This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.

1. Preparazione della biblioteca metagenomica con PNP-GESS <ol><li> Costruire una libreria metagenomica in E. coli con un vettore fosmid utilizzando un kit fosmid produzione biblioteca secondo il protocollo 5 del produttore. </li><li> Aliquotare 100 microlitri della libreria per conservazione a -70 ° C, che è una fonte di cellule libreria metagenomiche. Nota: La densità ottica di un campione misurato ad una lunghezza d&#39;onda di 600 nm (OD 600) di questa libreria stock è di circa 100. </li><li> Scongelare 100 ml di dotazione della biblioteca metagenomica sul ghiaccio e inoculare in un pallone da 500 ml contenente 50 ml di Luria-Bertani (LB) e 12,5 mcg / ml cloramfenicolo seguito da 37 ° C di incubazione per 2 ore. </li><li> Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 1.000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet rapidamente in 50 ml di acqua ghiacciata distillata (DW) e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C di nuovo. </li><li> resuspend il pellet in 50 microlitri DW ghiacciata con 10% (v / v) di glicerolo. Utilizzare 50 ml di questa aliquota cella per elettroporazione. </li><li> Mettere il composto di cellule electrocompetent 50 pl e pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in una cuvetta elettroporazione ghiacciata e l&#39;elettroporazione (1,8 kV / cm, 25 uF) la miscela. </li><li> Aggiungere rapidamente 1 ml di brodo eccellente ottimale con cataboliti repressione (SOC) di media e risospendere le cellule delicatamente. </li><li> Trasferire le cellule nel tubo 14 ml a fondo rotondo con una pipetta e incubare a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Distribuire 500 ml di cellule recuperate su un LB di 20 x 20 cm Piatto quadrato contenente 12,5 mg / ml cloramfenicolo e 50 mg / ml di ampicillina. Incubare la piastra a 30 ° C per 12 ore. </li><li> Raschiare le colonie utilizzando un raschietto cellulare e raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml utilizzando supporti di memorizzazione cella ghiacciata. </li><li> Centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 10 ml di supporti di memorizzazione delle cellule gelideper raggiungere un OD 600 di 100. </li><li> Aliquotare 20 ml di cellule per lo stoccaggio a -70 ° C. </li></ol> 2. Rimozione falsi positivi dalla libreria metagenomiche <ol><li> Scongelare lo stock cellule biblioteca metagenomiche (dal punto 1.13) contenenti metagenomica fosmid DNA e pGESS (E135K) su ghiaccio. </li><li> Seminare 10 ml di cellule in 2 ml LB contenenti 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 4 ore. </li><li> Nel frattempo, accendere la macchina FACS e aprire il software di default FACS. Utilizzare le seguenti impostazioni: diametro della punta dell&#39;ugello, 70 micron; Forward Scatter Area (FSC-A) sensibilità, 300 V-logaritmica di amplificazione; Side Scatter Area (SSC-A) sensibilità, 350 V-logaritmica di amplificazione; Fluoresceina isotiocianato Area (FITC-A) sensibilità, 450 V-logaritmica di amplificazione; parametro di soglia, FSC Un valore 5. Nota: Le impostazioni tipiche sono dateper il dispositivo FACS menzionata nella tabella dei materiali. Regolare le impostazioni per altri dispositivi FACS. </li><li> Diluire le cellule biblioteca metagenomiche dal punto 2.2 con l&#39;aggiunta di 5 ml di campione in una provetta a fondo tondo da 5 ml contenente 1 ml di PBS. </li><li> Mettere il campione biblioteca diluito sul porto di carico dello strumento FACS e fare clic sul pulsante Carica sul Acquisizione Dashboard del software FACS. </li><li> Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 1.500 eventi / sec facendo clic e il controllo dei pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto. </li><li> Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione di un foglio globale facendo clic sul pulsante Plot Dot nella barra degli strumenti. Regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi di singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono Porta nella barra degli strumenti. </li><li> Tracciare un istogramma con conta delle cellule contro log in scala FITC-A sul foglio di lavoro facendo clic sul pulsante Istogramma. Poi, regolare la tensione di CIC dal Cytomescheda Impostazioni ter sulla finestra di ispezione controllo tale che il picco della distribuzione a campana è inferiore a 10 2 di FITC-A. </li><li> Creare un