The authors are financially supported by the Swiss National Science Foundation through an operating grant N&#176; 31003A-149566 (to N.D.), and The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust through a Young Investigator Subsidy (to P.N.).

Ethik Hinweise: Alle Tier Manipulationen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der Tierforschungsausschuss der Universität Genf durchgeführt. 1. Herstellung von Phagozytische Ziele <ol><li> Werden 20 mg getrocknetes Zymosan bis 10 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Wirbel und in einem kochenden Wasserbad für 10 min. Kühl und Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand resuspendieren in 1 ml PBS und beschallen für 10 Minuten in einem Wasserbad Ultraschallgerät. Übertragen Sie 500 ul zu zwei 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 11.000 xg für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 500 ul PBS. Die gekochten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert. </li><li> Zweimal waschen Zymosan in 500 ul frisch hergestellte 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3, wie oben beschrieben (Schritt 1.2). </li><li> Resuspendieren in 490 &amp; mgr; l nach dem letzten Waschen. Zugabe von 10 ul 10 mg / ml FITC in Dimethylsulfoxid gelöst sulfoxide (DMSO), Wirbel, mit Folie abdecken, und Inkubation unter Rühren 4 Stunden bei RT. </li><li> Um ungebundene Farbe zu entfernen, wie oben (Schritt 1.2) waschen, zuerst mit 0,5 ml DMSO + 150 &amp; mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 300 &amp; mgr; l PBS, dann 0,5 ml DMSO + 450 &amp; mgr; l PBS, dann PBS alleine. </li><li> Graf Zymosan mit einem Hämocytometer. 1 ul Zymosan zu 500 ul PBS, Wirbel, dann werden 10 &amp; mgr; l an den Rand des Hämocytometer Kammer, wo es das Deckglas über das zentrale Netz platziert erfüllt. Montieren Sie das Hämocytometer auf einer Hellfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv ausgestattet. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der oberen linken Ecke, die 16 Plätze und zählt alle Zymosan Partikel in diesem Bereich mit einem Handtallykostenzähler. Wiederholen Sie mit der rechten unteren Ecke. Berechnen die Zymosan-Konzentration unter Verwendung der folgenden Gleichung: Zymosan Konzentration = Count / 2 x 500 x 10 4 Zymosan / ml. Markierten Zymosan kann aliquotiert werden, eingefroren und bei -20 ° C gelagert. </li><li> Opsonisieren das markierte Zymosan with ein Kaninchen-Anti-Zymosan Antikörper bei 1: 100 Verdünnung. Vortex und Inkubation für 1 Stunde in einem 37 ° C Wasserbad. Mit 500 &amp; mgr; l PBS waschen, wie oben beschrieben (Schritt 1.2). Hinweis: Die Beschallung ist sehr zu empfehlen, vor allem nach Opsonisierung, wie Zymosan neigt dazu, Klumpen, die später auf der Analyse erschweren kann bilden. Opsonisierung mit 65% v / v Ratten- oder Humanserum kann als Alternative verwendet werden. </li><li> Zählen Zymosan mit einem Hämocytometer wie in den Schritten 1.7-1.8 beschrieben, und mit Wasser auf 100 x 10 &amp; sup6; Teilchen / ml. Opsonisierung mit anderen phagozytischen Stimulatoren wie Komplement oder keinen Opsonierung kann alternativ durchgeführt werden. </li></ol> 2. Live Video-Mikroskopie <ol><li> Isolieren primäre Maus Neutrophilen, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben 38. <ol><li> Alternativ können Sie jede phagozytischen Zelltyp. Halten Neutrophilen auf Eis in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium mit 5% fötalem Kälberserum (v / v), 200 U Penicillin / streptomyci ergänztn, in einer Konzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml bis zur Verwendung. Andere Zelltypen kann 1-4 Tage vor ausgesät werden. </li></ol></li><li> In 2 × 10 5 (20 ul) von Neutrophilen an der Mitte einer 35 mm Glasbodenschale, verbreiten sie den Tropfen durch Zugabe von 50 ul Medium und bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Zellen zu haften. </li><li> 1 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) bis 37 ° C, die die spezielle MPO-Inhibitor 4-Amino-hydrazid (4-ABH, 10 &amp; mgr; M) erwärmt. Unspezifische MPO-Inhibitoren, wie Natriumazid (5 mM), können ebenfalls verwendet werden, jedoch wurden kürzlich vorgeschlagen, um zusätzliche nicht-spezifischen Effekte auf pH 39 auszuüben. </li><li> Montieren Sie den Teller auf einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit einem 37 ° C Heizungsanlage und einem 40X Öl-Objektiv ausgestattet. Inkubieren Zellen ohne Bildgebung für 10 Minuten, damit Zellen und Anlagen ins Gleichgewicht. </li><li> Passen Sie die Mikroskopeinstellungen, um eine TEM-Hellfeldbild zu erwerben [phase oder Differentialinterferenzkontrast (DIC), falls verfügbar] mit 440 nm oder 490 nm Anregungs- und 535 nm Emissions alle 30 sec. </li><li> Die Belichtungszeit und die Erfassungsfrequenz entsprechend dem Mikroskopsystem zu viel Photobleichen und Phototoxizität und in Abhängigkeit von den experimentellen Fragen gestellt vermeiden. Start der Bildaufnahme. </li><li> Nach 2 min, fügen Sie 10 x 10 6 (50 ul) opsonisiertes FITC-Zymosan in die Mitte der Schale. Einstellen target: Zellverhältnissen in Abhängigkeit von der Art von Phagozyten und Ziel verwendet. </li><li> Weiterhin Bildgebung für 30 min. Nach 30 Minuten beenden Sie den Zeitraffer-Akquisition und starten Sie einen Timer. Bewegen Sie die Bühne und erfassen 10 oder mehr Snapshots in unterschiedlichen Sicht für Bild in anderen Phagosomen, alle innerhalb von 5 min. </li></ol> 3. Kalibrierung und Kontrollexperimente <ol><li> Vorbereitung der pH Kalibrierlösungen (Rezepturen sind in Tabelle 1 beschrieben) vor dem Tag des Experiments und gefrier in 10 ml-Aliquots.Tauen die Kalibrierungslösungen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Den pH-Wert mit einem pH-Meter und Aufzeichnung der tatsächlichen pH-Wert der Lösungen. </li><li> Montieren Sie eine peristaltische Pumpe an der Bodenschale Glas vor der Bildaufnahme und führen Sie Live-Videomikroskopie, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben. </li><li> Am Ende der 30 Minuten Erfassungsperiode schalten Sie die Pumpe auf, um die Lösung in der Schale zu entfernen, fügen Sie 1 ml der erste Kalibrierungslösung und die Pumpe stoppen. </li><li> Warten Sie, bis das Signal stabilisiert, in der Regel 5 min. Wiederholen Sie mit die Eichlösungen. <ol><li> Zuführen mindestens eine Kalibrierung pro Versuchstag und kalibrieren, beginnend mit dem höchsten pH-Wert und arbeiten sequentiell auf den niedrigsten, sowie ausgehend von dem niedrigsten pH-Wert und arbeiten sequentiell in Richtung der Höhe. </li></ol></li><li> Als Kontrolle wurden 100 ul 100 uM NADPH-Oxidase-Hemmer diphenyl propionium Iodid (DPI) in HBSS, um Zellen in der Bodenschale Glas verdünnt in 900 &amp; mgr; l HBSS, undInkubation für 10 min. </li><li> Starten Akquisition und fügen Zymosan wie oben (Schritt 2.7). Nach 15 min der Phagozytose, mit 10 ul 10 uM V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A (ConcA) in HBSS verdünnt und weiter Bildgebung für weitere 15 min. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Analyse von Zeitraffer-Filmen und Phagosom Snapshots. Hinweis: Die folgenden Anweisungen spezifisch für ImageJ sind. Schritt-für-Schritt-Anleitungen können in Abhängigkeit von der verwendeten Software unterschiedlich sein, aber die in diesem Abschnitt beschriebenen Funktionen sind in den meisten professionellen Bildanalyse-Software. <ol><li> Öffnen Sie die Bilder mit professionellen Bildanalyse-Software. Subtrahieren Sie den Hintergrund in der 490-Kanal, indem ein kleines Quadrat ROI mit dem Quadrat Polygon Auswahl-Werkzeug in einem Bereich, wo es keine Zellen, und klicken Sie auf Plugins&gt; BG Subtraktion von ROI. Dann laden Sie die gleiche ROI auf der 440-Kanal, indem Sie auf Bearbeiten&gt; Auswahl&gt; Auswahl wiederherstellen und wiederholen. </li><li>Machen Sie eine 32-Bit-Verhältnis Bild des 490 Kanal geteilt durch die 440-Kanal, indem Sie Prozess&gt; Bild Calculator ..., eine entsprechende Bilder in den Image1 und Image2 Dropdown-Menüs, wählen Sie dann &#39;Teilen&#39; im Dropdown-Menü Bedienung und die Überprüfung der 32-bit (float) Ergebnis Kontrollkästchen. </li><li> Ändern Sie die Farbcodierung Verweistabelle auf ein Verhältnis-kompatiblen Farbcodierung, indem Sie auf Bild&gt; Lookup Tables&gt; Rainbow RGB. Threshold das Verhältnis Bild, um es durch Anklicken zu beseitigen Bild 0 und unendlich Pixel&gt; Anpassen&gt; Schwellenwert .... Passen Sie die Bildlaufleisten, so dass Zymosan in rot angezeigt wird, und klicken Sie auf Anwenden, sicherstellen, dass die Set Hintergrundpixel Kontrollkästchen NaN, um ausgewählt. </li><li> Kombinieren Sie dieses Verhältnis Stapel mit der Hellfeld-Kanal in