This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.

1. Vorbereiten der Metagenom-Bibliothek mit pNP-GESS <ol><li> Konstruieren Sie eine Metagenom - Bibliothek in E. coli mit einem Vektor , der eine Fosmid Fosmid Bibliothek Produktions Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers 5. </li><li> 100 ul Aliquots der Bibliothek zur Lagerung bei -70 ° C, die eine Quelle der metagenomic Bibliothekszellen ist. Anmerkung: Die optische Dichte eines bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600) dieser Bibliothek stock gemessenen Probe ist etwa 100. </li><li> Auftauen 100 ul der Vorrats metagenomic Bibliothek auf Eis und Beimpfen für 2 h mit 37 ° C inkubiert in einem 500 ml-Kolben, enthaltend 50 ml Luria-Bertani (LB) und 12,5 &amp; mgr; g / ml Chloramphenicol. </li><li> Ernte der Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet schnell in 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) und Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C wieder. </li><li> Resuspend das Pellet in 50 ul eiskaltem DW mit 10% (v / v) Glycerin. Verwenden Sie 50 ul dieser Zelle aliquoten für die Elektroporation. </li><li> Legen Sie die Mischung aus elektro Zellen 50 &amp; mgr; l und pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in einer eiskalten Elektroporationsküvette und elektroporieren (1,8 kV / cm, 25 &amp; mgr; F) die Mischung. </li><li> Schnell 1 ml SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC) Medium und die Zellen vorsichtig resuspendieren. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in 14 ml Rundbodenrohr mit einer Pipette und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Verbreiten 500 ul der gewonnenen Zellen auf LB 20 x 20 cm quadratische Platte, die 12,5 &amp; mgr; g / ml Chloramphenicol und 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 12 Stunden. </li><li> Schaben die Kolonien eine Zellschaber und sammeln Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen mit eiskalten Zelle Speichermedien. </li><li> Zentrifuge bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Das Pellet in 10 ml eiskaltem Zelle Speichermedieneiner OD 600 von 100 zu erreichen. </li><li> 20 ul Aliquot der Zellen für die Lagerung bei -70 ° C. </li></ol> 2. Entfernen Fehlalarme aus der Metagenom-Bibliothek <ol><li> Auftauen Lager metagenomic Bibliothekszellen (aus Schritt 1.13), die Metagenom-DNA Fosmid und pGESS (E135K) auf Eis. </li><li> Beimpfen von 10 &amp; mgr; l der Zellen in 2 ml LB, enthaltend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol in einem 14-ml-Rundbodenröhrchen. bei 37 ° C inkubieren, bei 200 rpm für 4 Stunden unter Schütteln. </li><li> Inzwischen schalten Sie die FACS-Maschine und öffnen Sie die Standard-FACS-Software. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Düsenspitze Durchmesser, 70 &amp; mgr; m; Forward Scatter Area (FSC-A) Empfindlichkeit, 300 V-logarithmische Verstärkung; Side Scatter Area (SSC-A) Empfindlichkeit, 350 V-logarithmische Verstärkung; Fluoresceinisothiocyanat Area (FITC-A) Empfindlichkeit, 450 V-logarithmische Verstärkung; Schwellenparameter, FSC-A-Wert 5. Hinweis: Typische Einstellungen gegeben sindfür die FACS - Gerät in der Tabelle der Materialien erwähnt. Passen Sie die Einstellungen für andere FACS-Geräte. </li><li> Verdünne die metagenomic Bibliothekszellen aus Schritt 2.2 durch Zugabe von 5 ul der Probe auf eine 5-ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS. </li><li> Legen Sie die verdünnte Bibliothek Probe auf die Ladeöffnung des FACS Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf dem Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. </li><li> Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 1.500 Veranstaltungen / sec durch Klicken und die Durchflussrate auf dem Armaturenbrett zu steuern. </li><li> Erstellen Sie log skaliert FSC-A vs. Protokoll auf einem globalen Arbeitsblatt SSC-Streudiagramm