registro in scala FSC-A vs. il registro FITC-Una trama cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale. Impostare un ordinamento cancello R2 del terreno con il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che il cancello si trova tra le cellule + 5% e -5% dal centro della distribuzione (cellule totali 10% intorno al picco della campana curva a forma). </li><li> Posizionare un tubo di raccolta contenente 1,2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo all&#39;uscita dello strumento FACS e sort out 10 6 cellule soddisfano sia la R1 e R2 cancelli. </li><li> Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice. </li></ol> 3. metagenomiche Enzyme Screening <ol><li> Incubare le cellule ordinati (dal punto 2.11) a 37 ° C con agitazione a 200 giri al minuto fino a quando la OD 600 raggiunge 0,5. </li><li> Aggiungere 1 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. </li><li> Per preparare cellule selezionare, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate e un substrato (p -nitrophenyl acetato, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, oppure fenile fosfato) in una provetta da 14 ml a fondo rotondo a una concentrazione finale di 100 pM. <ol><li> Per un campione di controllo, aggiungere 0,5 ml di cellule coltivate da Passaggio 3.2 in una provetta a fondo rotondo da 14 ml. Aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passo 3.3. </li></ol></li><li> Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore. </li><li> Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come punto 2.3. </li><li> Aggiungere 5 ml di cellule (per l&#39;ordinamento) e cellule di controllo a due provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente. </li><li> Collocare la provetta contenente cellule di controllo Onto tegli caricamento porto delle FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto. </li><li> Creare log in scala FSC-A vs log in scala SSC-A grafico a dispersione cliccando sul tasto Plot Dot sul foglio di lavoro globale del software e regolare il cancello dispersione R1 fino a comprendere gli eventi singoletto (popolazione batterica) utilizzando il pulsante Poligono porta sul barra degli strumenti. </li><li> Creare log in scala FSC-A vs log in scala coniugati con un grafico a dispersione, cliccando sul pulsante Plot Dot sul foglio di lavoro e impostare un ordinamento porta R2 sulla trama utilizzando il pulsante Poligono Porta sulla barra degli strumenti in modo che meno dello 0,1% di cellule negative vengono rilevati all&#39;interno del cancello R2. </li><li> Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione di smistamento, e regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec controllando i pulsanti di flusso Prezzo sul cruscotto. </li><li> Posizionare un tubo di raccolta contenente 0,5ml LB all&#39;uscita dello strumento FACS e sort out 10 4 cellule soddisfano entrambe le porte R1 e R2. Nota: Il criterio di ordinamento può variare da cima 0,1% al 5% di FITC-A nel cancello R2. In questo protocollo, top cellule 1% sono state raccolte come positivi. </li><li> Rimuovere il tubo di raccolta, berretto, e delicatamente vortice. </li><li> Distribuire i 0,5 ml campioni raccolti su due piastre di agar (90 mm piatti Petri) contenenti LB, 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. </li><li> Se necessario, eseguire ulteriori cicli di smistamento per FITC-A arricchimento ripetendo i passaggi 3.1-3.14. </li></ol> 4. Hit Selezione e Enzyme Activity Conferma <ol><li> Citometria a flusso <ol><li> Dalla piastra di incubazione a Passo 3.14, selezionare una colonia mostrando alcuna fluorescenza utilizzando un selettore colonia sotto l&#39;osservazione di 488 nm lunghezza d&#39;onda di un illuminatore a LED. </li><li> Inoculare la colonia selezionata in un 14-ml round fondo provetta contenente 2 ml LB contenente 50 ug / ml di ampicillina e 12,5 ug / ml cloramfenicolo a 37 ° C con agitazione a 200 rpm fino alla sua OD 600 raggiunge 0,5. </li><li> Aggiungere 2 ml Copy Solution induzione per amplificare il numero di copie fosmid intracellulare. Incubare le cellule per un ulteriore 3 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. </li><li> Preparare un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere 1 ml di cellule in coltura (Fase 4.1.3). Aggiungere un substrato (acetato p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, oppure fenile fosfato) ad una