einem Mehrkanal-Verbund indem Sie auf Bild&gt; Farbe&gt; Merge Kanäle, und die Auswahl der Hellfeldbild in der grauen Kanal Dropdown-Menü und das Verhältnis Bild im Grünkanal im Dropdown-Menü, und Auswählen desHalten Sie Quellbilder Check-Box. Scannen Sie die Zeitraffer-Filme oder Snapshots, um festzustellen, die Phagosomen analysiert werden sollen. Die Hellfeldkanal ist sinnvoll, für diese. </li><li> Zeichnen Sie Bereiche von Interesse (ROI) mit dem ovalen Polygon-Auswahl-Werkzeug in der Umgebung von Phagosomen und fügen Sie sie der ROI-Manager, indem Sie auf Analysieren&gt; Tools&gt; ROI Manager&gt; hinzufügen. Messen Sie ihren Zymosan Intensitätsverhältnis, indem Sie auf Mehr&gt; Multi-Measure und Abwahl der eine Zeile pro Stück Kontrollkästchen. </li><li> Für Zeitraffer-Filme, Phagosomen Spur ein zu einer Zeit, indem eine ROI, tippen Sie Strg + M zu jedem Zeitpunkt zu messen, und das Bewegen des ROI, wenn notwendig, um Intensitätswerte über die Zeit zu verfolgen. Kopieren Sie die Messungen aus dem Ergebnisfenster in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Anmerkung: Analyse von 15 (5 Zeitverläufe pro Experiment x 3) unabhängigen Experimenten ist ideal, aber in Abhängigkeit von der beobachteten Variabilität kann mehr oder weniger erforderlich sein. Speichern der ROIs wird immer empfohlen. Einige Softwarepakete ermöglichen Bild registration und dynamische Aktualisierung von ROIs, diesen Teil der Analyse zu erleichtern. </li></ol></li><li> Umwandlung von Fluoreszenz auf pH-Werte <ol><li> Messen Sie das Verhältnis 490/440 für Phagosomen in den Kalibrierungs Zeitraffer-Filme, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben. </li><li> In einer Tabellenkalkulation, zeichnen die Verhältniswerte über die Zeit und berechnet die Durchschnittsverhältniswerte von allen Phagosomen innerhalb des Sichtfeldes (gewöhnlich 5-20) 5 Zeitpunkten innerhalb der Mitte der Zeitperiode entsprechend jedem pH-Kalibrierung Lösung. (Siehe auch die roten Kästen in 5A.) </li><li> Zeichnen Sie diese durchschnittlich 490/440 Ratio-Werte gegenüber dem tatsächlich gemessenen pH-Wert. Kombinieren Sie mindestens 3 unabhängigen Kalibrierungen in einem einzigen Graphen. Verwenden Sie einen statistischen oder numerische Software-Paket, um eine nichtlineare Regression (Best-Fit-Kurve) durchführen, in der Regel an einen sigmoidalen Gleichung. Hinweis: Zum Beispiel in 5B die Gleichung verwendet wurde, war eine Boltzmann sigmoidal [Y = Bottom + ((Oben-Unten)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], wobei Y-Werte sind die 490/440-Verhältnisse, X sind die pH-Werte und die Oben, Unten, sind V50 und Steigungsparameter von der Software berechnet. </li><li> Verwenden Sie die erhaltene Gleichung zur Verhältniswerte um pH zu verwandeln. Hinweis: Zum Beispiel in 5B die für die Eichkurve in Gegenwart von Natriumazid erhalten Gleichung 490/440 Verhältnis = 1,103 + [(2,89 bis 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Die Auflösung nach pH ergibt die folgende Gleichung: pH = 6,993 - 0,9291 * [LN ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Obwohl zeitaufwendiger als alternative Verfahren, wie Spektroskopie und FACS, die eine ähnliche Strategie unter Verwendung eines pH-empfindlichen Farbstoff, Ziele gekoppelt einzusetzen, sondern messen die durchschnittliche pH-Wert einer Population von Phagosomen, bietet mikroskopische mehrere Vorteile. Erste ist, dass innere und äußere gebunden, aber nicht internalisierten Partikel können leicht unterschieden werden, ohne andere Chemikalien, wie Trypan-Blau oder Antikörper hinzuzufügen, Abschreckhärtung oder Etikett externen Teilchen sind. Zweite ist, dass im Anschluss an die Zellen in Echtzeit ermöglicht es den Forschern, mehrere Aspekte der phagozytischen Prozess gleichzeitige und so Auswirkungen auf die Migration, Erkundung und bindende Partikel könnten hier leicht zu erkennen ist, während es könnte mit der Bevölkerung basierte Methoden übersehen werden, zu beobachten. Zusätzlich Synchronisation der Initiierung der Phagozytose, oft indem Zellen bei 4 ° C, das andere Handel Ereignisse durch Kälteschock 40,41 stören könnte durchgeführt werden, ist nichtt erforderlich, da zum Zeitpunkt Null kann direkt festgestellt werden. Tatsächlich wird beim Live Mikroskopie, das 4 ° C Synchronisationstechnik wird nicht empfohlen, wenn die