This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.

1. הכנת הספרייה metagenomic עם PNP-GESS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות ספריה metagenomic ב E. coli עם וקטור fosmid באמצעות ערכת ייצור הספרייה fosmid פי פרוטוקול של היצרן 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100 μl של הספרייה לאחסון ב -70 ° C, אשר מהווה מקור של תאי ספרייה metagenomic. הערה: הצפיפות האופטית של מדגם נמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD 600) של מניית ספרייה זה עומדת על כ -100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 100 μl של הספרייה metagenomic המניות על הקרח ולחסן בבקבוק 500 מ&quot;ל המכיל 50 מ&quot;ל לוריא- Bertani (LB) ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ואחריו 37 הדגירה מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במהירות 50 מ&quot;ל מים מזוקקים קרים כקרח (DW) ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילuspend גלולה ב 50 DW μl קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול. השתמש 50 μl של aliquot תא זה עבור electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התערובת של תאים electrocompetent 50 μl ו pGESS (E135K) DNA 5 (100ng) בתוך קובט electroporation קרים כקרח electroporate (1.8 ק ו / ס&quot;מ, 25 μF) את התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות 1 מ&quot;ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני ו resuspend התאים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לתוך 14 מ&quot;ל צינור מסביב לתחתית בעזרת פיפטה לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 500 μl של תאים התאושש על צלחת מרובעת LB 20 x 20 ס&quot;מ המכיל chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. דגירת צלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את מושבות באמצעות מגרד תא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל באמצעות אמצעי אחסון תא קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 °. Resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל אמצעי אחסון תא קר כקרחלהגיע OD של 600 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20 μl של תאים לאחסון ב -70 ° C. </li></ol> 2. הסרת תוצאות חיוביות שגויות מספריית metagenomic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את תאי ספריית metagenomic מניות (משלב 1.13) המכילים fosmid DNA metagenomic ו pGESS (E135K) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 μl של התאים 2 מ&quot;ל LB המכיל אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתוך שפופרת 14 מ&quot;ל מסביב לתחתית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, מפעיל את מחשב FACS ולפתוח את תוכנת FACS מחדל. השתמש בהגדרות הבאות: קוטר נחיר, 70 מיקרומטר; פינת פיזור קדימה (FSC-A) רגישות, 300 הגברת V-לוגריתמים; פינת פיזור בצד (SSC-A) רגישות, 350 הגברת V-לוגריתמים; והעמסת isothiocyanate שטח (FITC-A) רגישות, 450 הגברת V-לוגריתמים; פרמטר הסף, FSC-ערך 5. הערה: גדרות טיפוסיות מובאותעבור מכשיר FACS כפי שמופיע בטבלה של חומרים. התאם את ההגדרות עבור התקני FACS אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי ספריית metagenomic משלב 2.2 ידי הוספת 5 μl של המדגם לצינור 5 מיליליטר עגול תחתון המכיל 1 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את מדגם הספרייה מדולל על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load על לוח מחווני רכישת תוכנת FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצב אירוע 1,000 - 1,500 אירועים / sec ידי לחיצה ושליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור יומן מדורג FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור בגיליון גלובלי על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בסרגל הכלים. התאם את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש היסטוגרמה עם ספירת תאים לעומת יומן מדורג FITC-A בגיליון העבודה על ידי לחיצה על כפתור היסטוגרמה. לאחר מכן, להתאים את מתח FITC מן Cytomeכרטיסיית גדרות ter על החלון מפקח הבקרה כזה כי שיאו של ב&quot;התפלגות הפעמון הוא פחות מ -10 2-A FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור-A FSC מדורג יומן vs. ביומן FITC-העלילה על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגליון העבודה הגלובלי. הגדרת R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים כך שהשער ממוקם בין + 5% ו -5% תאים ממרכז החלוקה (תאי 10% בסך הכילו סביב הפסגה של הפעמון עקום בצורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינור אוסף המכיל 1.2 מ&quot;ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ו אמפיצילין chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל במוצא המכשיר FACS ולמיין את 10 6 תאים העונים הן R1 ו- R2 שערים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות. </li></ol> 3. הקרנת אנזים metagenomic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ממוינים (משלב 2.11) בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד עד 600 OD מגיע 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תאים למיון, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של תאים בתרבית ו מצע המתאים (אצטט -nitrophenyl p, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, או פוספט פניל) לתוך צינור 14 מ&quot;ל מסביב לתחתית בריכוז סופי של 100 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדגם שליטה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של תאים בתרבית משלב 3.2 לתוך צינור 14 מ&quot;ל מסביב לתחתית. מוסיפים את נפח זהה של PBS כמו נפח המצע בשלב 3.