concentrazione finale di 100 mM. <ol><li> Per un controllo, aggiungere i 1 ml cellule coltivate dal punto 4.1.3 in un tubo 14 ml a fondo rotondo e aggiungere lo stesso volume di PBS come il volume del substrato nel passaggio 4.1.4. </li></ol></li><li> Incubare le due campioni a 37 ° C con agitazione a 200 rpm per 3 ore. </li><li> Nel frattempo, preparare la macchina FACS con le stesse configurazioni come Passo 2.3. </li><li> Aggiungere 5 ml di cellule di controllo e supporto trattato di provette da 5 ml a fondo rotondo contenente 1 ml di PBS, rispettivamente. </li><li> Mettere le cellule di controllo tubo contenente il porto di carico del dispositivo FACS e fare clic sul pulsante Carica su Acquisizione Dashboard del software FACS. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto. </li><li> Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A. </li><li> Sostituire il tubo campione di controllo con il tubo del campione substrato trattato. Regolare il tasso di eventi a 1.000 - 3.000 eventi / sec utilizzando i pulsanti di flusso tasso sul cruscotto. </li><li> Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare FITC-A. </li><li> Confrontare la fluorescenza dei due gruppi di cellule tracciando un istogramma del numero di cellule vs. log scalata FITC-A. </li></ol></li><li> Altri test per confermare l&#39;attività enzimatica <ol><li> Per ulteriore identificazione dei candidati enzimi selezionati, estrarre il DNA fosmid usando l&#39;estrazione pro di serieprocedure dei kit di estrazione commerciali e analizzare la sequenza nucleotidica, o testare l&#39;attività enzimatica in vitro 6,7. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+screening+methods-biosensors.">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li><li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes.">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li><li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis.">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li><li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level.">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).</li><li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits.">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li><li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments.">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li><li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite.">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li><li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector.">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li><li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts:+application+and+engineering+for+industrial+purposes.">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li><li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product-induced+gene+expression,+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes.">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li><li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+bio-transformations+with+&#224;+la+carte+genetic+traps:+translating+dehydrochlorination+of+lindane+(gamma-hexachlorocyclohexane)+into+lacZ-based+phenotypes.">Surveying bio-transformations with &#224; la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li><li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein.">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li><li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry.">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Aumentare l&#39;efficienza della produzione di biocatalizzatori è una chiave per il successo di bio-chimico a base industria 9 e metagenoma è considerato uno dei migliori fonte enzima naturale. In questo senso, è essenziale lo screening di nuovi enzimi dalla metagenome dove la maggioranza delle risorse genetiche non sono state esplorate 10. Diversi metodi di screening sono stati sviluppati che rilevano direttamente i prodotti enzimatici utilizzando attivatori trascrizionali 11, 12 ma queste tecniche richiedono specifico sistema di trascrizione metabolita-reattiva. D&#39;altra parte, GESS è ampiamente applicabile a seconda dell&#39;uso del fenolo o PNP etichettato substrati. Sebbene la maggior parte degli enzimi riportati producono composti fenolici o PNP nel database BRENDA (Tabella 1), (compresi i tre esempi in questo lavoro) appartengono alla idrolasi (numero 3 CE) enzimi di classe, di esplorare