Erfassung Zeiträume nahe der Einleitung die Phagozytose als Kondensations, die während der Temperaturverschiebung auf dem Boden der Schale bildet, kann mit dem Ziel Sionsöl vermischen und Temperaturunterschiede zwischen der Erwärmung Gericht und Mikroskopkomponenten können Fokus verschiebt verursachen. Ein dritter Vorteil ergibt sich aus der Tatsache, dass Phagosomen intrinsisch heterogenen von mehreren Parametern ab, einschließlich, aber nicht beschränkt auf pH 42 beschränkt und bestimmte Effekte auf phagosome pH könnte subtiler sein, die Änderung der Verteilung der phagosomalen pH anstatt der durchschnittlichen Bevölkerung, wurde in 3 dargestellt ist. Solche Beobachtungen können tiefere mechanistische Einblicke in die Regulation der phagosomalen pH geben. In der vorliegenden Studie wurde FITC als das pH-empfindliche Farbstoff der Wahl ausgewählt, da espreiswerte, überall verfügbar ist, und vor allem einen pKa von 6,5 mit einem Dynamikbereich umfassenden pH 3-9 in seiner freien Form 37, der den ursprünglich erwarteten pH-Bereich von neutral bis schwach alkalisch abgestimmt nach den bisherigen Untersuchungen 29,30. Vor kurzem eine Studie unter Verwendung eines unterschiedlichen pH-Sonde genannt SNARF, die eine Grund pKa-Wert von 7,5, unerwartet geschätzten pH-Werte im Bereich 1-2 pH-Einheiten alkali sowohl für Wildtyp und Hvcn1 hat - / - Neutrophilen Phagosomen 39. Somit ist die Wahl des pH-Sensors ein wichtiger Parameter je nach Anwendungsfall zu berücksichtigen. Grundsätzlich kann das hier vorgestellte Verfahren leicht an andere pH-empfindliche Farbstoffe, wie SNARF und 2 &#39;, 7&#39;-bis- einzusetzen (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein (BCECF) deren Succinimidyl-Ester-Derivate werden leicht verbunden, um aminhaltige Teilchen, wie Zymosan. Tatsächlich Sensoren brauchen nicht fluoreszierende Farbstoffe als ratiomet beschränken,ric pH-empfindliche Proteine, wie ein sypher 43 könnte transduziert und durch Mikroorganismen exprimiert werden. Mehrere nicht-ratiometrische Alternativen bestehen auch, insbesondere die rote Version des Farbstoffs pHrodo, die in Verbindung mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) verwendet werden kann -markierte Proteine ​​oder dem pH-sensitiven Protein pHluorin. Jedoch wegen der potenziell großen Auswirkungen, die das harte intraphagosomal Milieu kann Farbstoffe und Proteine ​​darin betreffen, haben diese Sonden sollten mindestens in Verbindung mit pH-Sonden unempfindlich sein, bei der Ableitung eines pseudo-Verhältnis eingesetzt werden. Wie in Figur 5 beispielhaft dargestellt, können Kalibrierungen Experimenten die Wirkungen von Farbschädigung als reduzierte oder verzerrt Dynamikbereich freizulegen. Auf einer praktischen Anmerkung, sind Kalibrierungsexperimente nicht immer perfekt und kann nicht durchführbar, um nach jedem Experiment durchzuführen. Folglich kann Verhältniswerte gelegentlich aus dem Bereich der Kalibrierung fallen und Ertrag nicht Werte, auf die Umstellung auf pH-Wert. Es kann appropr werdenIATE entweder zum Ausdruck bringen, diese außerhalb des Messwerte als &quot;größer / kleiner-als oder gleich&quot; maximale und minimale Kalibrierung pH-Werte oder alle Werte als Kennzahlen und Schätzung pH auszudrücken reicht, dass die durchschnittlichen Verhältnisse darzustellen. Wie von DPI hervorgehoben und ConcA steuert, ROS-Produktion und V-ATPase-Aktivität sind wichtige Faktoren, die phagosomalen pH zu bestimmen. In der Tat, in vielen Situationen, Veränderungen in der Ebenen der ROS-Produktion können Unterschiede in phagosomalen pH zugrunde liegen, insbesondere in Neutrophilen, und Messung der phagosomalen ROS-Produktion und pH oft Hand in Hand gehen. Ein Wort zur Warnung ist, dass beide Medikamente verleihen Einblick in die Wirksamkeit der Enzyme hemmen sie aber nicht, um ihre Position innerhalb der Zelle. Beide Enzyme sind Multi-Untereinheiten-Komplexen, deren einzelne Komponenten müssen Besucher auf Phagosomen 4, und deren Mangel an Aktivität auf Phagosomen können von Menschenhandel oder Montagefehler, anstatt direkte Auswirkungen zur Folge haben.

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O2- and its derivative reactive oxygen species (ROS) 2,4. 
