Biz Zeiss Confocor 3 aracın bakımı için ve hücre ölçümleri konusunda yararlı ipuçları Dr. Vladana Vukojeviç, Moleküler Tıp Merkezi, Karolinska Enstitüsünde teşekkür ederim. Bu çalışmada, Magnus Bergvalls Stiftelse ve Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond gelen Vetenskapsrådet hibe (1629 hibe sayısı 2012-) tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes:+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model.">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li><li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells.">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein/lipid+interactions.">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li><li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy+in+vivo.">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li><li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caught+in+the+act:+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells.">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li><li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+progress+in+single+particle+tracking:+from+methods+to+biophysical+insights.">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).</li><li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+correlation+spectroscopy:+principles+and+applications.">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li><li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImFCS:+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization.">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li><li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F-techniques:+advances+in+receptor+protein+studies.">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+principles+and+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li><li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+novel+variations+of+an+established+technique.">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li><li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities.">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li><li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells.">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li><li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy.">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li><li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li><li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li><li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes.">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li><li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+of+Triplet-States+in+Solution+-+a+Theoretical+and+Experimental-Study.">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li><li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li><li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II:+application+to+simulated+and+in+vitro+data.">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li><li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li><li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+(mICS).">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435 (2016).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

FCS Bu protokol bağışıklık hücrelerinin (murin, insan ya da diğer türlerin) her türlü yüzey moleküllerinin moleküler dinamiklerini değerlendirilmesi için de kullanılabilir. aşağı canlı hücrelerde tek-molekül çözünürlüğü FCS önlemler uzay-zamansal moleküler dinamik. Moleküler yoğunluğu, hem de ilgi konusu olan proteinlerin difüzyon hızı ve kümelenme dinamiği, otomatik korelasyon eğrisi elde edilebilir. floresan etiketleme başarılı FCS deneyler için önemli hususlardan biridir. Hücre zarı üzerinde ilgi konusu proteinleri geleneksel antikorlar kullanılarak etiketlendi ve antikorlar genellikle saf bağışıklık hücrelerinde yüzey proteinleri üzerinde kullanım için en uygun olan. İşaretlenmemiş antikorlar doğrudan yüksek molekül parlaklık ile foto stabil floresan boyalar konjuge edilebilir