più diversi substrati fenolici e anche la progettazione di un artificiale substrato sottoponendo aindirizzare attività enzimatica, come alternative di substrati naturali, potrebbero ampliare notevolmente l&#39;applicabilità del sistema di screening. Si noti che la scelta di un fenolo appropriata o PNP etichettato substrato è uno dei passaggi cruciali di applicazione pNP-GESS poiché la permeabilità della membrana e l&#39;effetto cellulare del substrato notevolmente influenzare il protocollo di screening. Qui mostriamo che industrialmente importanti tre diversi tipi di enzimi possono essere identificate in modo high throughput utilizzando il sistema di screening singolo. L&#39;approccio di utilizzare FACS, oltre al high-throughput screening degli enzimi metagenomiche, può essere applicato anche ad ingegneria regolatori trascrizionali (TRS) per la specificità alterata TR. Un esempio è uno studio in cui una variante AraC che ha rilevato mevalonato invece di arabinosio è stato isolato usando FACS, e poi impiegato per le cellule che producono schermo mevalonato 13. Inoltre, l&#39;alterazione della specificità di TR ha consentito di Further engineering dell&#39;attività enzimatica. Auto-regolata TR, PcaU, è stato progettato per rilevare 3,4-dihydroxybenzoate (34DHB) e poi applicato allo schermo per enzimi dehydratase dehydroshikimate (AsbF) presso la loro attività massimo di conversione dehydroshikimate endogena di 34DHB 14. Il concetto di base di questi studi è simile a quella di pNP-GESS, poiché pNP-GESS utilizza una variante DMPR per rilevare pNP e mostra prestazioni di alta produttività nello screening di una libreria genetica su larga scala. Tuttavia, engineering specificità può causare indesiderate falsi positivi tra i risultati, in quanto è possibile attivare l&#39;espressione giornalista da altri induttori come risultato di specificità ampliato. Pertanto, sarebbe auspicabile indagare l&#39;ortogonalità della risposta TR prima dell&#39;applicazione del TR. D&#39;altra parte, aumentando la sensibilità e la gamma dinamica del TR potrebbe compensare per la generazione di falsi positivi. Ad esempio, la sensibilità del GESS stata migliorata inserendo RBS ottimizzati e terminatore Sequrenze nel sistema. I falsi positivi del sistema di screening forse provengono dal malfunzionamento del circuito genetico, non intenzionali chimici fenolici attivando il TR, la crescita cellulare eterogenea, e la libera diffusione di fenolo o PNP. ci si aspettava 2.9 per rimuovere le cellule che rilasciano falsi positivi fluorescenza senza trattamento substrato - I processi di selezione negativi di Steps 2.1. Queste cellule falsi positivi possono essere ridotti anche massimizzando il rapporto segnale rumore del circuito genetica. Insieme con la RBS e l&#39;ingegneria di terminazione, l&#39;uso dei mezzi M9-glucosio significativamente migliorato il segnale (7 volte superiore LB media) in termini di prestazioni PNP-GESS 5. Ma, in questo protocollo, LB è stato usato come compromesso tra l&#39;ignoto espressione genica metagenomic e l&#39;intensità del segnale GESS. Indagare condizioni più delicate della crescita cellulare PNP-GESS e l&#39;effetto del substrato in M9-glucosio permette di migliorare l&#39;intensità del segnale. stretta regolazione del tempo di reazione dei substrati, nel passo 3.5, èanche importante per evitare falsi positivi innescati da fenolo o pNP diffusione. GESS permette la conversione di funzione enzimatica in espressione proteina reporter trascrizione mediata a livello di singola cellula ma l&#39;identificazione indiretta attraverso proteina reporter potrebbe essere una delle limitazioni innate. Così, in vitro enzimatica e LC analisi / GC-MS di un prodotto devono essere seguite per l&#39;identificazione precisa di un enzima candidato putativo 6,7. Inoltre è possibile utilizzare GESS senza la necessità di analisi FACS costosi collegando reporter alternativi come geni di resistenza agli antibiotici o enzimi cromogeni con reporter fluorescente. Per ulteriore miglioramento delle applicazioni GESS, è necessario stabilire un metodo per caratterizzare l&#39;attività enzimatica e identificare gli enzimi in modo high-throughput. Insieme con altre tecnologie high-throughput, come il sequenziamento di prossima generazione, GESS sarà una strategia ampiamente usato per proteine ​​e enzyMi catalizzatore di ingegneria nel settore della biologia-based.