The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes 5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na+/H+ exchanger or ClC family Cl-/H+ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H+ translocation 9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils 4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba 13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H+ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H+ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme 17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH 22-24.
In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing 25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism 28. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)11, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later 29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH 31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions 33. 
Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH 34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies 36, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses. 
Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH 19. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm 37. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

<table><tbody><tr><td>Zymosan A powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4250</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Fluorescein isothiocyanate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)</td><td>Life Technologies</td><td>Z2850</td><td>Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.</td></tr><tr><td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-204107</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Diphenyleneiodonium chloride (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Concanamycin A (ConcA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27689</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Enzo</td><td>ALX-380-026-G001</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14200-075</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balance salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Ringer&#039;s balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.</td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671&amp;nbsp;</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3777</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&amp;nbsp;</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Ibidi &amp;micro;-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted</td></tr><tr><td>Sonicating water bath</td><td>O. Kleiner AG</td><td></td><td>A sonicator may be used instead, various instrument providers exist</td></tr><tr><td>Heamocytometer</td><td>Marienfeld GmbH</td><td></td><td>Various instrument providers exist</td></tr><tr><td>Widefield live imaging microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Peristaltic pump (Dynamax RP-1)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Various instrument providers exist</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Schott Gerate GmbH</td><td></td><td>Various instrument providers exist</td></tr><tr><td>Manual Counter</td><td>Milian SA</td><td></td><td>Various instrument providers exist</td></tr></tbody></table>

measuring phagosome ph by ratiometric fluorescence microscopy

Phagozytose ist ein grundlegender Prozess, durch den angeborenen Immunzellen zu verschlingen Bakterien, apoptotischen Zellen oder andere Fremdkörper, um zu töten oder zu neutralisieren, die verschluckt Material oder um sie als Antigene zu präsentieren und zu initiieren adaptiven Immunantwort. Der pH der Phagosomen ist ein kritischer Parameter zur Regelung Spaltung oder Fusion mit Endomembranen und Aktivierung der proteolytischen Enzyme, Ereignisse, die phagozytischen Vakuolen in eine abbau Organell ausreifen. Zusätzlich wird die Translokation von H + zur Herstellung hoher Konzentrationen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die für eine effiziente Töten und Signalisierung zu anderen Wirtsgeweben erforderlich. Viele intrazelluläre Pathogene zu untergraben phagocytic Tötung durch Begrenzung phagosomalen Versauerung, der die Bedeutung der pH-Wert im Phagosom Biologie. Hier beschreiben wir eine ratiometrische Verfahren zur Messung phagosomalen pH in Neutrophilen mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem Zymosan als phagozytischen targets, und Live-Cell-Imaging. Der Test basiert