skaliert durch Klicken auf die Dot Plot - Schaltfläche in der Werkzeugleiste. Stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett-Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon-Tor-Taste in der Werkzeugleiste zu umfassen. </li><li> Plot ein Histogramm mit Zellzahl gegen log auf dem Arbeitsblatt FITC-A skaliert durch einen Klick auf Histogramm - Taste. Dann stellen Sie die FITC Spannung von der Cytometer Register Einstellungen auf Inspektorfenster steuern, dass die Spitze der glockenförmigen Verteilung von weniger als 10 2 von FITC-A ist. </li><li> Erstellen Sie ein Protokoll skaliert FSC-A vs. das Protokoll FITC-A Plot, indem Sie auf dem globalen Arbeitsblatt auf dem Dot Plot-Schaltfläche klicken. Stellen Sie eine Sortier Tor R2 auf dem Grundstück das Polygon-Gate-Button in der Werkzeugleiste, so dass das Tor zwischen + 5% und -5% Zellen, die aus der Mitte der Verteilung (insgesamt 10% der Zellen rund um den Gipfel des glocken befindet förmige Kurve). </li><li> Legen Sie eine Sammelröhrchen , das 1,2 ml LB sowohl die R1 und R2 Tore befriedigend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol am Ausgang des FACS Instrument und sortieren 10 6 Zellen enthält. </li><li> Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel. </li></ol> 3. metagenomische Enzymscreening <ol><li> Inkubieren der sortierten Zellen (aus Schritt 2.11) bei 37 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute , bis die OD 600 0,5 Schütteln erreicht. </li><li> 1 &amp; mgr; l Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm. </li><li> Zur Herstellung von Zellen für die Sortierung, 0,5 ml der kultivierten Zellen hinzuzufügen und ein geeignetes Substrat (p - Nitrophenyl Acetat, p - Nitrophenyl-β-D-cellobiosid oder Phenylphosphat) in einen 14-ml - Rundbodenrohr in einer Endkonzentration von 100 uM. <ol><li> Für eine Kontrollprobe mit 0,5 ml der kultivierten Zellen aus Schritt 3.2 in einen 14-ml-Rundbodenrohr. Füge das gleiche Volumen an PBS als das Substratvolumen in Schritt 3.3. </li></ol></li><li> Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln. </li><li> Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3. </li><li> Zugabe von 5 &amp; mgr; l der Zellen (für die Sortierung) und Kontrollzellen zu zwei 5 ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively. </li><li> Das Röhrchen enthält Kontrollzellen auf ter Verladehafen der FACS, und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / sec durch auf dem Armaturenbrett Flow Rate Tasten steuern. </li><li> Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log SSC-A skaliert Streudiagramm mit einem Klick auf Dot Plot - Taste auf dem globalen Arbeitsblatt der Software und stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett - Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon - Tor - Taste auf das zu umfassen Werkzeugleiste. </li><li> Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log FITC-A skaliert Streudiagramm , indem Sie auf dem Arbeitsblatt auf dem Dot Plot Schaltfläche klicken und stellen Sie eine Sortier Gate R2 auf dem Grundstück mit dem Polygon - Tor - Taste auf der Werkzeugleiste , so dass weniger als 0,1% negative Zellen sind innerhalb des R2-Gatter erkannt. </li><li> Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Sortierprobenröhrchen und stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s durch die Strömungsgeschwindigkeit Tasten am Armaturenbrett steuern. </li><li> Legen Sie eine Sammelröhrchen, das 0,5ml LB am Auslass des FACS - Instrument und aussortieren 10 4 Zellen erfüllt sowohl die R1 und R2 Gattern. Hinweis: Das Sortierkriterium von oben 0,1% bis 5% des FITC-A in der R2 Gate reichen kann. In diesem Protokoll wurden obersten 1% Zellen als positive gesammelt. </li><li> Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel. </li><li> Verbreiten Sie die 0,5 ml gesammelten Proben auf zwei Agarplatten (90 mm