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של תאים (למיון) ותאי הבקרה שני צינורות 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית המכילה 1 מ&quot;ל PBS, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל תאים שליטה על tהוא טוען היציאה של FACS ולחץ על הכפתור Load בלוח המחוונים רכישת התוכנה FACS. כוונון קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec ידי שליטת כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה הגלובלי של התוכנה ולהתאים את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע על סרגל כלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג FITC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה ולקבוע R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן מצולע השער בסרגל הכלים כך פחות מ -0.1% של תאים שליליים מזוהים בתוך שער R2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצינור מלא המדגם עם צינור מדגם המיון, להתאים את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec על ידי שליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינור איסוף המכיל 0.5מיליליטר LB במוצא מכשיר FACS ולמיין את 10 4 תאי עונים הם שערי R1 ו- R2. הערה: קריטריון המיון יכול לנוע בין 0.1% עליונים עד 5% של-A FITC בשער R2. בפרוטוקול זה, תאי 1% עליונים נאספו תוצאות חיוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את דגימות 0.5 מ&quot;ל שנאספו על שתי צלחות אגר (90 מ&quot;מ צלחות פטרי) המכיל LB, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​chloramphenicol דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, לבצע סיבובים נוספים של מיון FITC-A העשרה על ידי חזרה על שלבים 3.1-3.14. </li></ol> 4. Hit בחירת אישור פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry זרימת הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהצלחת וטופחה על שלב 3.14, בחר מושבה מראה שום קרינה באמצעות בורר מושבה תחת התצפית של גל 488 ננומטר של נורת ה- LED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את המושבה שנבחר 14 מ&quot;ל roאונד תחתית שפופרת המכילה 2 מ&quot;ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין ו -12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד עד OD שלה 600 מגיע 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין צינור מסביב לתחתית 14 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של תאים בתרבית (שלב 4.1.3). הוסף מצע מתאים (תצטט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, או פוספט פניל) בריכוז סופי של 100 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקד, להוסיף תאים בתרבית 1 מ&quot;ל משלב 4.1.3 לתוך 14 מ&quot;ל צינור מסביב לתחתית ולהוסיף אותו נפח של PBS כמו נפח המצע בשלב 4.1.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של תאים שטופלו מלאה המצע עד 5 מ&quot;ל צינורות מסביב לתחתית המכילה 1 מ&quot;ל PBS, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את התאים מלאים המכיל צינור על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load בלוח מחווני רכישת תוכנת FACS. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצינור מדגם שליטה עם הצינור מדגם מטופלים המצע. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את הקרינה של שתי הקבוצות של תאים על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים לעומת ביומן מדורג-A FITC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחני אחרים כדי לאשר פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהוי נוסף של המועמדים אנזים שנבחרו, לחלץ DNA fosmid באמצעות פרו מיצוי סטנדרטיפרוצדורות מן ערכות ההפקה המסחרית ולנתח את רצף נוקליאוטידים, או לבדוק את פעילות האנזים במבחנה 6,7. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+screening+methods-biosensors.">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li><li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes.">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li><li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis.">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li><li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level.">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).