39;uso di FCS in membrane è pertanto stata ostacolata dalla mancanza di fluorofori fotostabili, che sono necessari per evitare sbiancamento durante i tempi di transito estesi attraverso la messa a fuoco di eccitazione 14. Tuttavia, oggi, ci sono molte opzioni per adatti coloranti foto-stabile. Miglioramenti significativi nella rilevatori e altro hardware consentono anche l&#39;individuazione di prote fluorescenteins e coloranti di luminosità inferiore. Qui, un protocollo di base per l&#39;applicazione di FCS utilizzando linfociti primari murini, dove la proteina di interesse è etichettato con una fluorescente contrassegnati anticorpi, è descritto. Un approccio per adattarsi alle curve di autocorrelazione per estrarre il coefficiente di diffusione e la densità molecolare è anche mostrato. Il protocollo si propone di essere facilmente seguita da immunologi con nessuna esperienza precedente di tecniche per studiare la diffusione delle molecole. Tuttavia, si prevede una conoscenza di base di microscopia confocale (per ottenere questa conoscenza di base, vedi riferimento 15). Questo protocollo può abbastanza facilmente essere adattato ad altre cellule in sospensione, entrambe le linee cellulari e cellule primarie. Per gli utenti più esperti FCS, esistono più raffinati metodi di analisi, alcuni dei quali sono descritti nella discussione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1206">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td>
			<td style="width:367px;">Miltenyi Biotec NordenAB</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:337px;">Negative selection of NK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Adlrich</td>
			<td style="width:181px;">F7524</td>
			<td style="width:337px;">Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:367px;">-</td>
			<td style="width:181px;">-</td>
			<td style="width:337px;">Made in house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td>
			<td style="width:367px;">PAA The Cell Culture Company&#160;</td>
			<td style="width:181px;">E15-848</td>
			<td style="width:337px;">Transparent medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Antibody clone 2.4G2</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:181px;">553140</td>
			<td style="width:337px;">For blocking Fc-receptors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-Ly49A antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone JR9.318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-H-2Dd antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;">BD Pharmingen</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">558915</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Conjugated in house to MFP488</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone 34.5.8S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">MFP488</td>
			<td style="width:367px;">Mobiotech</td>
			<td style="width:181px;">MFP-A2181</td>
			<td style="width:337px;">Fluorescent dye for antibody conjugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in distilled water (1.10)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:321px;">Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td>
			<td style="width:367px;">SuSoS AG</td>
			<td style="width:181px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Rhodamine 110 chloride</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">432202</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 3.3 &#215; 10&#8722;10 m2/s 19</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Alexa fluor 647</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">A20006</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 4.4 &#215; 10&#8722;10 m2/s 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;">LSM510</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Confocor 3</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Matlab with curve fitting toolbox</td>
			<td style="width:367px;">Matlab</td>
			<td style="width:181px;">Version R2013b</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:367px;">Thermo-scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">155411</td>
			<td style="width:337px;">8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

correlazione spettroscopia di fluorescenza (FCS) è una tecnica potente per studiare la diffusione delle molecole all&#39;interno delle membrane biologiche con elevata risoluzione spaziale e temporale. FCS può quantificare la concentrazione e diffusione molecolare coefficiente di molecole marcate fluorescenza nella membrana cellulare. Questa tecnica ha la capacità di esplorare le caratteristiche di diffusione molecolare delle molecole nella membrana plasmatica di cellule immunitarie in stato stazionario (cioè, senza processi che influenzano il risultato durante il tempo di misurazione effettiva). FCS è adatto per studiare la diffusione di proteine ​​che vengono espresse a livelli tipici per proteine ​​più endogene. Qui, un metodo semplice e robusto per determinare la velocità di diffusione delle proteine ​​di membrana cellulare sui linfociti primari è dimostrata. Un modo efficace per eseguire misure su cellule vive colorate con anticorpo e osservazioni comuni che si verificano dopo l&#39;acquisizione sono descritti. I progressi recentinello sviluppo di coloranti fluorescenti fotostabili può essere utilizzato coniugando anticorpi di interesse appropriarsi coloranti che non candeggiare ampiamente durante le misurazioni. Inoltre, questo permette la rilevazione di entità diffondenti lentamente, che è una caratteristica comune di proteine ​​espresse nelle membrane cellulari. La procedura di analisi per estrarre i parametri di concentrazione e di diffusione molecolare dalle curve di autocorrelazione generate viene evidenziato. In sintesi, viene fornito un protocollo di base per misurazioni FCS; può essere seguito da immunologi con una comprensione della microscopia confocale ma nessun&#39;altra esperienza precedente di tecniche per la misurazione di parametri dinamici, come i tassi di diffusione molecolare.

Un tipico risultato genera una curva di autocorrelazione con un tempo di transito nella gamma da 10 msec a 400 msec per le proteine ​​di membrana. Il numero di molecole può variare tra 0,5 e circa 200 per micron 2 per proteine endogenamente espressi. Controllare attentamente che il CPM non è inferiore al previsto. Questo può significare che vi è una influenza del segnale di fondo. Come regola generale, il segnale CPM sulle cellule che viene accettato per analisi non deve essere inferiore al 33% del CPM per diffondere liberamente anticorpi a parità di potenza del laser. Il CPM dovrebbe scalare linearmente con la potenza del laser. La curva di autocorrelazione per immunitarie recettori di superficie delle cellule primario dovrebbe essere liscia, con la parte più ripida tra il 0,001 e 1 sec. Vedere la Figura 2 per una curva di autocorrelazione rappresentativa e la sua traccia del tempo. Come accennato nell&#39;introduzione, lare sono diversi casi in cui FCS non è adatto per la misura di diffusione molecolare a causa dell&#39;influenza di altre fonti di fluttuazioni di fluorescenza, che contribuiscono a confondere il segnale. La figura 3 mostra esempi di casi in cui un particolare ripetizione cellula o di misura deve essere eliminata. Si è già detto che un segnale estremamente bassa (molto basso CPM) è motivo di scartare la cella. Un&#39;altra ragione per scartare la singola cella è che la cellula è in movimento (Figura 3A). Nel caso di sbianca (Figura 3B) o se grandi cluster sono presenti (Figura 3C), le misurazioni devono essere scartati se l&#39;effetto è notevole o presente in tutta la misura. Se questa funzione è presente solo in uno o due ripetizioni, queste singole ripetizioni possono essere scartati, ma le ripetizioni restanti possono essere ancora utilizzati. E &#39;importante sia per utilizzare il correttomodello per adattare i dati e anche di controllare con attenzione che la misura si sovrappone a stretto contatto con la curva di autocorrelazione. Nella Figura 4, vengono mostrati esempi di buoni e cattivi si adatta curva. Prestare particolare attenzione alla parte della curva che rappresenta diffusione (la parte più forte pendenza). E &#39;anche importante accertarsi che sia l&#39;inizio e la fine della parte inclinata della curva sono ben montati dal modello. Se l&#39;adattamento è male, senza problemi apparenti, come movimento, candeggio, o cluster, modificare i valori di partenza e / o dei limiti superiori e inferiori (in un intervallo ragionevole) prima di prendere una decisione finale di scartare il cellulare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> Figura 1: interfaccia software FCS. visualizzati sono le principali finestre necessarie per operare il software per l&#39;acquisizione FCS e di imaging, come descritto nel protocollo. Finestra A, &quot;Configurazione Control &quot;finestra è la finestra di controllo per il percorso del fascio, i canali laser e filtri per l&#39;imaging. finestra B è la&quot; Scan Control &quot;finestra per l&#39;imaging e mostra le impostazioni di scansione. Finestra C è la&quot; finestra di misurazione &quot;, la finestra per la configurazione delle impostazioni di misura FCS. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> Figura 2: traccia Rappresentante e autocorrelazione curve di diffusione H-2D d classe maggiore di istocompatibilità mi superficie molecole nelle cellule NK fresco isolato murini. Il pannello superiore della figura mostra la fluttuazione di fluorescenza in funzione del tempo durante tutto il tempo della traccia 7x 10 misurazioni sec. Il pannello inferiore rappresentanos la curva autocorrelazione media da questi sette ripetizioni. L&#39;altezza della curva di autocorrelazione è inversamente proporzionale alla concentrazione di fluorescenza cellulare marcata H-2D d entità all&#39;interno del volume focale. Il valore di x in corrispondenza della parte più ripida della pendenza della curva, la metà dell&#39;ampiezza, rappresenta il tempo medio di permanenza di fluorescente H-2D d molecole all&#39;interno del volume focale. La misura è presentato un parte del set di dati pubblicati nel riferimento 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> Figura 3: Esempi di tracce cellulari problematici. (A) Una cella in movimento, come esemplificato dalla traccia non avendo una stabile basale level. Il pannello superiore mostra un esempio in cui tutta la cella è spostato fuori fuoco dopo circa 35 sec, come rappresentato dal segnale molto bassa dopo questo punto di tempo. Nel pannello inferiore, l&#39;effetto è più sottile, con ondulazioni apparenti ad un intervallo di alcuni secondi. (B) Cell visualizzazione sbianca, l&#39;altezza della traccia diminuisce con il tempo. Confrontare l&#39;altezza della traccia all&#39;inizio di misurazione che al termine della misurazione. (C) La presenza di grandi cluster, rappresentata da picchi nella traccia. Nel pannello superiore, una grande cluster a 20-25 sec è presente. Nel pannello inferiore, diversi cluster sono presenti in tutta la misura. Le misure presentate sono una parte del set di dati pubblicati nel riferimento 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 4: curve di autocorrelazione rappresentativi con curva-montaggio e residui. Le linee verticali rosse e blu rappresentano i limiti della finestra temporale utilizzata per il montaggio. (A) Esempio di una forma rappresentativa di un modello di diffusione 2-dimensionale a una curva campione autocorrelazione. Nel pannello superiore, la curva verde (modello) si sovrappone alla curva blu (autocorrelazione acquisita), indicando una buona misura. Il pannello inferiore mostra la residua dalla curva raccordo. Le fluttuazioni circa 1 sec, che non sono dotati bene, sono tipici per le misure di celle e sono tollerabili. (B) Esempio di un cattivo adattamento di diffusione 2-dimensionale per la stessa curva autocorrelazione. Il modello adattato non si sovrapponga alla curva di autocorrelazione, e non converge a 1. I pannelli inferiori (A e B) mostrano i residui dalla curva raccordo. I residuisono significativamente più grandi per il cattivo misura, in particolare per la parte diffusione della curva. La misura è presentato un parte del set di dati pubblicati nel riferimento 2. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Diffusione molecolare nelle membrane plasmatiche dei linfociti primari misurata mediante spettroscopia di correlazione della fluorescenza | Immunologia e infezione | Video

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Diffusione molecolare nel plasma membrane dei linfociti primari misurati da Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

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Nanyang Technological University

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10.8K Views.  Karolinska Institutet. A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Video: Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

Migrazione phagosome e velocità misurata in Live primarie macrofagi umani infettati con HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...