Petrischalen) mit LB, 50 ug / ml Ampicillin, 12,5 ug / ml Chloramphenicol und Inkubation über Nacht die Platte bei 37 ° C. </li><li> Falls erforderlich, zusätzliche Runden der Sortierung für FITC-A-Anreicherung durch Wiederholen der Schritte 3,1-3,14. </li></ol> 4. Hit Auswahl und Enzymaktivität Bestätigung <ol><li> Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Von der Platte inkubiert bei Schritt 3.14, wählen Sie eine Kolonie zeigen keine Fluoreszenz eine Kolonie-Picker unter der Beobachtung von 488 nm Wellenlänge einer LED-Beleuchtung verwendet wird. </li><li> Impfen der ausgewählten Kolonie in einem 14-ml-round Boden - Röhrchen mit 2 ml LB unter Schütteln bei 200 rpm 50 &amp; mgr; g / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C , enthaltend bis zu dessen OD 600 0,5 erreicht. </li><li> In 2 ul Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm. </li><li> Bereiten Sie eine 14 ml-Rundbodenrohr und 1 ml der kultivierten Zellen (Schritt 4.1.3). Hinzufügen eines geeigneten Substrats (p - Nitrophenyl Acetat, p -nitrophenyl- β -D-cellobiosid, oder Phenyl phosphat) in einer Endkonzentration von 100 uM. <ol><li> Zur Kontrolle, fügen Sie die 1 ml kultivierten Zellen aus Schritt 4.1.3 in einem 14 ml-Rundbodenrohr und das gleiche Volumen an PBS als Substrat Volumen in Schritt 4.1.4 hinzuzufügen. </li></ol></li><li> Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln. </li><li> Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3. </li><li> Werden 5 ul der Kontrolle und Substrat behandelten Zellen zu 5 ml Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively. </li><li> Legen Sie die Röhrchen mit Kontrollzellen auf dem Ladeanschluss des FACS-Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett. </li><li> Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen. </li><li> Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Substrat behandelt Probenröhrchen. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett. </li><li> Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen. </li><li> Vergleichen der Fluoreszenz der beiden Gruppen von Zellen durch ein Histogramm der Zellzahl aufgetragen gegen den log FITC-A skaliert. </li></ol></li><li> Andere Tests Enzymaktivität zu bestätigen <ol><li> Zur weiteren Identifizierung der Enzymkandidaten ausgewählt, extrahieren Fosmid DNA-Standard Extraktion Pro mitverfahren aus den handelsüblichen Extraktions Kits und die Nukleotidsequenz zu analysieren, oder das Enzym in vitro Aktivität getestet 6,7. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Eine Erhöhung der Produktionseffizienz von Biokatalysatoren ist ein Schlüssel für den Erfolg von bio-chemischen Industrie Basis 9 und Metagenom gilt als einer der besten natürlichen Enzymquelle. In diesem Sinne ist es wichtig , neue Enzyme aus der Metagenoms Screening wo die Mehrheit der genetischen Ressourcen 10 nicht erforscht. Mehrere Screening - Verfahren entwickelt worden , die Enzymprodukte unter Verwendung von Transkriptionsaktivatoren 11, 12 , aber diese Techniken erfordern spezifische Metaboliten ansprechenden Transkriptionssystem direkt erfassen. Auf der anderen Seite ist GESS breit anwendbar in Abhängigkeit von der Verwendung von Phenol oder pNP markierten Substraten. Obwohl die meisten der berichteten Enzyme produzieren Phenol oder pNP Verbindungen in BRENDA - Datenbank (Tabelle 1), (einschließlich der drei Beispiele in dieser Arbeit) gehören zur Hydrolase (EC - Nummer 3) Klasse Enzyme, Erforschung vielfältiger phenolischen Substrate und Gestaltung auch eine künstliche Substrat unterworfen wirdZielenzymaktivität, als Alternativen der natürlichen Substrate, deutlich die Anwendbarkeit des Screening-System erstrecken. Beachten Sie, dass ein entsprechendes Phenol oder pNP getaggt Substrat der Wahl einer der entscheidenden Schritte, da die Membrandurchlässigkeit und zelluläre Wirkung des Substrats erheblich das Screening-Protokoll beeinflussen pNP-GESS-Anwendung ist. Hier zeigen wir, dass industriell wichtige drei verschiedene Typen von Enzymen können in einem Hochdurchsatz-Weise unter Verwendung des einzigen Screening-System identifiziert werden. Der Ansatz von FACS, zusätzlich zu dem Hochdurchsatz-Screening von Metagenom-Enzyme können auch mit technischem Transkriptionsregulatoren (TRS) für veränderte TR Spezifität angewendet werden. Ein Beispiel ist eine Studie , in der eine AraC - Variante , die Mevalonat anstelle von Arabinose detektiert wurde mit FACS isoliert und dann in Rasterzellen verwendet Herstellung Mevalonat 13. Auch hat die Veränderung der Spezifität von TRs für furth erlaubter Technik der Enzymaktivität. Auto-regulierten TR, PcaU, konstruiert wurde 3,4-dihydroxybenzoat (34DHB) zu erfassen und dann Dehydroshikimat Dehydratase - Enzyme (AsbF) bei ihrer maximalen Aktivität der Umwandlung von endogenem Dehydroshikimat zu 34DHB 14 zu screenen aufgetragen. Das Grundkonzept dieser Studien ist ähnlich dem von pNP-GESS, da pNP-GESS eine DmpR Variante benutzt pNP und zeigt eine hohe Durchsatzleistung in Screening von einer großen genetischen Bibliothek zu detektieren. Jedoch kann die Spezifität Engineering verursachen unbeabsichtigte Fehlalarme zu den Hits, wie es möglich ist, Reporterexpression von anderen Induktoren als Folge der erweiterten Spezifität auszulösen. Daher wäre es wünschenswert, die Orthogonalität von TR Reaktion zu untersuchen, bevor der TR angelegt wird. Auf der anderen Seite könnte die Empfindlichkeit und Dynamikbereich des TR Erhöhung falsch positive Generation kompensieren. Zum Beispiel wurde die Empfindlichkeit von GESS verbessert durch optimierte RBS Einfügen und Terminator sequschiede in das System. Falsch positive Ergebnisse des Screening-System möglicherweise kommen aus Störung des genetischen Schaltung, unbeabsichtigte phenolische Chemikalien die TR, heterogene Zellwachstum und die freie Diffusion von Phenol oder pNP aktivieren. Die negativen Selektionsprozesse der Schritte 2,1-2,9 erwartet wurden falsch-positive Zellen ohne Substrat Ablösebehandlung Fluoreszenz zu entfernen. Diese falsch-positiven Zellen können auch durch Maximieren des Signal-Rausch-Verhältnis des genetischen Schaltung reduziert werden. Zusammen mit dem RBS und Terminator - Engineering, die Verwendung von M9-Glucosemedium signifikant verbessert das Signal (7-fach höher als LB - Medien) in pNP-GESS Leistung 5. Aber in diesem Protokoll LB wurde als Kompromiss zwischen dem unbekannten metagenomic Genexpression und GESS Signalintensität verwendet. Die Untersuchung empfindlicher Bedingungen von pNP-GESS Zellwachstum und Substrateffekt in M9-Glucose ermöglicht die Signalintensität zu verbessern. Enge Regulierung der Reaktionszeit der Substrate in Schritt 3.5, istauch wichtig, Fehlalarme durch Phenol oder pNP Diffusion ausgelöst zu verhindern. GESS ermöglicht die Umwandlung von Enzymfunktion in Transkriptions-vermittelte Reporterproteinexpression in einer Einzelzellebene, aber die indirekte Identifizierung über Reporterprotein eine der inneren Begrenzungen sein könnte. So, in vitro Enzymassay und LC / GC-MS - Analyse eines Produkts muss zur eindeutigen Identifizierung eines mutmaßlichen Enzymkandidaten 6,7 folgen. Auch ist es möglich, GESS für teure FACS-Analyse ohne die Notwendigkeit zu verwenden, indem alternative Reporter, wie beispielsweise Antibiotikaresistenzgene oder chromogene Enzyme mit fluoreszierenden Reportern befestigen. Zur weiteren Verbesserung der GESS Anwendungen ist es notwendig, ein Verfahren zur Charakterisierung der Enzymaktivität und zu identifizieren, die Enzyme in einer Hochdurchsatz-Art und Weise herzustellen. Zusammen mit anderen Hochdurchsatz-Technologien, wie der nächsten Generation Sequenzierung, wird GESS sein eine weit verbreitete Strategie für Protein und Enzymir Katalysatortechnik in der Biologie-basierten Industrie.