Una tecnica saggio cella singola high-throughput recentemente sviluppato permette nuovi enzimi per essere sottoposti a screening da una libreria genetica su larga scala in base alla loro attività funzionali 1. A livello di singola cellula, proteine ​​regolatrici della trascrizione sono impiegati per attivare l&#39;espressione del gene reporter rilevando piccole molecole che sono prodotte come risultato di un&#39;attività enzima bersaglio. Un primo approccio coinvolto l&#39;isolamento di un operone fenolo-degradanti da Ralstonia eutropha E2 utilizzando l&#39;espressione genetica substrato indotta metodo di retinatura (SIGEX), in cui il substrato induce l&#39;espressione di una proteina reporter 2. Nhar di Pseudomonas putida è stato utilizzato per selezionare benzaldeide deidrogenasi 3, e LysG dal Corynebacterium glutamicum è stato utilizzato per lo screening high-throughput di un nuovo ceppo di L-lisina-produzione da diverse librerie di mutanti 4. In precedenza, un enzima screeni geneticaSistema ng (GESS) è stata proposta come una piattaforma di screening generalmente applicabile 5. Questo sistema utilizza il regolatore dimetilfenolo fenolo-riconoscimento, DMPR, di P. putida. DMPR (E135K), e un mutante di DMPR, possono anche essere impiegati in GESS (pNP-GESS) per la rilevazione di p -nitrophenol (pNP). In presenza di enzimi bersaglio producono composti fenolici, GESS in E. coli emette un segnale di fluorescenza, consentendo il rapido isolamento di singole cellule utilizzando un cell sorter fluorescenza attivate (FACS). Ma l&#39;espressione di enzima metagenomico sembra essere più debole di quella degli enzimi ricombinanti convenzionali; Pertanto, GESS è stato progettato per rilevare composti fenolici con la massima sensibilità per indagare la combinazione di ribosomiale sito di legame (RBS) e sequenze di terminazione con ottimali condizioni di funzionamento 5. Uno dei vantaggi fondamentali del GESS è che questo metodo unico permette teoricamente la proiezione di over di 200 diversi tipi di enzimi nel database BRENDA (Tabella 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) semplicemente utilizzando substrati diversi. E &#39;stato dimostrato che cellulasi, lipasi, e metil parathion idrolasi (MPH) può essere rilevato tramite PNP-GESS con substrati appropriati di p -nitrophenyl butirrato, p -nitrophenyl-cellotrioside, e parathion metile, rispettivamente, 5. Recentemente, è stato dimostrato che una fosfatasi alcalina (AP), che è uno dei nuovi enzimi identificate utilizzando pNP-GESS, è il primo AP termolabile trovato in metagenomi marini adattati freddo 6. Qui, i dettagli del processo di screening è presentato con PNP-GESS rilevare le attività di tre diversi tipi di lipasi enzymes-, cellulasi, e fosfatasi alcalina -e identificare rapidamente nuovi enzimi candidati da una libreria metagenomica 5,6. I processi includono metagenoma pre-elaborazione con PNP-GESS e la gestione di un flOW citometria sorter. Mentre dovranno essere sequenziato per ulteriore identificazione i successi ottenuti, questo protocollo riguarda la procedura fino ai gradini di conferma dell&#39;attività enzimatica citometria a flusso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td style="width:736px;">Fosmid library production kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl Induction Solution</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCIS125</td>
			<td>Fosmid copy induction solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EPI300</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">EC300110</td>
			<td>Electrocompetent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pCC1FOS</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td>Fosmid vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gene Pulser Mxcell</td>
			<td style="width:109px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Electroporation cuvette and electroporate system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">FACSAria III</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry (FACS machine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AZ100M</td>
			<td style="width:109px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">UltraSlim&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Maestrogen</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>LED illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">50-mL conical tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">14-mL round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">5-mL round-bottom tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N7653</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N5759</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl butylate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N9876&#160;</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Luria- Bertani (LB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244620</td>
			<td>Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth (SOB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244310</td>
			<td>Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>SOB, 0.4 % glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244020</td>
			<td>Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cell storage media</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:319px;">pGESS(E135K)</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:736px;">A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. 
			See the reference 5 in the manuscript for more details.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">PBS</td>
			<td style="width:109px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-enzyme screening using a high-throughput genetic enzyme screening system

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

I tre substrati fenolici sono stati esaminati per identificare gli enzimi metagenomiche nuovi da una libreria metagenoma di sedimenti piane oceaniche delle maree a Taean, Corea del Sud, seguendo il protocollo proposto. Per la costruzione della libreria, medi 30 - 40 kb sequenze metagenoma sono stati inseriti fosmidi, che si basano sul E. coli F fattore replicone e presentato come una singola copia in una cella. Si noti che fosmidi sono stati ampiamente utilizzati per la costruzione di librerie genomiche complesse a causa della loro propagazione stabile 8. La figura 1 mostra una breve diagramma di flusso del protocollo di screening compresa la rimozione di falsi positivi con ordinamento negativo (Figura 1 A) seguita da selezione positiva successo con R1 e R2 classificare porte (Figura 1 B). I risultati sono stati valutati confrontando la fluorescenza dei campioni con e senza substrati(Figura 1 C). In caso di p -nitrophenyl acetato di screening mediata, cinque candidati di lipasi sono stati confermati in cui la fluorescenza delle cellule substrato trattato era superiore a quello di cellule di controllo (Figura 2 A). Nonostante le grandi distribuzioni dei tre candidati di cellulase in figura 2 B, hanno anche mostrato evidenti differenze di intensità media FITC delle popolazioni. Quattro candidati fosfatasi anche mostrato alto livello di fluorescenza rispetto alle cellule di controllo (Figura 2 C). La più differenza di fluorescenza tra le cellule negative e il candidato più forte l&#39;attività enzimatica può dedurre dal momento che il giornalista di fluorescenza di PNP-GESS mostra risposte quantitative per le concentrazioni di fenolo 5. In questo protocollo, solo le differenze di fluorescenza sono stati confermati utilizzando un citometria a flusso, ma vari metodi di identificazione può essere applicata unas di cui al punto 4.2. La figura 3 mostra l&#39;esempio di identificazione AP 6. Un clone selezionato tra i quarantasette colonie altamente fluorescenti dallo screening è stato sequenziato e un ORF del candidato AP è stato identificato. La ORF inserito in un vettore plasmide è stato confermato di avere attività AP con citometria a flusso. In figura 3, il colpo mostra segnale di fluorescenza più forte delle cellule che portano plasmide vuoto (negativo). Ulteriori analisi di sequenza e dell&#39;attività enzimatica vitro scoperto che questo AP era altamente simile ad altri AP noti nelle sue caratteristiche enzimatiche tranne elevata attività catalitica a temperature più basse (35 ° C) e una notevole instabilità termica (65 ° C) entro 15 min 6 . Inoltre, l&#39;AP schermato era paragonabile a commercialmente disponibile AP nella rimozione di fosfati terminali di estremità coesive e smussate di linearizzato DNA plasmidico 6. Figura 1:. Multi enzima Screening Process (A) rimozione delle cellule falsi positivi che mostrano fluorescenza senza substrato. Il cancello di smistamento si trova al centro della densità di popolazione cellulare in modo che il cancello comprende il 10% delle cellule totali. (B) ordinamento alta fluorescente (FITC-A) cellule (positivi) soddisfare R1 e R2 cancelli in presenza di un idoneo substrato. (C) Dopo la selezione e l&#39;isolamento singola cella, l&#39;attività degli enzimi candidati è stata esaminata con e senza il substrato (indicato con W / e substrati W / O, rispettivamente). La differenza chiaro segnale tra i due campioni implica la fosmid vettore delle cellule bersaglio contiene le informazioni genetiche di interesse. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig2.jpg" /> Figura 2: Enzyme attività di valutazione in citometria a flusso candidati enzima metagenomiche schermati dal PnP-GESS con tre differenti substrati (A) acetato p -nitrophenyl (pNPA), (B) p -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), e. (C) fosfato fenile. Tutti i candidati mostrano differenza chiaro segnale tra le cellule con e senza supporto. I controlli sono le cellule senza il loro trattamento del substrato corrispondente. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig3.jpg" /> Figura 3: fosfatasi alcalina IDENTIFICAZIONE. Pannello di sinistra mostra la differenza di fluorescenza chiara tra le celle che contengono l&#39;enzima colpito e un vettore plasmide vuoto (negativo). Sulla destra, viene mostrato dosaggio fosfatasi delle cellule che ospitano il gene candidato fosfatasi in un vettore plasmidico su LB agar contenente 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato come substrato colorimetrico. colonie blu indicano che le celle selezionate contengono il gene codificante una metagenomic fosfatasi. Vedere 6 per maggiori dettagli. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Numero CE </td><td> Descrizione </td><td> Numero di enzimi p-nitrofenolo produzione </td><td> Numero di enzimi fenolo produzione </td></tr><tr><td> CE 1 &lt;/ Td&gt; <td> 1.3 </td><td> Agendo sul gruppo CH-CH dei donatori </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ossidoriduttasi </td><td> 1.11 </td><td> Peroxygenase </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> 1.14 </td><td> Agendo su donatori associati, con l&#39;incorporazione o </td><td rowspan="2"> - </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td></td><td> riduzione di ossigeno molecolare </td></tr><tr><td> CE 2 </td><td> 2.3 </td><td> aciltransferasi </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> transferasi </td><td> 2.4 </td><td> glicosiltransferasi </td><td> 8 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td> Trasferimento alchilici o arilici gruppi, diversi gruppi metilici </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.7 </td><td> Trasferimento di gruppi contenenti fosforo </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.8 </td><td> Trasferimento di gruppi contenenti zolfo </td><td> 3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> CE 3 </td><td> 3.1 </td><td> Legge sulle obbligazioni estere </td><td> 67 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> idrolasi </td><td> 3.2 </td><td> glicosilasi </td><td> 75 </td><td> 21 </td></tr><tr><td></td><td> 3.4 </td><td> Legge sulla legami peptidici - peptidasi </td><td> 26 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td> Legge sulla legami carbonio-azoto, diversi legami peptidici </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td></td><td> 3.6 </td><td> Legge sulla anidridi acide </td><td> 4 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 3.7 </td><td> Legge sulla legami carbonio-carbonio </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td> CE 4 </td><td> 4.1 </td><td> liasi carbonio-carbonio </td><td> - </td><td> 3 </td></tr><tr><td> liasi </td><td> 4.2 </td><td> liasi carbonio-ossigeno </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 4.3 </td><td> liasi carbonio-azoto </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="3"> il numero totale parziale di enzimi </td><td> 197 </td><td> 53 </td></tr><tr><td colspan="3"> Numero totale di enzimi (escluso enzimi sovrapposti) </td><td colspan="2"> 211 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: il numero di enzimi che producono p -nitrophenol o fenolo dal Database BRENDA.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System at JoVE.com

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Views.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate). 

Video: Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Ricerca

Biologia

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.