olmalıdır. Antikor bağlanması için florofor seçimi ölçümleri kalitesi için çok önemlidir. Akış sitometrisi için standart etiketler,Bu floresan ve fikoeritrin bazlı boyalar gibi, bağlı olarak hızlı bir ağartma tavsiye edilmez. antikorlar doğrudan konjugasyon için foto stabil boyalar şu anda birkaç firma tarafından sağlanmaktadır. üreticileri genellikle, konjugasyon ve elde edilen konjüge edilmiş antikor saflaştırılması için tatmin edici bir protokolleri sağlar ve bu bir kaç saat içinde yapılabilir. Floresan proteinleri kullanarak FCS gerçekleştirmek de mümkündür, ancak floresan proteinleri çoğu foto stabil kimyasal fluorophores daha beyazlatma genel daha eğilimli olan beri özel bakım, lazer gücü en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Önceki deneyimine göre, aşırı ifadesi proteinin genellikle floresan proteinleri kullanımı uygun hale bağlı sıkışıklığı difüzyon oranında önemli bir azalmaya yol açar. ölçümlere önce iğne deliği kalibrasyon da kritik bir adımdır. fokal hacminin büyüklüğünü belirlemek için kullanılan fluorophores difüzyon katsayısı bilinen olmalıS (Denklem 2). odak hacmi boyutunu belirlemek için antikor etiket emisyon spektrumları yakından tekabül eden serbest fluorophores kullanın. Bu optimal sinyal verimliliği ve renk kanalları arasındaki potansiyel çapraz korelasyon doğru algılanmasını sağlamak için yapılmalıdır. Sistem güçlerin aralığında beklenen çıkış sinyali verir emin olmak için serbestçe difüzyon fluorophores bir FCS lazer güç dizi gerçekleştirmek. deneyler arasında tutarlılığı sağlamak için deneyler arasında aynı lazer gücünde CPM karşılaştırın. Analiz aşamasında, modellerin montaj sırasında değişkenler için makul aralıkları ve başlangıç ​​değerlerini koymak esastır. iyi bir başlangıç ​​noktalarını bulmak için benzer hücre sistemlerinden daha önce yayınlanmış bilgiyi kullanın. Teorik olarak, FCS bir nicel tekniktir, ancak optimum koşullar nadiren meydana beri, dikkatli belirli bir ölçüde sonuçlarını yorumlarken alınmalıdır. dalgalanmalar her türlü kaydedilecektir,ne olursa olsun bu tür dalgalanmalar kökenli. Nedenle, olası hata kaynaklarını dışlamak amacıyla deneysel sistemi ile ilgili mümkün olduğunca çok bilgi sahibi olmak yararlıdır. Çözelti içinde serbest fluorophores olası kirletici en az on kat daha kısa TauD diffüz oysa Örneğin, tüm hücre zarı hareketi, artık TauD (Şekil 3A) dalgalanmalara sebep olur. Bu basit protokol çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. iki protein farklı fluorophores etiketli ise, eş-difüzyon (etkileşim dolaylı bir ölçütüdür) çapraz korelasyon tespit metodoloji genişleterek değerlendirilebilir. Bu proteinler, hücre zarındaki birbirine bağlanan ne ölçüde tek tek renk kanallarının otomatik korelasyon eğrisi yüksekliğine çapraz-korelasyon eğrisi yüksekliğinden ile temsil edilmektedir. Çapraz korelasyon ölçüm yazılımı Ch1-Ch2 olarak gösterilir. öncedenÇapraz korelasyon verirlerse analizi çapraz konuşmak için kontroller gerektirir ve böylece biraz daha karmaşık Burada sunulan protokolü daha fazladır. Bu temel protokol bir uzantısı olarak, devam etmek için nasıl ayrıntılı bir tarifi, Strömqvist ve ark bulunabilir. 13. Z-yönünde konumlandırma optimize etmek için, Z-tarama FCS 22 kullanılabilir. Bir önceki deneyimlerine göre, elle bunu yapmak için yeterli olmuştur. Bir FCS otokorelasyon eğrisi 23 için birden fazla difüzyon katsayıları uygun şekilde de mümkündür. Bu, farklı difüzyon oranları ve alt popülasyonlarının en az birinin yaklaşık difüzyon oranlarının alt popülasyonlarının sayısının önceki bilgi gerektirmektedir. Aksi takdirde, uydurma güvenilmez hale getirecek pek çok serbest değişkenler olacaktır. Tipik bir örnek, difüzyon hızı, önemli ölçüde bir ligandın bağlanma yavaşlatılır bir yüzey proteini olacaktır. Son olarak, arıtma btamamen çıkarmadan tekrarlar olmadan aykırı izini ng 24 mümkündür. Bir floresan sinyal eksikliği gidermek için ortak bir sorundur. serbestçe fluorophores difüzyon için açılan floresan olup olmadığını