Eine kürzlich entwickelte Hochdurchsatz - Einzelzellen - Assay - Technik ermöglicht neue Enzyme aus einer großen Genbank auf ihre funktionellen Aktivitäten 1 basierend gescreent werden. Auf Einzelzellebene, Transkriptionsproteinen regulieren eingesetzt Expression auszulösen Reportergens durch Abfühlen kleine Moleküle, die als Ergebnis eines Zielenzymaktivität erzeugt werden. Ein früher Ansatz involviert die Isolierung eines Phenol abbau Operon aus Ralstonia eutropha E2 unter Verwendung des substratinduzierte Genexpression Screening (SIGEX) Verfahren, bei dem das Substrat , die Expression eines Reporterproteins 2 induziert. NHAr von Pseudomonas putida wurde verwendet , um Benzaldehyd - Dehydrogenase 3 und lysG aus Corynebacterium glutamicum ausgewählt wurde für die Hochdurchsatz - Screening eines neuen L-Lysin-produzierender Stamm von unterschiedlichen Mutantenbibliotheken 4 verwendet. Zuvor eine genetische Enzym screening - System (GESS) wurde als allgemein anwendbare Screening - Plattform 5 vorgeschlagen. Dieses System verwendet das Phenol-Erkennung Dimethylphenol Regler, DmpR, von P. putida. DmpR (E135K) und eine Mutante von DmpR, können auch in GESS (pNP-GESS) zum Nachweis von p - Nitrophenol (pNP) eingesetzt werden. In Gegenwart von Zielenzymen Herstellung phenolische Verbindungen, GESS in E. coli - Zellen emittiert ein Fluoreszenzsignal, das eine schnelle Trennung von Einzelzellen ermöglicht , eine Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer verwenden (FACS). Aber die Expression des Enzyms metagenomic erscheint als schwächer zu sein, daß der herkömmliche rekombinante Enzyme; Daher wurde GESS ausgelegt phenolische Verbindungen mit maximaler Empfindlichkeit zu erfassen , indem die Kombination der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) und Terminatorsequenzen zusammen mit optimalen Betriebszustand 5 untersuchen. Einer der wesentlichen Vorteile von GESS ist, dass diese einzelne Methode ermöglicht es theoretisch das Screening von over als 200 verschiedene Arten von Enzymen in der BRENDA - Datenbank (Tabelle 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) , indem einfach verschiedene Substrate verwendet. Es zeigte sich, dass Cellulase, Lipase gezeigt, und Methyl - Parathion Hydrolase (MPH) kann mit geeigneten Substraten von p - Nitrophenyl- Butyrat, p - Nitrophenyl-cellotrioside und Methyl - Parathion jeweils 5 unter Verwendung von pNP-GESS nachgewiesen werden. Vor kurzem wurde nachgewiesen , daß eine alkalische Phosphatase (AP), die eine der neuen Enzyme ist pNP-GESS identifiziert verwendet wird , ist das erste thermolabilen AP in kälteangepassten marine Metagenomen gefunden 6. Hier Details des Screening - Prozesses präsentiert mit pNP-GESS die Aktivitäten von drei verschiedenen Arten von enzymes- Lipase Nachweis, Cellulase und alkalische Phosphatase -und schnell neue Kandidaten Enzyme aus einer metagenomic Bibliothek 5,6 identifizieren. Die Verfahren umfassen die Vorverarbeitung Metagenom mit pNP-GESS und Betrieb eines flow-Zytometrie Sortierer. Während die erhaltenen Treffer müssen zur weiteren Identifizierung sequenziert werden, erstreckt sich dieses Protokoll, das Verfahren auf eine Bestätigung zu den Schritten der Enzymaktivität unter Verwendung von Durchflusszytometrie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td style="width:736px;">Fosmid library production kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl Induction Solution</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCIS125</td>
			<td>Fosmid copy induction solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EPI300</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">EC300110</td>
			<td>Electrocompetent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pCC1FOS</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td>Fosmid vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gene Pulser Mxcell</td>
			<td style="width:109px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Electroporation cuvette and electroporate system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">FACSAria III</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry (FACS machine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AZ100M</td>
			<td style="width:109px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">UltraSlim&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Maestrogen</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>LED illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">50-mL conical tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">14-mL round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">5-mL round-bottom tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N7653</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N5759</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl butylate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N9876&#160;</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Luria- Bertani (LB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244620</td>
			<td>Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth (SOB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244310</td>
			<td>Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>SOB, 0.4 % glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244020</td>
			<td>Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cell storage media</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:319px;">pGESS(E135K)</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:736px;">A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. 