</li><li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits.">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li><li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments.">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li><li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite.">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li><li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector.">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li><li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts:+application+and+engineering+for+industrial+purposes.">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li><li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product-induced+gene+expression,+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes.">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li><li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+bio-transformations+with+&#224;+la+carte+genetic+traps:+translating+dehydrochlorination+of+lindane+(gamma-hexachlorocyclohexane)+into+lacZ-based+phenotypes.">Surveying bio-transformations with &#224; la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li><li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein.">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li><li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry.">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הגדלת יעילות של biocatalysts ייצור היא מפתח להצלחה-כימי ביו מבוסס תעשיית 9 ו metagenome נחשב לאחד מקור האנזים הטבעי הטוב ביותר. במובן זה, זה הכרחי כדי הקרנת אנזימים רומן מן metagenome שבו רוב המשאבים הגנטיים לא נחקר 10. כמה שיטות הקרנה פותחו ישירות לזהות מוצרי אנזים באמצעות activators תעתיק 11, 12 אולם טכניקות אלו דורשות מערכת תעתיק המטבוליט-תגובה ספציפית. מצד שני, GESS הוא החלים רחב בהתאם לשימוש של פנול או PNP מתויג מצעים. למרות שרוב האנזימים דיווחו לייצר תרכובות פנול או PNP במאגר ברנדה (טבלה 1), (כולל שלוש דוגמאות בעבודה זו) שייכים hydrolase (מספר 3 EC) אנזימים בכיתה, לחקור מצעים פנוליות מגוונת יותר ואפילו בעיצוב מלאכותית מצע העמיד כדילמקד פעילות אנזים, כחלופות של מצעים טבעיים, יכולות להאריך את תחולת מערכת ההקרנה באופן משמעותית. שים לב בבחירת פנול מתאים או PNP מתויג מצע היא אחד הצעדים המכריעים של יישום PNP-GESS מאז חדירות הממברנה ותוצאה הסלולר של המצע באופן משמעותי להשפיע על פרוטוקול ההקרנה. כאן, אנו מראים כי חשובים בתעשייה שלושה סוגים שונים של אנזימים יכולים להיות מזוהים באופן תפוקה גבוהה באמצעות מערכת הקרנה אחת. הגישה של שימוש FACS, בנוסף הקרנת התפוקה הגבוהה של אנזימי metagenomic, יכולה לחול גם על הנדסת רגולטורים תעתיק (TRS) עבור סגוליות TR שינו. דוגמה אחת היא מחקר שבו גרסה שונה AraC כי זוהה mevalonate במקום arabinose היה מבודד באמצעות FACS, ולאחר מכן מועסקים לתאים מסך ייצור mevalonate 13. כמו כן, השינוי הספציפי של TRs אפשר Furthהנדסה אה של פעילות האנזים. Auto-מוסדר TR, PcaU, תוכנן כדי לזהות 3,4-dihydroxybenzoate (34DHB) ולאחר מכן להחיל אותו למסך אנזימי dehydratase dehydroshikimate (AsbF) ב פעילות מקסימלית שלהם של המרת dehydroshikimate אנדוגני 34DHB 14. הרעיון הבסיסי של מחקרים אלה דומים לזה של PNP-GESS, מאז PNP-GESS משתמשת גרסת DmpR לזהות PNP ומראה ביצועי תפוקה גבוהה הקרנת מספריה גנטית בקנה מידה גדולה. עם זאת, הנדסה סגולית עלולה לגרום חיוביות שגויות לא מכוונות בין הלהיטים, כיוון שהיא עלולה לעורר ביטוי כתב על ידי מעוררי אחרים כתוצאה סגולית התרחב. לכן, רצוי לחקור את אורתוגונליות של תגובת TR לפני TR מוחל. מצד שני, הגדלת רגישות וטווח דינמי של TR יכול לפצות על הדור חיובי כוזב. לדוגמה, הרגישות של GESS שופרה על ידי החדרת RBS אופטימיזציה terminator sequences לתוך המערכת. תוצאות חיוביות שגויות של מערכת ההקרנה ואולי באות תקלה של המעגל הגנטי, כימיקלים פנוליות מכוונים הפעלת TR, צמיחת תאים הטרוגנית, ודיפוזיה חינם של פנול או PNP. תהליכי הסלקציה השליליים של צעדים 2.1 - 2.9 ציפו כדי להסיר תאים חיוביים כוזבים שחרור קרינה ללא טיפול מצע. תאים חיוביים הכוזבים אלה יכולים גם להיות מופחתים על ידי למקסם את יחס האות לרעש של המעגל הגנטי. יחד עם הנדסת RBS ו terminator, השימוש במדיה M9-גלוקוז שפר בצורה משמעותית את האות (פי 7 יותר מאשר תקשורת LB) ב PNP-GESS ביצועים 5. אבל, בפרוטוקול זה, LB שימש כפשרה בין ביטוי גנים metagenomic ידוע ועוצמת אות GESS. חקירת תנאים עדינים יותר של צמיחת תאי PNP-GESS ותוצאת מצע-גלוקוז M9 מאפשרת לשפר את עוצמת האות. רגולציה הדוקה של זמן תגובה של המצעים, בשלב 3.5, היאכמו כן, חשוב למנוע תוצאות חיוביות שגויות מופעלות על ידי פנול או דיפוזיה PNP. GESS מאפשרת המרה של תפקוד האנזים לתוך ביטוי חלבון הכתב בתיווך שעתוק ברמה מתא בודד אבל זיהוי עקיף באמצעות חלבון הכתב יכול להיות אחת המגבלות המולדות. אז, ב assay האנזים במבחנה LC / GC-MS ניתוח של מוצר צריך להיות במעקב במשך לזיהוי ודאי של מועמד אנזים המשוערת 6,7. כמו כן ניתן להשתמש GESS ללא הצורך בניתוח FACS היקר על ידי הצמדה לכתבים חלופיים כגון גנים עמידים לאנטיביוטיקה או אנזימי chromogenic עם כתבי ניאון. לשיפור נוסף של יישומי GESS, יש צורך להקים שיטה לאפיין פעילות אנזים ולזהות את האנזימים באופן תפוקה גבוהה. יחד עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרים, כגון רצף של הדור הבא, GESS יהיה אסטרטגיה בשימוש נרחב עבור חלבון enzyהנדסה זרז אותי בענף מבוסס-ביולוגיה.