kontrol etmek için halojen lamba kullanın. damla floresan değilse, (nM aralığında) hafif bir artış konsantrasyon ile fluorophores yeni bir toplu karıştırmak ve yeniden deneyin. Odak floresan damla içinde, lazerler yazılımda açık olduğundan emin olunuz, lazer gücü yeterlidir, (adıma bakın, doğru emisyon filtreleri ve dedektörler seçilir ve &quot;FCS Ölçme&quot; penceresinde sağ kanallar aktive edilir 3.6). lazer başlatın ve görsel lazer ışık örneği ulaştığı teyit tarafa bakmak. düz lazer kaynağına bakarak kaçının. Seçilen emisyon filtresi lazer dalga boyu kapsar ise, deklanşör otomatik olarak dedektöre zarar vermemek için ışık yolunu bloke eder. benf tüm ayarlar gayet iyi ama hiçbir ışık, geldiğinde lazerler, FCS sistemi ve bilgisayarı yeniden başlatın. Bir floresan sinyal eksikliği devam ederse bir uzmana danışın. etiketli hücreleri floresan görüntüler yoksa basitleştirilmiş prosedür uygulanır. halojen lamba ile floresan varlığını doğrulamak; , Lazerler açmak lazer kanalları seçmek ve lazer gücünü ayarlamak. ya &quot;Crosshair&quot; ya da &quot;pozisyonunu Ekle&quot; seçeneği (adım 6.4) kullanılarak, hücre zarı üzerinde bir pozisyon seçin. Sinyal hala çok düşükse sonraki numune geçin. tekniğin dalgalanma bazında önemli özelliklerinden biri molekülleri tespit edilmesi oldukça hareketli olmak zorunda olmasıdır. Çok yavaş moleküller veya tüm ölçüm süresi boyunca odak daha küçük alanlarda sıkışıp moleküllerin kesirler hareketli nedenle ölçülen olamaz. Bu yüzey yoğunlukları olası bir küçümsenmesi ve difüzyon oranının fazla tahmin edilmesine yol açar. ağartmamoleküller, lazer ışıklı odak hacmi harcama daha uzun ağartılan bir ihtimali daha yüksek olacağından, aynı zamanda, yoğunluk ve TauD her ikisinin bir varsayımsal düşük tahmin katkıda bulunabilir. arka plan (odak düzlemi dışında floresan gibi) etkisi, diğer taraftan, yapay tespit moleküllerinin sayısını artırmak ve ölçülen CPM azalacaktır. Daha önce, mutlak yoğunluk tayini toplam maksimum hata% 40 civarında 20 olarak tahmin edilmiştir. hata kaynakları, çoğu durumda, deneyler boyunca eşit Bununla birlikte, birbirine farklı biyolojik numune karşılaştırma genellikle mümkündür. Bir başka potansiyel hata kaynağı antikorları her bir antikorun potansiyel iki hedef moleküllere bağlanabilir, yani iki değerli olmasıdır. Yazarlar, bu olgu gözlenmemiştir, fakat bu, diğer antikorlar için genel bir özellik olduğunu garanti edilemez. iki değerlikli potansiyel etkisi gerekirBu nedenle, her bir antikor için tek tek test edilmesi. Belirli birincil ve ikincil etiketli antikorların kombinasyonu nedeniyle iki ardışık iki değerlikli etiketlerden yapay kümelerin uyaran riskinin yüksek kesinlikle kullanılmamalıdır. Hücreler bunun yerine ilgili proteinin floresan protein etiketli versiyonları ile transfekte edilmiş ise, her bir protein, sadece bir etiket olacaktır. Bununla birlikte, bu durum her zaman arzu edilmez ve hatta mümkün olmayabilecek, transfeksiyon gerektirir (ör doğrudan insan kanından izole immün hücreleri kullanılıyorsa). Son olarak, tek-nokta FCS görüntüleri yazmaz. görüntüleri yayın veya başka amaçlar için gerekli ise, bu yazılımın görüntüleme bölümünü kullanarak ayrı ayrı ele alınmalıdır. Her zaman hücre yüzeyinde gereksiz ağartma önlemek için FCS ölçümler sonrası görüntüleri yakalayabilir. FCS, örneğin FRAP gibi geleneksel konfokal tabanlı mikroskopi, ve görüntü korelasyon metodolojileri aksine floresan dalgalanmaları ölçmek olamaztek-molekül düzeyinde 6&#39;da. Görüntü korelasyon metodolojileri dolaylı ve daha düşük çözünürlüğe sahip moleküllerin sayısını ölçmek, ama onlar tüm görüntülenen alanda 25&#39;in üzerinde moleküler difüzyon ve kümelenme değişkenliği değerlendirmek. Konfokal mikroskopi ile ölçülen standart SPT, FCS 7 daha düşük büyüklük sıralaması etiketleme ideal seviyesine sahiptir. Bu nedenle, etiketlenmiş protein yoğunluğu, standart SPE tarafından ölçülemez. Diğer mikroskopi teknikleri ile SPT kombinasyonu (örneğin, stokastik optik yeniden mikroskopi veya fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskopisi) yoğunluk ve hareket değerlendirilecektir sağlar, ancak çok özel boyalar veya proteinler 11 gerektirir. Böyle, aydınlatma mikroskopi yapılandırılmış ve emisyon mikroskobu tükenmiş uyarılmış sık sık gerektirir sabit örnekler ve birincil bir kombinasyonu ve labelin için ikincil antikorlar gibi süper çözünürlüklü teknikleri,g 26. Sistemin dinamikleri genellikle değerlendirilemez ise yerelleştirme, bu nedenle çok hassas. SPT ve süper çözünürlük teknikleri ile karşılaştırıldığında, FCS, aynı zamanda analiz ve sonuçlar çıkarılması için önemli ölçüde daha az bir bilgisayar gücü ve zaman gerektirir. Flow sitometri immünoloji beygir ve olumlu FCS ile kombine edilebilir. verilmedi-kararlı boyalar sıralama önce kullanılmış olsaydı hücre sıralama, örneğin, seçilen hücre popülasyonları üzerinde müteakip bir ölçüm ile takip edilebilir. FCS ve böylece diğer yerleşik yöntemler tek başına ya da kombinasyon halinde kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu protokol tek-molekül düzeyinde hücre zarı içinde bağışıklık hücre dinamikleri ve etkileşimleri halen bilinmeyen özelliklerini tanımlamak için kullanılabilir. Ayrıca, seçilen alt kümeleri karşı bütün nüfus özellikleri mukayese edilebilir. Aynı zamanda, bağışıklık hücresi terapisi için bir seçme adımı olarak potansiyel bir role sahiptir. Ölçümler yapmak beriİmmün hücrelerin özelliğe araştırmak için çoğu diğer yöntemlerin aksine, tek tek hücreler, potansiyel olarak geri kazanılır ve kültüre edilebilir hücre tüketir. Böylece, FCS eğrilerinin analizinden sonra, gelecek vaat eden hücreler elde edilebilir ve varsayılan klinik uygulamalar da dahil olmak üzere ek uygulamalar için genişletilmiş.

Birçok bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını moleküler difüzyon ve zarlar içinde etkileşimler güveniyor. Biyolojik zarlar karmaşıktır ve hücre membranları 1 içindeki proteinlerin geçiş yayılma hızını etkileyebilir immün hücrelerin fonksiyonu için önemli olabilir birçok faktör. Son zamanlarda, doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait, doğal öldürücü (NK) hücreler, lenfosit, NK hücreleri 2 durumuna bağlı olarak, hücre zarı iki çalışılan protein ayırıcı difüzyon sergilediklerini göstermiştir. Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), biyolojik zarlar içinde moleküler difüzyon oranları miktarının kapasitesine sahip bir tekniktir. Bu floresan sabit hacimde molekülleri etiketli ortalama difüzyon oranı, bir konfokal mikroskop tipik odak bildirir. Bu moleküler hareketi üzerine ortaya floresan dalgalanmaların ölçülmesine dayanırkararlı halde bir sistem. FCS yaygın çözelti içinde ve lipid zarlar içinde hem de floresan boyalar ve proteinlerin difüzyon incelemek için kullanılmıştır. Difüzyon hızını etkileyen diğer çıkış parametreleri de dolaylı olarak, bu şekilde incelenebilir (örneğin, protein ya da hücre membranları üzerinde moleküllerinin etkileşimleri konformasyonel değişiklikler) 3, 4. FCS tek-molekül tespiti için olasılığını sağlayan yüksek duyarlılığı nedeniyle diğer tekniklerle karşılaştırıldığında göze çarpıyor. Bu, çoğu proteinin 5 &#39;nın endojen ekspresyonunun seviyeleri tipik milimolar aralığına nanomolar, moleküler konsantrasyonları için çalışır. çoğu diğer teknikler sadece protein ekspresyon düzeyleri hakkında nispi bilgi verirken Ayrıca, FCS, çalışılan hacmi içindeki proteinlerin mutlak sayısının bir yaklaşım verebilir. membranlar fluo dahil olan diğer yöntemler moleküler difüzyon oranlarını ölçmek için(Sıkı bağlamak) photobleaching sonra rescence kurtarma, tek parçacık izleme (SPT), çoklu iğne deliği FCS ve görüntü korelasyon yöntemleri. Sıkı bağlamak ve görüntü korelasyon yöntemleri genellikle moleküllerin 10 mutlak sayısı hakkında bilgi vermeyin topluluk teknikleri vardır. SPT ile karşılaştırıldığında, FCS verimi nüfusun ortalama karakterize açısından yüksektir. lazer odak içinde mevcut moleküllerin ortalama difüzyon oranı oldukça tek moleküllerin