			See the reference 5 in the manuscript for more details.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">PBS</td>
			<td style="width:109px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-enzyme screening using a high-throughput genetic enzyme screening system

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Die drei phenolischen Substrate wurden untersucht, um neue metagenomic Enzyme aus einer Metagenom Bibliothek von Ozean-Wattsedimente in Taean, Südkorea identifizieren durch das vorgeschlagene Protokoll folgen. Für die Bibliothekskonstruktion, durchschnittlich 30 bis 40 kb Metagenoms Sequenzen wurden in Fosmide eingeführt, die auf dem E. beruhen coli F - Faktor Replikon und als eine einzige Kopie in einer Zelle dargestellt. Beachten Sie, dass Fosmide haben zur Konstruktion komplexer genomischer Bibliotheken aufgrund ihrer stabilen Ausbreitungs 8 weit verbreitet. Figur 1 zeigt ein kurzes Flußdiagramm der Screening - Protokoll , einschließlich der Entfernung von Fehlalarmen mit negativen Sortieranlage (Figur 1 A) , gefolgt von positive Trefferauswahl mit R1 und R2 Gattern (Figur 1 B) sortiert wird . Die Treffer wurden durch Vergleichen der Fluoreszenz der Proben mit und ohne Substrate bewertet(Figur 1 C). Im Falle von p - Nitrophenyl Acetat vermittelte Screening, fünf Kandidaten der Lipase wurde bestätigt , wo die Fluoreszenz des Substrats behandelten Zellen , dass höher waren als der Kontrollzellen (Abbildung 2 A). Trotz der breiten Verteilungen der drei Kandidaten von Cellulase in Abbildung 2 B, sie zeigten auch deutliche Unterschiede der durchschnittlichen FITC Intensität der Bevölkerung. Vier Phosphatase Kandidaten zeigten auch eine hohe Fluoreszenzniveau im Vergleich zu den Kontrollzellen (Abbildung 2 C). Je mehr Fluoreszenz Unterschied zwischen negativen und der Kandidatenzellen kann die stärkere Enzymaktivität von pNP-GESS seit dem Fluoreszenzreporter ableiten zeigt quantitative Antworten auf die Phenolkonzentrationen 5. In diesem Protokoll wurden nur die Fluoreszenz Unterschiede bestätigt eine Durchflusszytometrie sondern verschiedene Identifizierungsassays unter Verwendung von a angewendet werden4,2 s in Schritt erwähnt. Abbildung 3 zeigt das Beispiel der AP Identifikation 6. Ein ausgewählter Klon unter siebenundvierzig stark fluoreszierende Kolonien aus dem Screening wurde sequenziert und ein ORF des Kandidaten AP identifiziert. Das ORF in einen Plasmidvektor inseriert wurde bestätigt Zytometrie mit Strömungs AP-Aktivität zu haben. In Abbildung 3 zeigt die Treffer stärkere Fluoreszenzsignal als die Zellen leer Plasmid tragen (negativ). Eine weitere Analyse der Sequenz und in vitro enzymatische Aktivität entdeckt , dass diese AP zu anderen bekannten APs in seiner enzymatischen Eigenschaften außer hohe katalytische Aktivität bei niedrigeren Temperaturen sehr ähnlich war (35 ° C) und eine bemerkenswerte thermische Instabilität (65 ° C) innerhalb von 15 min 6 . Darüber hinaus wurde das gesiebte AP vergleichbar Terminal Phosphaten aus bindigen und stumpfen Enden linearisierter Plasmid - DNA 6 zu kommerziell APs verfügbar zu entfernen. Abb . 1: Multi - Enzym - Screening - Verfahren (A) Entfernung von falsch-positiven Zellen zeigt Fluoreszenz ohne Substrat. Die Sortierweiche ist in der Mitte der Zellpopulationsdichte liegt, so daß das Gatter 10% der gesamten Zellen enthält. (B) Sortieren hohe fluoreszierend (FITC-A) Zellen (positive) erfüllt , R1 und R2 Gattern in Gegenwart eines geeigneten Substrats. (C) Nach der Auswahl und der Einzelzellisolierung, die Aktivität der Kandidaten - Enzyme mit und ohne das Substrat untersucht wurde (bezeichnet als W / und W / O - Substrate, respectively). Die klare Signaldifferenz zwischen den beiden Proben impliziert der Fosmid Vektor der Ziel genetische Information von Interesse Zellen enthält. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </p&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig2.jpg" /> Abbildung 2: Enzymaktivität Bewertung unter Verwendung von Durchflusszytometrie metagenomische Enzymkandidaten gescreent von pNP-GESS mit drei verschiedenen Substraten (A) p - Nitrophenyl Acetat (pNPA), (B) p - Nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), und. (C) phenylphosphat. Alle Kandidaten zeigen deutliche Signaldifferenz zwischen den Zellen mit und ohne Substrat. Die Kontrollen sind die Zellen ohne ihre entsprechenden Substratbehandlung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig3.jpg" /> Abbildung 3: Alkaline Phosphatase Identification. Linke Tafel zeigt klar Fluoreszenz Unterschied zwischen den Zellen , die das Enzym enthält , getroffen und ein leeres Plasmid - Vektor (negativ). Auf der rechten Seite Phosphatase-Assays von Zellen, die Phosphatase Kandidatengens in einem Plasmidvektor auf LB-Agar, der 5-Brom-4-chlor-3-indolyl phosphat als kolorimetrische Substrat beherbergt gezeigt. Blaue Kolonien zeigen, dass die ausgewählten Zellen die metagenomic Gen, codierend ein Phosphatase enthalten. Siehe 6 für weitere Details. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> EG - Nummer </td><td> Beschreibung </td><td> Anzahl der p-nitrophenol Herstellung Enzyme </td><td> Anzahl der Phenol produziert Enzyme </td></tr><tr><td> EG 1 &lt;/ Td&gt; <td> 1.3 </td><td> Wirkung auf die CH-CH-Gruppe von Spendern </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Oxidoreduktasen </td><td> 1.11 </td><td> Peroxygenase </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> 1.14 </td><td> Acting auf gepaart Spendern, unter Einbeziehung oder </td><td rowspan="2"> - </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td></td><td> Reduktion von molekularem Sauerstoff </td></tr><tr><td> EC 2 </td><td> 2.3 </td><td> Acyltransferasen </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Transferasen </td><td> 2.4 </td><td> Glycosyltransferasen </td><td> 8 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td> Transferieren Alkyl- oder Arylgruppen, andere als Methylgruppen, </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.7 </td><td> Übertragen von phosphorhaltigen Gruppen </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.8 </td><td> Übertragen von schwefelhaltigen Gruppen </td><td> 3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EC 3 </td><td> 3.1 </td><td> Gesetz über Esterbindungen </td><td> 67 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Hydrolases </td><td> 3.2 </td><td> Glycosylasen </td><td> 75 </td><td> 21 </td></tr><tr><td></td><td> 3.4 </td><td> Gesetz über Peptidbindungen - Peptidase </td><td> 26 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td> Gesetz über die Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, andere als Peptidbindungen </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td></td><td> 3.6 </td><td> Gesetz über die Säureanhydride </td><td> 4 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 3.7 </td><td> Gesetz über die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td> EC 4 </td><td> 4.1 </td><td> Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen </td><td> - </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Lyasen </td><td> 4.2 </td><td> Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 4.3 </td><td> Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="3"> Subtotal Anzahl von Enzymen </td><td> 197 </td><td> 53 </td></tr><tr><td colspan="3"> Gesamtzahl der Enzyme (ohne überlappte Enzyme) </td><td colspan="2"> 211 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Die Anzahl der Enzyme , die p - Nitrophenol oder Phenol aus der BRENDA - Datenbank erzeugen.

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Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Screening Multi-Enzym ein High-throughput Genetic Enzymscreening-System verwenden

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Aufrufe.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate). 

Serie: Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Forschung

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatisierte Modular High Throughput Exopolysaccharid Screening-Plattform mit hochsensiblen Carbohydrate Fingerabdruck-Analyse Gekoppelt

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.