auf der Fluoreszenzeigenschaften von FITC, die durch saure pH abgeschreckt wird, wenn bei 490 nm angeregt wird, aber nicht, wenn sie bei 440 nm angeregt wird, so dass die Quantifizierung von einer pH-abhängigen Verhältnis statt der absoluten Fluoreszenz eines einzelnen Farbstoffs. Ein detailliertes Protokoll zur Durchführung einer in situ-Farbstoff Kalibrierung und Umwandlung des Verhältnisses realen pH-Werten ist ebenfalls vorgesehen. Single-Farbstoff ratiometrische Verfahren werden im Allgemeinen als überlegen einzigen Wellenlänge oder Dual-Farbstoff pseudo-ratiometrische Protokolle, da sie weniger empfindlich auf Störungen, wie beispielsweise Bleich sind, konzentrieren sich ändert, Laser-Variationen und unebene Kennzeichnung, die das Messsignal verfälschen. Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden, um in anderen pH phagozytischen Zelltypen zu messen und Zymosan durch jede andere aminhaltige Teilchen ersetzt werden, von inerten Kügelchen zu lebenden Mikroorganismen. Schließlich kann dieses Verfahren angepaßt werden, um die Verwendung von anderen fluoreszierenden Sonden empfindlich auf unterschiedliche pH-Bereiche oder andere phagosom machenal-Aktivitäten, so dass es eine allgemeine Protokoll für die funktionelle Bildgebung des Phagosomen.

Die folgenden sind repräsentative Ergebnisse für ein Experiment, wo die phagosomalen pH-Wert der primären Maus Neutrophile aus dem Knochenmark von Wildtyp oder isoliert Hvcn1 - / - Mäuse wurden verglichen. Für ein erfolgreiches Experiment ist es wichtig, genug Phagosomen im Sichtfeld während der gesamten Dauer des Zeitraffer-Film zu erhalten, bei gleichzeitiger Vermeidung zu viele Phagosomen, die später sein wird schwieriger Segment während der Bildanalyse. 1 schema Beispiele für gute und schlechte confluencies. Für zeitabhängige und Schnappschuss analysiert, müssen externe Zymosan Partikel aus Phagosomen unterschieden werden und aus der Analyse ausgeschlossen. 2 zeigt, wie der Hellfeldbild kann nützlich zur Unterscheidung externen Zymosan Partikel aus Phagosomen sein. Figur 3 zeigt Beispiele von typischen phagosome pH zeit Kurse in Wildtyp im Vergleich zu Hvcn1 - / - </em&gt; Neutrophilen, durchschnittliche pH-Werten und Histogramme phagosomalen pH Populationen. Diese Ergebnisse unterstreichen eine Situation, wo durchschnittliche Bevölkerungs pH-Wert unverändert, während die Verteilung der pH stark unterscheidet. Gute Kontrollen immer wichtig. 4 zeigt die Wirkung der Zugabe der NADPH-Oxidase-Hemmer DPI, die in einem schnellen Ansäuerung ergibt, gefolgt von der Zugabe der V-ATPase-Inhibitor ConcA, die die Ansäuerung umkehrt. Solche Experimente kann kritisch sein zu beweisen, dass die pH-empfindliche Sonden werden innerhalb von Phagosomen arbeiten, wie sie sollten. Eine typische Kalibrierung Zeitverlauf ist in Abbildung 5 dargestellt, mit Rechtecken, die den Bereich von Ratio-Werte verwendet, um die Eichkurve. Abbildung 5 zeigt außerdem, wie Farbstoff Chlorierung durch MPO-Aktivität können die intraphagosomal pH-Antwort des FITC beeinflussen, Hervorhebung der Tatsache, daß Sonden können anders ansprechen als im phagoso erwartet<html> mal Umwelt und die Bedeutung der in situ-Kalibrierung. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53402/53402fig1.jpg" /> Abbildung 1. Angemessene Konfluenz und Ziel: Zellverhältnis der linken Seite zeigt ein Beispiel, wo Zellkonfluenz ist zu spärlich und das Ziel:. Zellverhältnis zu niedrig ist, Verringerung der Wahrscheinlichkeit, dass eine phagozytische Ereignis wird in das Blickfeld auf. Das mittlere Feld zeigt ein Beispiel, wo Zellkonfluenz zu hoch ist und die Zellen werden überfüllt. Unter diesen Bedingungen können die Zellen nicht genug Platz hat, und finden ihre Ziele oder können übereinander Herstellung Analyse schwieriger später kriechen. Das rechte Bild zeigt eine ideale Zellkonfluenz und ursprüngliche Ziel: Zellverhältnis, in dem viele Zellen und Ziele können sich gezeigt, und dennoch klar voneinander voneinander unterschieden werden. FITC-Zymosan wird grün angezeigt und die Waage Balken stellt 10 um.<html> /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53402/53402fig2.jpg" /> Abbildung 2. Unterscheidungs ​​Phagosomen und uningested Zymosan. Die linke Tafel zeigt eine zusammengeführte Hellfeldbild und ein 490/440 FITC-Zymosan-Verhältnis, während das rechte Bild zeigt die Hellfeldbild allein. Phagosomen (kleine grüne Pfeile) können aus externen Teilchen unterschieden werden können, die entweder nicht co-lokalisieren mit Zellen (kurz roter Pfeil) oder deren Fluoreszenz nicht übereinstimmt mit einem dunklen Zentrum (lang roter Pfeil) um einen helleren Ring umgeben, charakteristisch von Phagosomen in der Hellfeldbild (grüne Pfeile). Die Maßstabsbalken entspricht 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53402/53402fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53402/53402fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeitkurse, durchschnittliche pH-Wert und das Verhältnis Histogramme von Wildtyp und Hvcn1 - / -. Neutrophile Phagosomen (A) Typische Zeitverläufe der phagosomalen pH zeigt, dass, während in Wildtyp-Neutrophilen (blau) der pH-Wert neutral ist (gepunktete Linie ) oder leicht alkalischen (durchgezogene Linie) während der frühen Zeitpunkten nach der Einnahme, die Phagosomen von Hvcn1 - / - Neutrophilen (rot) kann entweder alkalisch (durchgezogene Linie) oder säuern (gestrichelte Linie). (B) Das Kompilieren Schnappschüsse 30-35 min nach Zugabe von Zielen kann der Durchschnittsbevölkerung phagosomalen pH-Wert auf eine große Anzahl von Phagosomen (Wildtyp berechnet werden: n = 5/1898/383 und Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 Experimente / Phagosomen / Zellen, Bars sind Mittelwerte ± SEM, NS nicht signifikant). (C) Histogramme der FITC-zymosaN-Verhältnisse offenbaren Unterschiede in phagosomalen pH-Wert zwischen Wildtyp und Hvcn1 - / - Neutrophilen. (Diese Zahl hat sich von [19] geändert wurde, mit Genehmigung.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53402/53402fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53402/53402fig4.jpg" /> Figur 4. Wirkung von NADPH-Oxidase-Hemmer DPI und V-ATPase-Inhibitor ConcA auf phagosomalen pH. Vorinkubation bei 10 uM DPI ergab eine rasche Säuerung Phagosomen kurz nach der Einnahme, die durch Zugabe von 100 nM ConcA (Pfeil) umgekehrt wurde. (Diese Zahl hat sich von [19] geändert wurde, mit Genehmigung.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53402/53402fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 5. pH-Kalibrierung Zeitverlauf und die Auswirkungen der MPO-Hemmung auf die Kalibrierung von FITC-Zymosan. (A) Ein typischer pH Eichkurve intraphagosomal FITC-Zymosan. Rote Felder zeigen den Bereich der Verhältniswerte verwendet, um die Kalibrierungskurve zu konstruieren. Die pH-Werte der Lösungen verwendet, und die Zeiten, zu denen die Lösungen geändert werden, werden durch Pfeile angezeigt. Die Kurve stellt den Mittelwert von 10 Phagosomen innerhalb eines einzelnen Sehfeld. (B) Hemmung von MPO mit dem nicht-spezifischen Inhibitors Natriumazid (5 mM, MPO Inh) erhöht den Dynamikbereich des intraphagosomal FITC-Zymosan Antworten pH-abhängig. Punkte sind Mittelwerte ± SEM (Diese Zahl hat sich von [19] geändert wurde, mit Genehmigung.) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53402/53402fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um ein la ansehen</a>rger-Version dieser Figur. <table><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> (2x) Basis </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Puffer </td><td> Stock </td><td> Final (1x) </td><td> 500 ml (2x) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 1 M </td><td> 140 mM </td><td> 140 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl 2 </td><td> 1 M </td><td> 1 mM </td><td> 1 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 1 M </td><td> 0,2 mM </td><td> 0,2 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 1 M </td><td> 20 mM </td><td> 20 ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.2 </td><td> Puffer </td><td> Stock </td><td> Finale(1x) </td><td> Zweck </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> MES </td><td> 1 M </td><td> 20 mM </td><td> zur pH-Wert 5,5-6,5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 1 M </td><td> 20 mM </td><td> zur pH-Wert 7,0-7,5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Tris </td><td> 1 M </td><td> 20 mM </td><td> zur pH-Wert von 5,5 bis 6,7 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> NMDG </td><td> 1 M </td><td> 20 mM </td><td> zur pH-Wert von 5,5 bis 6,8 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.3 </td><td> Ionophore </td><td> Lizenz (100% EtOH) </td><td> Final (1x) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Nigericin </td><td> 5 mg / ml </td><td> 5 ug / ml </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Monensin </td><td> 50 mM </td><td> 5 &amp; ​​mgr; M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.4 </td><td> Für 50 ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> pH </td><td> 2x Basis </td><td> Buffer Type </td><td> Puffer Vol. </td><td> Nigericin </td><td> Monensin </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> 25 ml </td><td> MES </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> 25 ml </td><td> MES </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 6.0 </td><td> 25 ml </td><td> MES </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td&gt; 25 ml </td><td> MES </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 7.0 </td><td> 25 ml </td><td> HEPES </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td> 25 ml </td><td> HEPES </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 8.0 </td><td> 25 ml </td><td> Tris </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 8.5 </td><td> 25 ml </td><td> Tris </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 9.0 </td><td> 25 ml </td><td> Tris </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td> 9.5 </td><td> 25 ml </td><td> NMDG </td><td> 1 ml </td><td> 50 &amp; mgr; </td><td> 5 &amp; ​​mgr; </td></tr><tr><td></td><td colspan="2"> Einstellen des pH mitKOH oder HCl </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Rezept zur Herstellung von Kalibrierlösungen. 1.1) Rezept zur Herstellung von 500 ml eines 2x-Basislösung. 1.2) Rezeptur für die Herstellung nach dem pH-Wert der Probenlösung, die verschiedene Puffer verwendet. 1.3) Rezeptur für die Herstellung der in den Eichlösungen verwendet Ionophore. 1.4) Rezept zur Herstellung von 50 ml jeder Kalibrierungslösung mit Hilfe der Basis, Puffer und Ionophore in 1.1-1.3 beschriebenen.

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Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K Aufrufe.  University of Geneva. Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy. 

Serie: Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.

Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Biologie

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Neurowissenschaften

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

TIRF Microscopy-Based Visualization of Phagosome Formation and Closure

For non-covalent fixation of the SRBCs, pour 2 milliliters of the IgG-opsonized cells into each of the poly-lysine-coated dishes, and centrifuge the samples in a swinging rotor centrifuge. Discard the supernatants, and wash the particles one time with 2 milliliters of PBS plus 10% BSA.
Then, incubate the particles with 2 milliliters of fresh PBS plus 10% BSA for 30 minutes at room temperature, followed by three washes with 2 milliliters of PBS. After the last wash, replace the PBS with 2 milliliters of 37 degrees Celsius serum-free microscopy medium.
Place an SRBC-coded dish onto the microscope stage. Then, scrape the transfected cells of interest from the bottom of the culture dish and pipette the cells a few times to achieve a single-cell suspension. Add the transfected cells to the SRBC-coated dish.
Start the live acquisition software. Find a cell that expresses the fluorescently tagged proteins and adjust the position of the dish so that a cell of interest is in the middle of the field. Acquire 500 images at different angles from 0 to 5 degrees at 0.01-degree increments at one excitation wavelength.
To determine the critical angle for the incident light to be totally reflected at the glass-medium interface and generate an evanescent wave, open the image sequence in the appropriate imaging software. Select a region of interest in the cell with uniform fluorescence.
Then, under the Image tab, select Stacks and plot Z-axis profile. To plot the Z-axis profile mean fluorescence intensity measured in the region of interest with the function of the angles on the X-axis. Any angle value on the x-axis superior to the critical angle can then be used during the microscopy session to obtain a TIRF signal.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

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