oranından daha ölçülür çünkü analizi de daha az talep ediyor. Özel mikroskoplar 11 mevcut değilse, standart SPT etiketleme tek moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlamak için çok düşük olması gerektiğinden Ayrıca, SPT, konsantrasyonları hakkında herhangi bir bilgi veremem. Öte yandan, FCS çalışılan moleküller mobil olmasını gerektirir. Bu sadece çok yavaş hareket eden herhangi bir farazi hareketsiz kesirleri veya molekülleri tespit olmayacaktır. moleküllerin difüzyon oranı ouzun edinimi süresi yaklaşık onda biri doğru FCS ölçümlerinin 3, 12 temsil olmayacak daha odak içinde bulunur. Bu nedenle, FCS tarafından kaydedilen difüzyon katsayıları to-hareketsiz-yakın ve çok yavaş fraksiyonlar yanı sıra dikkate alınır FRAP ve SPT gibi tekniklerden rapor difüzyon oranlarından daha hızlı olma eğilimindedir. SPT da olacak FCS daha moleküler nüfus içerisindeki difüzyon oranlarının değişkenliği daha ayrıntılı bir açıklama verecektir. FCS heyecanlı hacmi içinde zamanla floresan dalgalanma rakamlarla. Membran ölçümleri durumunda, bu zarın aydınlatılmış bölgeye çevirir. Bu yazıda, bu tür dalgalanmalar Brown difüzyon sergileyen molekülleri tarafından uyarılan ve böylece ve uyarma hacminin dışında hareket gerçeğini kullanmaktadır. fluctua için birkaç olası kaynak vardırBu tür bağlayıcı unbinding tüm hücre zarı ligandı ya da hareket, yanıp sönen veya flüoroforlar, çevresel etkiler bir triplet halinin varlığı olarak floresans sinyalinde yonlar. Bu farazi hata kaynakları sonuçları doğru 12, 13 yorumlamak amacıyla bir FCS deney tasarımı dikkate alınması gerekir. Tipik olarak, biyolojik zarların yanal difüzyon oranları zar proteinleri arasında proteinler ve hücre iskeletinin arasında hem kalabalık ve etkileşimleri nedeniyle düşüktür. Tarihsel, zarlarında FCS kullanımı dolayısıyla uyarma odak 14 boyunca uzatılmış geçiş zamanlarında ağartma önlemek için gerekli olan foto stabil fluorophores, eksikliği engel olmuştur. Ancak, bugün, uygun foto stabil boyalar için pek çok seçenek vardır. detektör ve diğer donanım önemli gelişmeler de floresan prote algılanmasına izinins ve alt parlaklık boyalar. Burada, antikor etiketli ilgili protein flüoresan ile etiketlenmiş olan fare primer lenfositleri kullanılarak FCS uygulama için temel protokol, tarif edilmektedir. difüzyon katsayısı ve moleküler yoğunluğu elde etmek için otokorelasyon eğrileri uygun bir yaklaşım da gösterilmiştir. protokol kolayca moleküllerin difüzyon çalışması için teknikler daha önce hiç deneyimi olan immünolojistler tarafından takip ediliyor amaçlamaktadır. Ancak, konfokal mikroskopi temel bir anlayış beklenmektedir (referans 15&#39;e bakın, bu temel anlayış kazanmak için). Bu protokol, nispeten kolay bir şekilde, diğer süspansiyon hücreleri hücre hatları ve primer hücreler hem de adapte edilebilir. Daha tecrübeli FCS kullanıcılar için, daha rafine analiz yöntemleri olan bazı tartışmalar anlatılmıştır, mevcuttur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1206">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">MACS NK Cell Isolation Kit mouse II</td>
			<td style="width:367px;">Miltenyi Biotec NordenAB</td>
			<td style="width:181px;">130-096-892</td>
			<td style="width:337px;">Negative selection of NK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Adlrich</td>
			<td style="width:181px;">F7524</td>
			<td style="width:337px;">Heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:367px;">-</td>
			<td style="width:181px;">-</td>
			<td style="width:337px;">Made in house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Roswell Park Memorial Institute medium 1640</td>
			<td style="width:367px;">PAA The Cell Culture Company&#160;</td>
			<td style="width:181px;">E15-848</td>
			<td style="width:337px;">Transparent medium</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Antibody clone 2.4G2</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fischer Scientific</td>
			<td style="width:181px;">553140</td>
			<td style="width:337px;">For blocking Fc-receptors.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-Ly49A antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone JR9.318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Anti-H-2Dd antibody&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:367px;">BD Pharmingen</td>
			<td rowspan="2" style="width:181px;">558915</td>
			<td rowspan="2" style="width:337px;">Conjugated in house to MFP488</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Clone 34.5.8S</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">MFP488</td>
			<td style="width:367px;">Mobiotech</td>
			<td style="width:181px;">MFP-A2181</td>
			<td style="width:337px;">Fluorescent dye for antibody conjugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">P8920</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in distilled water (1.10)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:321px;">Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)</td>
			<td style="width:367px;">SuSoS AG</td>
			<td style="width:181px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)</td>
			<td style="width:337px;">Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Rhodamine 110 chloride</td>
			<td style="width:367px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">432202</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 3.3 &#215; 10&#8722;10 m2/s 19</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:321px;">Alexa fluor 647</td>
			<td style="width:367px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">A20006</td>
			<td style="width:337px;">Known diffusion coefficient: 4.4 &#215; 10&#8722;10 m2/s 20</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;">LSM510</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Confocor 3</td>
			<td style="width:367px;">Zeiss</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Software: Matlab with curve fitting toolbox</td>
			<td style="width:367px;">Matlab</td>
			<td style="width:181px;">Version R2013b</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:321px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:367px;">Thermo-scientific&#160;</td>
			<td style="width:181px;">155411</td>
			<td style="width:337px;">8 wells, 1.0 borosilicate bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular diffusion in plasma membranes of primary lymphocytes measured by fluorescence correlation spectroscopy

Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik membranların içindeki moleküllerin difüzyon çalışmak için güçlü bir tekniktir. FCS hücre zarındaki floresan etiketli moleküllerin moleküler konsantrasyon ve difüzyon katsayısının ölçmek olabilir. Bu teknik, (gerçek ölçüm süresi boyunca sonucu etkileyen işlemleri olmadan IE) sürekli halde bağışıklık hücrelerinin plazma membranında moleküllerin moleküler difüzyon karakteristiklerini yeteneğine sahiptir. FCS çok endojen proteinler için tipik bir seviyede ifade edilen proteinleri difüzyonunu çalışmak için uygundur. Burada, birincil lenfositleri üzerinde hücre zarı proteinlerinin difüzyon oranını belirlemek için basit ve sağlam bir yöntem olduğunu göstermiştir. antikor lekeli canlı hücreler ve kazanılmasından sonra sık görülen gözlemlere ölçümleri gerçekleştirmek için etkili bir yoldur açıklanmıştır. son gelişmelerverilmedi-kararlı floresan boyalar geliştirilmesinde ölçümler sırasında yoğun ağartıcı olmayan boyalar, uygun ilgi antikorlar eşleştirilmesiyle kullanılabilir. Buna ek olarak, bu hücre zarlarında ifade edilen proteinlerin genel bir özelliğidir yavaş difüzyon kişiler tespiti için verir. Oluşturulan otokorelasyon eğrileri moleküler konsantrasyon ve difüzyon parametreleri ayıklamak için analiz prosedürü vurgulanır. Özet olarak, FCS ölçümleri için temel protokol sağlanmıştır; o konfokal mikroskopi anlayışı ile ancak böyle moleküler difüzyon oranları gibi dinamik parametrelerini, ölçme teknikleri başka hiçbir önceki deneyimi ile immünolojistler tarafından takip edilebilir.