טכניקת assay שפותחה לאחרונה תפוקה גבוהה תא בודד מאפשרת אנזימי רומן שיוקרו מספריה גנטית בקנה מידה גדולה מבוססת על הפעילות התפקודית שלהם 1. ברמת התא הבודדה, חלבונים בויסות שעתוק מועסקים כדי לעורר ביטוי גני כתב על ידי חישת מולקולות קטנות מיוצרות כתוצאה של פעילות אנזים היעד. הגישה מוקדם אחד המעורבים את הבידוד של אופרון משפיל-פנול מ Ralstonia eutropha E2 באמצעות הביטוי הגנטי-induced המצע ההקרנה (SIGEX) שיטה, שבה המצע גורם הביטוי של עיתונאי חלבון 2. NhaR של Pseudomonas putida שמש כדי לבחור dehydrogenase benzaldehyde 3, ו LysG מ glutamicum Corynebacterium נוצל להקרנת התפוקה הגבוהה של L- ליזין-ייצור זן חדש מספרי מוטציה מגוונות 4. בעבר, screeni אנזים גנטימערכת ng (GESS) הוצעה כפלטפורמת הקרנה החלימה בדרך כלל 5. מערכת זו משתמשת רגולטור dimethylphenol הכרה-פנול, DmpR, של פ putida. DmpR (E135K), ו מוטציה של DmpR, יכול להיות מועסק גם GESS (PNP-GESS) לצורך זיהוי של p -nitrophenol (PNP). בנוכחות אנזימי יעד ייצור תרכובות פנוליות, GESS ב E. קולי תאים פולטים אותות קרינה, מה שמאפשר את הבידוד המהיר של תאים בודדים באמצעות סדרן תא מופעל פלואורסצנטי (FACS). אבל הביטוי של אנזים metagenomic שנראה חלש יותר מזו של אנזימים רקומביננטי קונבנציונליים; ולכן, תוכננה GESS לזהות תרכובות פנוליות ברגישות המקסימלית על ידי חוקר את השילוב של אתר ריבוזומלי מחייב (RBS) ורצפים terminator יחד עם תפעול אופטימלי בתנאים 5. אחד היתרונות הבסיסיים של GESS היא שיטה אחת זה תיאורטי מאפשרת הקרנת ovאה מ -200 סוגים שונים של אנזימים באתר ברנדה (טבלה 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) על ידי העסקת מצעים שונים פשוט. זה היה הראו כי cellulase, lipase, ו hydrolase parathion מתיל (MPH) ניתן לאתר באמצעות PNP-GESS עם מצעים מתאימים של בוטיראט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl-cellotrioside, ו parathion מתיל, בהתאמה 5. לאחרונה, הוכח כי phosphatase אלקליין (AP), אשר הוא אחד האנזימים רומן שזוהו באמצעות PNP-GESS, הוא AP thermolabile הראשון נמצא metagenomes ימיים קר המותאמות 6. הנה, הפרטים של תהליך המיון מוצג עם PNP-GESS גילוי הפעילויות של שלושה סוגים שונים של lipase enzymes-, cellulase, ו phosphatase אלקליין -ואז במהירות בזיהוי אנזימים מועמדים חדשים מספריה metagenomic 5,6. התהליכים כוללים עיבוד מקדים metagenome עם PNP-GESS ותפעול flow סדרן cytometry. בעוד הלהיטים המתקבלים יהיו צורך הרצף של זיהוי נוסף, פרוטוקול זה מכסה את ההליך עד מדרגות אישור פעילות אנזים באמצעות cytometry זרימה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td style="width:736px;">Fosmid library production kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl Induction Solution</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCIS125</td>
			<td>Fosmid copy induction solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EPI300</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">EC300110</td>
			<td>Electrocompetent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pCC1FOS</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td>Fosmid vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gene Pulser Mxcell</td>
			<td style="width:109px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Electroporation cuvette and electroporate system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">FACSAria III</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry (FACS machine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AZ100M</td>
			<td style="width:109px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">UltraSlim&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Maestrogen</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>LED illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">50-mL conical tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">14-mL round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">5-mL round-bottom tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N7653</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N5759</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl butylate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N9876&#160;</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Luria- Bertani (LB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244620</td>
			<td>Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth (SOB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244310</td>
			<td>Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>SOB, 0.4 % glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244020</td>
			<td>Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cell storage media</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:319px;">pGESS(E135K)</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:736px;">A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. 