Tipik bir sonuç membran proteinleri için 400 msn 10 milisaniye aralığındaki bir geçiş süresi olan bir otokorelasyon eğrisi oluşturur. Molekül sayısı, endojen olarak ifade edilen proteinleri yaklaşık 200 mikron 2 başına 0.5 arasında değişebilir. CPM beklenenden daha düşük değildir olduğunu dikkatlice kontrol ediniz. Bu arka plan sinyalinin bir etkisi olduğu anlamına gelebilir. Genel bir kural olarak, analiz için kabul edilir hücreler üzerinde CPM sinyali serbestçe aynı lazer güçte antikorlar difüzyon için CPM daha düşük% 33 olmamalı. CPM lazer gücü ile doğrusal ölçeklendirme gerekir. primer immün hücre yüzeyi reseptörleri için otokorelasyon eğrisi 0.001, 1 saniye arasında dik kısmı düzgün olması beklenmektedir. Temsili bir otokorelasyon eğrisi ve zaman iz için Şekil 2&#39;ye bakınız. Giriş bölümünde kısaca bahsedildiği gibi,Re FCS bağlı sinyal karıştırıcı katkı flüoresan iniş-çıkışları, diğer kaynaklardan, etkisi moleküler difüzyon ölçmek için uygun değildir birçok durumlardır. Şekil 3, özel bir hücre veya ölçüm tekrar atılmalıdır olduğu durumların örnekleri gösterilmektedir. Zaten son derece düşük sinyal (çok düşük CPM) hücre atılması için neden olduğu dile getirilmiştir. Tek bir hücre atılması için bir başka neden hücresi (Şekil 3A) hareket olmasıdır. Etkisinin tüm ölçüm boyunca kayda değer ya da mevcutsa ağartma durumunda (Şekil 3B) veya büyük kümeler varsa (Şekil 3C) ölçümler atılmalıdır. Bu özellik, bir ya da iki tekrarı sadece mevcut ise, bu tek tek tekrarlar atılabilir, ancak geri kalan tekrarlar de kullanılabilir. her ikisi de doğru kullanımı önemlidirModel veri sığdırmak için ve ayrıca uygun yakından otokorelasyon eğrisi ile örtüşür dikkatlice kontrol edin. Şekil 4&#39;te, iyi ve kötü eğri uyan örnekler gösterilmektedir. eğri temsil eden difüzyon (en dik eğimli kısım) bir parçası çok dikkat edin. Başlangıç ​​ve eğrinin eğimli bölümünün son iki model tarafından iyi donatılmış olduğunu tespit etmek de önemlidir. uyum gibi hücre atmak için nihai bir karar vermeden önce başlangıç ​​değerleri ve / veya (makul bir aralık içinde) üst ve alt sınırları değiştirmek, hareketli, ağartma, ya da kümeler olarak belirgin sorunsuz, kötü ise. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig1.jpg" /> Şekil 1: FCS yazılım arayüzü. protokol açıklandığı gibi burada gösterilen FCS edinimi ve görüntüleme için yazılım aracı çalıştırmak için gerekli ana pencere vardır. Pencere A, &quot;Yapılandırma Control &quot;pencere görüntüleme için ışın yolu, lazer kanalları ve filtreler için kontrol penceredir. Pencere B&quot; Tarama Kontrolü &quot;Tarama ayarları görüntüleme için pencere ve gösterir. Pencere C&quot; Ölçme &quot;penceresi, pencere FCS ölçüm ayarlarının kurulum. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54756/54756fig2.jpg" /> Şekil 2: H-2B d major histokompatibilite sınıf difüzyon Temsilcisi iz ve otokorelasyon eğrileri ben taze izole fare NK hücreleri moleküllerin yüzey. Şekilde üst panel 7x 10 sn ölçümlerinin bütün zaman izi boyunca zamanın bir fonksiyonu olarak flüoresan iniş-çıkışlarını gösterir. alt panel temsilBu yedi tekrarlar ortalama otokorelasyon eğrisi s. Otokorelasyon eğrisinin yüksekliği fokal hacmi içinde, H-2D D kişiler işaretlenmiş mobil floresan konsantrasyonu ile ters orantılıdır. Eğrinin eğimi dik kısmında X-ekseni değeri genlik yarısı, floresan fokal hacmi içinde, H-2d D molekülleri etiketli ortalama bekleme süresi gösterir. Sunulan ölçüm referans 2 olarak yayınlanan veri setinin bir parçasıdır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54756/54756fig3.jpg" /> Şekil 3: sorunlu hücre izleri örnekleri. (A) hareketli hücre, iz le bazal istikrarlı olmaması örneklediği gibivel. Üst panel, bu zaman noktasından sonra çok düşük bir sinyal ile temsil edilen tüm hücre, yaklaşık olarak 35 saniye sonra odak dışına olan bir örnek gösterilmektedir. Alt panelde, etki birkaç saniyelik bir aralıkta ortaya oluklar ile, daha ince olan. (B) Hücre beyazlatma, zamanla azalan iz yüksekliğini görüntüleniyor. ölçüm sonunda buna ölçüm başlangıcında izi yüksekliğini karşılaştırın. (C) izleme sivri tarafından temsil büyük kümeler, varlığı. Üst panelde, 20-25 sn bir büyük küme mevcuttur. alt panelde, çeşitli kümeler ölçüm boyunca mevcuttur. Sunulan ölçüm referans 2 olarak yayınlanan veri setinin bir parçasıdır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 4: eğri-uydurma ve artıklar ile Temsilcisi otokorelasyon eğrileri. kırmızı ve mavi dikey çizgiler montaj için kullanılan zaman penceresinin sınırlarını temsil etmektedir. Örnek otokorelasyon eğrisine bir 2-boyutlu difüzyon modeli temsil eden bir uyum (A) Örnek. Üst panelde, yeşil eğri (model) iyi bir uyum gösteren, mavi eğri (kazanılmış otokorelasyon) bindirmeleri. Alt panel eğri bakiye gösterir. iyi donatılmış değil 1 sn civarında dalgalanmalar, hücre ölümleri için tipik olan ve tolere edilebilir. Aynı otokorelasyon eğrisine 2 boyutlu difüzyon kötü uyum (B) &#39;. monte modeli otokorelasyon eğrisi paylaşımı yapmayan ve 1. alt paneller (A ve B) eğri uydurma kalıntı göstermek yakınsama etmez. artıklarÖzellikle eğrinin difüzyon bölümü için, kötü oturması için önemli ölçüde daha büyüktür. Sunulan ölçüm referans 2 olarak yayınlanan veri setinin bir parçasıdır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54756/54756fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Primer Lenfositlerin Plazma Membranlarında Moleküler Difüzyon Floresans Korelasyon Spektroskopisi İle Ölçülmüştür | İmmünoloji ve Enfeksiyon | Video

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

10.8K Görüntüleme.  Karolinska Institutet. A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Video: Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Koful genel Sitosolik kantifikasyonu<em&gt; Salmonella</em&gt; Diferansiyel permeabilizasyon tarafından İlköğretim Makrofagların içinde

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...