			See the reference 5 in the manuscript for more details.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">PBS</td>
			<td style="width:109px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-enzyme screening using a high-throughput genetic enzyme screening system

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

השלושה המצעים פנוליות נבחנו לזהות אנזימי metagenomic רומן מספריה metagenome של משקעים שטוחים גאות אוקיינוס ​​Taean, דרום קוריאה על ידי ביצוע הפרוטוקול המוצע. לבניית הספרייה, ממוצע 30 - 40 רצפי metagenome kb הוכנסו fosmids, אשר מבוססים על E. coli F replicon גורם והציג כעותק יחיד בתא. שים לב fosmids היה בשימוש נרחב לבניית ספריות גנומית מורכבת בשל התפשטות 8 היציבה שלהם. איור 1 מציג תרשים זרימה קצרה של פרוטוקול ההקרנה כוללת הסילוק של תוצאות חיוביות שגוי עם מיון שלילי (איור 1 א) ואחריו מבחר להיט חיובי עם R1 ו- R2 מיון שערים (איור 1 ב &#39;). הלהיטים הוערכו על ידי השוואת הקרינה של הדגימות עם ובלי מצעים(איור 1 ג). במקרה של הקרנה בתיווך יצטט p -nitrophenyl, חמישה מועמדים של lipase אושרו שבו הקרינה של תאים שטופלו מצע הייתה גבוהה מזו של תאים מלאים (איור 2 א). למרות ההפצות הרחבות של השלושה המועמדים של cellulase באיור 2 ב &#39;, הם גם הראו הבדלים מובהקים של עוצמת FITC הממוצעת של האוכלוסיות. ארבעה מועמדים phosphatase גם הראה רמת הקרינה גבוהה בהשוואה לתאי הביקורת (איור 2 ג). ההבדל קרינה יותר בין תאים שליליים ומועמד פעילות האנזים החזקה ניתן להסיק מאז כתב הקרינה של PNP-GESS תערוכות תגובות כמוני הריכוזים פנול 5. בפרוטוקול זה, רק את ההבדלים הקרינה אוששו באמצעות זרימת cytometry אבל מבחני זיהוי שונים ניתן ליישם<html> שעות כאמור בשלב 4.2. איור 3 מדגים את הדוגמה של AP זיהוי 6. שיבוט שנבחר בין ארבעים ושבע מושבות פלורסנט מאוד מההקרנה היה רצף ו ORF של המועמד AP זוהה. ORF מוכנס לתוך וקטור הפלסמיד אושר לקיים פעילות AP עם cytometry זרימה. באיור 3, להיט תערוכות אותות קרינה חזקים יותר מאשר תאי נושאים פלסמיד ריק (שלילית). ניתוח נוסף של רצף בפעילות האנזימטית במבחנה גילה כי AP זה היה דומה במידה רבה לזה נקודות גישה ידועות אחרות במאפייניו האנזימטית למעט פעילות קטליטית גבוהה בטמפרטורות נמוכות (35 מעלות צלזיוס) לבין יציבות תרמית מדהימה (65 מעלות צלזיוס) תוך 15 דקות 6 . בנוסף, סוכנות ידיעות AP הוקרן הייתה דומה זמינה מסחרי נקודות גישת הסרת פוספטים מסוף מקצוות מלוכדים ובוטים של DNA פלסמיד לינארית 6. דק-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig1.jpg" /> איור 1:. תהליך מיון אנזים Multi (א) הסרת תאים חיוביים שגויים מראים קרינה בלי מצע. שער המיון ממוקם באמצע צפיפות אוכלוסיית תאים כך שהשער כולל 10% של התאים הכוללים. (ב) מיון ניאון גבוהה (FITC-A) תאים (חיובי) סיפוק שערים R1 ו- R2 בנוכחות מצע מתאים. (ג) לאחר הבחירה ובידוד תא בודד, את הפעילות של האנזימים המועמדים נבדקת עם ובלי המצע (מסומן כמו W / מצעי W / O, בהתאמה). הבדל האיתות הברור בין שני המדגמים מרמז וקטור fosmid של התאים מכיל מידע גנטי יעד של עניין. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig2.jpg" /> איור 2: הערכת פעילות אנזים שימוש cytometry זרימה מועמדים אנזים metagenomic הוקרן ידי PNP-GESS עם שלושה מצעים שונים (א) אצטט p -nitrophenyl (pNPA), (ב) p -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), ו. (C) פוספט פניל. כל המועמדים להראות הבדל איתות ברור בין תאים עם ובלי מצע. פקדים הם התאים ללא טיפול המצע המתאים להם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig3.jpg" /> איור 3: אני phosphatase אלקלייןdentification. לוח שמאלי מציג הבדל קרינה הברור בין התאים המכילים את האנזים פגע וקטור פלסמיד ריק (Negative). מימין, assay phosphatase של תאים מחסה הגן המועמד phosphatase ב וקטור פלסמיד על אגר LB המכיל פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl כמו מצע colorimetric מוצג. מושבות כחולות עולות כי התאים שנבחרו המכילים את גן metagenomic קידוד phosphatase. ראה 6 לקבלת פרטים נוספים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מספר EC </td><td> תיאור </td><td> מספר אנזימים לייצור p-nitrophenol </td><td> מספר אנזימים לייצור פנול </td></tr><tr><td> EC 1 &lt;/ Td&gt; <td> 1.3 </td><td> ממלא מקום על קבוצת CH-CH של תורמים </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Oxidoreductases </td><td> 1.11 </td><td> Peroxygenase </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> 1.14 </td><td> ממלא מקום על תורמים לזווג, עם התאגדות או </td><td rowspan="2"> - </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td></td><td> הפחתה של חמצן מולקולרי </td></tr><tr><td> EC 2 </td><td> 2.3 </td><td> Acyltransferases </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> טרנספראז </td><td> 2.4 </td><td> Glycosyltransferases </td><td> 8 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td> קבוצות אלקיל או aryl העברה, למעט קבוצות מתיל </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.7 </td><td> העברת קבוצות המכילים זרחן </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.8 </td><td> העברת קבוצות המכילות גופרית </td><td> 3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EC 3 </td><td> 3.1 </td><td> חוק על אג&quot;ח אסתר </td><td> 67 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Hydrolases </td><td> 3.2 </td><td> Glycosylases </td><td> 75 </td><td> 21 </td></tr><tr><td></td><td> 3.4 </td><td> חוק על קשרים פפטידיים - peptidase </td><td> 26 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td> חוק על קשרי פחמן-חנקן, למעט אג&quot;ח פפטיד </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td></td><td> 3.6 </td><td> חוק על אנהידריד חומצה </td><td> 4 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 3.7 </td><td> חוק על קשרי פחמן-פחמן </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td> EC 4 </td><td> 4.1 </td><td> lyases פחמן-פחמן </td><td> - </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Lyases </td><td> 4.2 </td><td> lyases פחמן-חמצן </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 4.3 </td><td> lyases פחמן-חנקן </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="3"> מספר סיכום ביניים של אנזימים </td><td> 197 </td><td> 53 </td></tr><tr><td colspan="3"> סה&quot;כ אנזימים (למעט אנזימי חפיפה) </td><td colspan="2"> 211 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: מספר אנזימים המייצרים p -nitrophenol או פנול ממסד הנתונים ברנדה.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System at JoVE.com

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate). 

Video: Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס