This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.

1. PnP-gess ile Metagenomic Kütüphane Hazırlama <ol><li> E. bir metagenomic kütüphane inşa E. coli, bir Fosmid vektör ile üreticinin protokolüne 5&#39;e göre bir Fosmid kitaplığı üretimi kiti kullanılarak. </li><li> Kısım metagenomic kütüphanesi bir hücre kaynağıdır, -70 ° C&#39;de, önceki depolama için kütüphane 100 ul. Not: Bu kütüphane stokunun 600 nm (OD 600) arasında bir dalga uzunluğunda ölçülen bir numunenin optik yoğunluğu yaklaşık 100&#39;dür. </li><li> Buz üzerinde hazır metagenomic kütüphane 100 ul çözülme ve 50 ml Luria-Bertani (LB) ve 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de kuluçkalandı ve ardından 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 500 ml&#39;lik bir şişe içinde inoküle. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüj ile 50 ml konik bir tüp içinde hücreler hasat edilir. </li><li> Yine, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de 50 ml buz gibi soğuk damıtılmış su (DW) ve santrifüj hızlı pelletini. </li><li> Res% 10 (h / h) gliserol, 50 ul buz soğukluğunda DW pelet uspend. Elektroporasyon için, bu hücre kısım 50 ul kullanın. </li><li> Buz soğukluğundaki bir elektroporasyon küvetine ve elektroporasyona (1.8 kV / cm, 25 mF) karışım elektro uyumlu hücre 50 ul pGESS (E135K) 5 DNA (100ng) karışımı yerleştirin. </li><li> Hızla katabolik baskı (SOC) orta süper optimum suyu 1 ml ekleyin ve hafifçe hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> bir pipet kullanılarak 14 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe hücreleri aktarın ve 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 12.5 ug / ml kloramfenikol ve 50 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB 20 x 20 cm kare plaka elde edilen hücreler 500 ul yayıldı. 12 saat boyunca 30 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Bir hücre kazıyıcı kullanarak koloniler kazıyın ve buz gibi soğuk hücre depolama ortamı kullanarak bir 50 ml konik tüp içine hücreleri toplamak. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. 10 ml buz gibi soğuk hücre depolama ortamı pelletiniBir OD 100 600 ulaşmak için. </li><li> Kısım -70 ° C&#39;de depolama için hücreler 20 ul. </li></ol> 2. Metagenomic Kitaplığı&#39;ndan Yanlış Pozitif Çıkarma <ol><li> buz üzerinde metagenomic DNA fosmid ve pGESS (E135K) içeren (Kademe 1.13 den) stok metagenomic kütüphane hücreleri çözülme. </li><li> 14 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir tüp içinde 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren 2 ml LB içinde hücre 10 ul inoküle. 4 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu arada, FACS makine açmak ve varsayılan FACS yazılımını açın. aşağıdaki ayarları kullanın: meme ucu çapı, 70 um; İleri Yayılım Alanı (FSC-A) duyarlılık, 300 V-logaritmik büyütme; Yan Dağılım Alanı (SSC-A) duyarlılık, 350 V-logaritmik büyütme; Floresein izotiosiyanat Konum (FITC-A) hassasiyeti, 450 V logaritmik amplifikasyonu; eşik parametresi, FSC değeri 5. Not: Normal ayarlar verilmiştirMalzemelerin Tablo belirtilen FACS cihaz için. Diğer FACS cihazlar için ayarları yapın. </li><li> 1 ml PBS ihtiva eden bir 5-ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir tüpe örnek 5 ul ekleyerek Aşama 2.2 metagenomic kütüphanesi hücreleri seyreltilir. </li><li> FACS enstrüman yükleme noktası üzerine seyreltilmiş kütüphane örnek yerleştirin ve FACS yazılım kazanılması Dashboard&#39;daki Yükle düğmesini tıklayın. </li><li> tıklayıp gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 1,500 olaylar - 1000 olay hızını ayarlayın. </li><li> Günlük araç çubuğunda Dot Plot butonuna tıklayarak bir küresel çalışma sayfasında SSC-A dağılım arsa ölçekli vs günlüğü oluşturmak FSC-A ölçekli. araç çubuğundaki Poligon Kapısı düğmesini kullanarak tekli olayları (bakteriyel nüfus) kapsayacak şekilde dağılım kapısı R1 ayarlayın. </li><li> Günlük Histogram butonuna basarak çalışma sayfasındaki FITC-A ölçekli vs hücre sayımı ile bir histogram çizilir. Daha sonra, Cytome FITC gerilimini ayarlamakÇan-şekilli dağıtım pik FITC-A 10 daha az 2 olacak şekilde Müfettiş Kontrol penceresinden ter Ayarlar sekmesi. </li><li> Vs bir günlük ölçekli FSC-A oluşturun. Günlük FITC Küresel bir çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak arsa. kapı çan zirve etrafında dağılımının merkezine (toplam% 10 hücrelerinden +% 5 ve% -5 hücreleri arasında yer alır, böylece araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 Set şeklinde eğri). </li><li> 1.2 mi LB FACS aletin çıkışında 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren ve R1 ve R2, kapılar hem tatmin sıralamak 10 6 hücre ihtiva eden bir toplama tüpü yerleştirin. </li><li> toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın. </li></ol> 3. Metagenomic Enzim Eleme <ol><li> 600 0,5 ulaşana OD kadar 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de (Kademe 2.11) kriteri hücreleri inkübe edin. </li><li> 1 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 3 saat inkübe hücreleri. </li><li> Nihai konsantrasyonda 14 ml&#39;lik bir yuvarlak tabanlı tüp içine 0.5 kültürlenmiş hücrelerin üzerine ilave edildi ve uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin, sıralama için hücrelerin hazırlanması için 100 uM. <ol><li> Kontrol grubu için, 14 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir tüp içine Aşama 3.2 kültürlenmiş hücreler 0.5 ml ekleyin. Adım 3.3 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin. </li></ol></li><li> 3 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de iki örnek inkübe edin. </li><li> Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makineyi hazırlamak. </li><li> sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden iki adet 5 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı tüpe (sıralama) hücreleri ve kontrol hücreleri 5 ul ekle. </li><li> Kontrol hücreleri t üzerine içeren tüp yerleştirinO FACS limanını yükleme ve FACS yazılım kazanılması Dashboard&#39;daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3000 olayları - 1000 olay Hızı ayarlayın. </li><li> Günlük yazılımının küresel çalışma sayfasındaki Dot Plot butonuna tıklayarak ve tekli olayları kapsayacak şekilde (bakteriyel nüfus) dağılım kapısı R1 ayarlamak üzerinde Poligon Kapısı düğmesini kullanarak SSC-A dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli araç çubuğu. </li><li> Günlük araç çubuğunda Poligon Kapısı düğmesini kullanarak arsa üzerinde bir sıralama kapısı R2 çalışma sayfasında Nokta Arsa düğmesini tıklayarak ve set tarafından FITC bir dağılım arsa ölçekli vs oluşturma günlük FSC-A ölçekli böylece daha az% 0.1 negatif hücrelerin R2 kapısı içinde tespit edilir. </li><li> sıralama örnek tüpü ile kontrol örneği tüpü değiştirin ve 1000 olay hızını ayarlamak - gösterge paneli üzerinde Debisi düğmelerini kontrol ederek / sn 3,000 olaylar. </li><li> 0.5 içeren bir toplama tüpü yerleştirinml FACS enstrüman çıkışında LB hem R1 ve R2 kapıları tatmin sıralamak 10 4 hücreleri. Not: sıralama kriteri R2 kapısı FITC-A&#39;nın üst% 0.1 ile% 5 arasında değişebilir. Bu protokolde, üst% 1 hücreleri pozitif olarak toplanmıştır. </li><li> toplama tüpü, kap, ve yavaşça vorteks çıkarın. </li><li> LB, 50 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren agar plakaları, iki (90 mm&#39;lik Petri kaplara) üzerine 0.5 mL toplanan numuneleri yayıldı ve bir gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> Gerekirse, adımları 3,1-3,14 yineleyerek FITC bir zenginleşme için sıralama ek mermi gerçekleştirin. </li></ol> 4. Hit Seçme ve Enzim Aktivitesi Onay <ol><li> Flow sitometri analizi <ol><li> Adım 3.14 inkübe plakadan, bir LED aydınlatıcı 488 nm dalga boyundaki gözetiminde bir koloni seçiciyi kullanarak hiçbir floresan gösteren bir koloni seçin. </li><li> 14 mi ro seçilen koloni inoküleund altlı 2 mi LB 600 0.5 ulaşana onun OD kadar 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 50 ug / ml ampisilin ve 12.5 ug / ml kloramfenikol içeren içeren tüp. </li><li> 2 ul hücre içi fosmid kopya sayısını yükseltmek için indüksiyon kopyalama çözümüdür ekleyin. 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de ek bir 3 saat inkübe hücreleri. </li><li> 14 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir tüp hazırlanır ve kültürlenmiş hücrelerde (Aşama 4.1.3) 1 ml ekleyin. 100 uM&#39;lik bir son konsantrasyonda uygun bir alt tabaka (p-nitrofenil asetat, s -nitrophenyl- β-D-selobiosidi ya da fenil fosfat) ekleyin. <ol><li> Bir kontrol için, bir 14 ml yuvarlak tabanlı tüp içine Adım 4.1.3 den 1 ml kültür hücreleri ekleyin ve Adım 4.1.4 substrat hacmi olarak aynı hacimde PBS ekleyin. </li></ol></li><li> 3 saat 200 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de iki örnek inkübe edin. </li><li> Bu arada, Adım 2.3 ile aynı konfigürasyona sahip FACS makinesi hazırlamak. </li><li> sırasıyla 1 ml PBS ihtiva eden 5 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir tüplere kontrolü ve alt-tabaka ile muamele edilmiş hücreler içinde 5 ul ekle. </li><li> FACS cihazın yükleme noktası üzerinde tüp içeren kontrol hücrelerini koyun ve FACS yazılım kazanılması Dashboard&#39;daki Yükle düğmesini tıklayın. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın. </li><li> FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın. </li><li> Alt tabaka tedavi numune tüpü ile kontrol numunesi tüpünü değiştirin. Ön paneldeki Debisi düğmelerini kullanarak 3000 olayları / sn - 1000 olay hızını ayarlayın. </li><li> FITC-A ölçmek için Edinme butonuna tıklayın. </li><li> Günlük FITC-A ölçekli vs hücre sayımı bir histogram çizerek hücrelerin iki grup floresan karşılaştırın. </li></ol></li><li> Diğer deneyler, enzim etkinliğini doğrulamak için <ol><li> Seçilen enzim adayların daha tanımlaması için, standart ekstraksiyon pro kullanarak fosmid DNA ayıklamakTicari ekstraksiyon kitleri prosedürleri ve nükleotid sekansı analiz veya in vitro enzim aktivitesi 6,7 test edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+screening+methods-biosensors.">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li><li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes.">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li><li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis.">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li><li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level.">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).</li><li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits.">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li><li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments.">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li><li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite.">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li><li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector.">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li><li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts:+application+and+engineering+for+industrial+purposes.">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li><li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product-induced+gene+expression,+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes.">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li><li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+bio-transformations+with+&#224;+la+carte+genetic+traps:+translating+dehydrochlorination+of+lindane+(gamma-hexachlorocyclohexane)+into+lacZ-based+phenotypes.">Surveying bio-transformations with &#224; la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li><li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein.">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li><li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry.">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biyokatalizörler üretim verimliliğinin arttırılması en doğal enzim kaynaklarından biri olarak kabul edilir sanayi 9 ve metagenome bazlı biyo-kimyasal başarısı için bir anahtardır. Bu anlamda, bu genetik kaynakları çoğunluğu 10 keşfedilmemiş olan metagenome elde edilen yeni enzimler tarama için gereklidir. Çeşitli tarama yöntemleri doğrudan kopyalama etkinleştiricileri 11, 12 kullanılarak enzim ürünlerinin tespit geliştirilmiştir, fakat bu teknikler, belirli metabolit duyarlı transkripsiyon sistemi gerektirir. Öte yandan, GESS fenol veya PNP substratlar etiketli kullanımına bağlı olarak geniş çapta uygulanabilir. BRENDA veritabanında (bu çalışmada üç örnekte de dahil olmak üzere) (Tablo 1), fenol veya pnp bileşikleri üreten bildirilen enzimlerin çoğu hidrolaz ait olsa da (AK numarası 3) sınıf enzimler, daha çeşitli fenolik substratları keşfetmek ve hatta yapay tasarımı alt-tabaka tabi tutularakDoğal substratların alternatifleri, önemli ölçüde tarama sisteminin uygulanabilirliğini genişletmek olabilir gibi, enzim aktivitesini hedef. Uygun bir fenol seçerek veya PnP substratı etiketli tarama protokolü etkileyen önemli substrat zarının geçirgenliğini ve hücresel etkisi beri PnP-GESS uygulamasının önemli adımlardan biri olduğunu unutmayın. Burada, enzimlerin endüstriyel önemi üç farklı tip, tek bir tarama sistemini kullanan bir yüksek verimli bir şekilde tespit edilebileceğini göstermektedir. FACS kullanılarak yaklaşımı, metagenomic enzimlerin yüksek verimli tarama ek olarak, aynı zamanda değiştirilmiş TR özgüllük için transkripsiyonel düzenleyici (TR&#39;ler) mühendislik uygulanabilir. Bir örnek yerine arabinoz mevalonat tespit bir Ara varyant FACS kullanılarak izole ve daha sonra mevalonat 13 üreten ekran hücrelere istihdam edildiği bir çalışmadır. Ayrıca, TRs&#39;nin özgüllük değiştirilmesi Furth için izin verdienzim aktivitesinin er mühendisliği. Otomatik düzenlenir TR PcaU, 3,4-dihidroksibenzoat (34DHB) tespit etmek için tasarlanmış ve 34DHB 14 endojen dehydroshikimate dönüştürme maksimum etkinliğine dehydroshikimate dehidrataz enzimler (AsbF) taranması için uygulanmıştır. Pnp-GESS PnP tespit etmek için bir DmpR varyantı kullanılır ve geniş çaplı bir genetik kütüphaneden eleme yüksek verimli performans gösterir, bu çalışmalar temel kavram, PNP-gess ile verilene benzer. o genişlemiş özgüllük sonucunda diğer teşvik ediciler tarafından muhabir ifade tetiklemek için mümkün olduğu gibi Ancak, özgüllük mühendisliği, hit arasında istenmeyen yanlış pozitif neden olabilir. Bu nedenle, TR uygulanmadan önce TR yanıt ortogonalite araştırmak için arzu edilir. Öte yandan, duyarlılık ve TR dinamik aralığını artırarak yanlış pozitif nesil telafi olabilir. Örneğin, gess duyarlılığı optimize RBS ve terminatör dizisine sokulmasıyla iyileştirildisisteme referanslarınıza. tarama sisteminin yanlış pozitif muhtemelen genetik devrenin arıza gelen, TR, heterojen hücre büyümesini ve fenol ya da PnP serbest difüzyon aktive istenmeyen fenolik kimyasallar. Adımlar 2.1 negatif seçim süreçleri - 2.9 substrat tedavi olmadan floresan bırakmadan yanlış pozitif hücreleri çıkarmak bekleniyordu. Bu sahte pozitif hücreler genetik devresinin sinyal gürültü oranını en üst düzeye azaltılabilir. RBS ve terminatör mühendisliği, M9-glikoz medya kullanımı ile birlikte önemli ölçüde PnP-GESS performans 5 (LB ortamı daha yüksektir 7 kat) sinyali geliştirilmiş. Ama, bu protokolde, LB bilinmeyen metagenomic gen ifadesi ve GESS sinyal yoğunluğu arasında bir uzlaşma olarak kullanılmıştır. M9-glukoz PnP-GESS hücre büyümesi ve alt tabaka etkisi daha hassas koşullarını araştıran sinyal yoğunluğunu artırmak için olanak sağlar. Aşama 3.5 substratların reaksiyon süresi sıkı regülasyonu, olduğuAyrıca önemli fenol ya da PnP difüzyon tarafından tetiklenen yanlış pozitif önlemek için. GESS tek hücre düzeyinde transkripsiyon aracılı raportör protein ekspresyonu Enzimin fonksiyonunun dönüşümü sağlar, ancak raportör protein ile dolaylı tanımlama doğuştan gelen kısıtlamalar biri olabilir. Bu nedenle, in vitro enzim tahlili ve ürün LC / GC-MS analizi, varsayılan bir enzim aday 6,7 kesin tanımlanması için takip edilmesi gerekir. Ayrıca antibiyotik direnç genleri veya floresan gazetecilere kromojenik enzimler gibi alternatif muhabir takılarak pahalı FACS analizi için gerek kalmadan gess kullanmak mümkündür. GESS uygulamalarının daha da iyileştirilmesi için, enzim aktivitesinin karakterize edilmesi ve bir yüksek verimli bir şekilde enzimler tespit etmek için bir yöntem geliştirmek gereklidir. Bu tür yeni nesil dizileme gibi diğer yüksek verimlilik teknolojileri ile birlikte, GESS protein ve ENZY için yaygın olarak kullanılan bir strateji olacaktırbiyoloji tabanlı endüstride beni katalizör mühendisliği.

Son yıllarda geliştirilmiş olan, yüksek verimli tek hücreli deney tekniği yeni bir enzim işlevsel etkinlikler 1&#39;e göre büyük ölçekli genetik kütüphaneden taranabilir sağlar. tek hücre düzeyinde, transkripsiyon düzenleyici proteinler, bir hedef enzim etkinliğinin bir sonucu olarak üretilen küçük molekülleri algılayarak raportör gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılır. Buna bir yaklaşım, alt-tabaka bir raportör protein 2 ekspresyonunu indükler formül (SIGEX) yöntemini tarama alt-tabaka ile indüklenen gen ekspresyonunu kullanarak, Ralstonia eutropha E2 bir fenol-bozucu operonun izole çıkıyor. Pseudomonas putida NhaR benzaldehid dehidrojenazı 3 seçmek için kullanılır, ve Corynebacterium glutamicum LysG çeşitli mutant kütüphaneler 4 yeni bir L-Lizin üreten soyun yüksek verimli tarama kullanılmıştır. Daha önce, bir genetik enzim screening sistemi (GESS) bir genel uygulanabilir bir tarama platformu 5 olarak önerilmiştir. Bu sistem P., DmpR fenol-tanıma dimetilfenol regülatör kullanır putida. DmpR (E135K) ve DmpR bir mutant, S. nitrofenolu (PNP) saptanması için gess (PNP-GESS) &#39;de kullanılabilmektedir. Fenolik bileşikleri üreten hedef enzimlerin varlığında, GESS E. coli hücreleri bir floresan-aktive edilmiş hücre ayırıcı (FACS) kullanılarak, tek hücrelerin hızlı izole edebilecek, bir floresan sinyali verir. Ancak metagenomic enzimin ekspresyonu geleneksel rekombinant enzimlerin daha zayıf görünmektedir; Bu nedenle, GESS uygun çalışma durumunda 5 ile birlikte ribozomal bağlanma yeri (RBS) ve terminatör dizileri ve kombinasyonunu araştırırken en fazla hassasiyet fenolik bileşikleri tespit etmek için tasarlanmıştır. Gess temel avantajlarından biri bu tek yöntem teorik olarak ov taranmasını izin vermesidirBRENDA veritabanında enzimlerin er 200&#39;den fazla farklı türleri (Tablo 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) sadece farklı substratlar kullanılarak. O selülaz lipaz gördü ve metil paration hidrolaz (MPH) p-nitrofenil butirat, p-nitrofenil-cellotrioside ve metil paration, sırasıyla, 5, uygun substratlann PNP-gess kullanılarak tespit edilebilir. Son zamanlarda, bu PnP-gess kullanılarak tanımlanan yeni enzim biri bir alkalin fosfataz (AP), soğuğa uyarlanmış deniz metagenomes 6&#39;da bulunan ilk termal olarak AP olduğu kanıtlanmıştır. Burada tarama işleminin detayları PnP-GESS bir metagenomic kütüphane 5,6 arasında yeni aday enzimleri belirlenmesi hızlı enzimleri, lipaz, selülaz ve alkalin fosfataz, üç farklı türde aktivitelerini tespit -ve sunulmuştur. süreçler metagenome PnP-gess ile önişleme ve bir fl işletim dahilsitometri sıralayıcı ow. Elde edilen isabetleri fazla tanımlama için dizilenmiştir gerekir ise, bu protokol akış sitometrisi kullanılarak enzim aktivitesi onay işlemine prosedürünü kapsamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td style="width:736px;">Fosmid library production kit&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CopyControl Induction Solution</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCIS125</td>
			<td>Fosmid copy induction solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">EPI300</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">EC300110</td>
			<td>Electrocompetent cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pCC1FOS</td>
			<td style="width:109px;">Epicentre</td>
			<td style="width:88px;">CCFOS110</td>
			<td>Fosmid vector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Gene Pulser Mxcell</td>
			<td style="width:109px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Electroporation cuvette and electroporate system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">FACSAria III</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry (FACS machine)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">AZ100M</td>
			<td style="width:109px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Microscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">UltraSlim&#160;</td>
			<td style="width:109px;">Maestrogen</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>LED illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">50-mL conical tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">14-mL round-bottom tube&#160;</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">5-mL round-bottom tube</td>
			<td style="width:109px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl phosphate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N7653</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl &#946;-D-cellobioside</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N5759</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">p-nitrophenyl butylate</td>
			<td style="width:109px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">N9876&#160;</td>
			<td>Substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Luria- Bertani (LB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244620</td>
			<td>Tryptone 10g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 10g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth (SOB)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244310</td>
			<td>Tryptone 20g/L, Yeast extract 5g/L, Sodium Chloride 0.5g/L, Magnesium Sulfate 2.4g/L, Potassium Chloride 186mg/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>SOB, 0.4 % glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)</td>
			<td style="width:109px;">BD Difco</td>
			<td style="width:88px;">244020</td>
			<td>Pancreatic digest of Casein 16g/L, Yeast extract 10g/L, Yeast extract 5g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Cell storage media</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>2xYT broth, 15 % Glycerol, 2 % Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:319px;">pGESS(E135K)</td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:736px;">A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. 
			See the reference 5 in the manuscript for more details.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:109px;">Sigma</td>
			<td style="width:88px;">A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:319px;">BD FACSDiva</td>
			<td style="width:109px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:319px;">PBS</td>
			<td style="width:109px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">70011-044</td>
			<td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-enzyme screening using a high-throughput genetic enzyme screening system

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

Üç fenolik yüzeyler önerilen protokol takip ederek Taean&#39;ın, Güney Kore okyanus gelgit düz çökellerin bir metagenome kütüphanesinden yeni metagenomic enzimleri belirlemek için incelenmiştir. Kütüphane yapımı için ortalama 30-40 kb metagenome dizileri E. dayanmaktadır fosmids içine yerleştirildi E. coli K faktörü replikon ve bir hücrenin tek bir kopya olarak sunulmuştur. Fosmids yaygın nedeniyle sabit bir yayılma 8 karmaşık genomik kütüphaneler oluşturmak için kullanılmış olduğunu not edin. Şekil 1 negatif sıralama ile yanlış pozitif kaldırılması R1 ve R2 kapıları (Şekil 1 B) sıralama ile pozitif hit seçimi takiben (Şekil 1 A) da dahil olmak üzere tarama protokolü kısa bir akış şemasını göstermektedir. vurur ve yüzeylerde olmadan numunelerin floresan karşılaştırılarak değerlendirildi(Şekil 1 C). Alt-tabaka muamele edilmiş hücrelerin floresans kontrol hücreleri (Şekil 2 A) göre daha fazla olduğu p-nitrofenil asetat dolayımlı tarama durumunda, lipaz beş aday doğrulanmıştır. Şekil 2 B selülaz üç aday geniş dağılımları rağmen, onlar da nüfus ortalama FITC yoğunluğu belirgin farklılıklar göstermiştir. Dört fosfataz adaylar da kontrol hücreleri (Şekil 2 C) ile karşılaştırıldığında yüksek floresan seviyesini göstermiştir. Güçlü enzim aktivitesi PnP-gess floresan muhabiri beri çıkarılabilir olumsuz ve aday hücreler arasında daha fazla floresan farkı fenol konsantrasyonları 5 nicel tepkilerini gösterir. Bu protokol, tek flüoresan fark sitometri akışı ile teyit edilmiştir, ancak farklı işaretlerle deneyleri, uygulanabilirAdım belirtilen s 4.2. Şekil 3 AP kimlik 6 örneğini göstermektedir. tarama 40-7 derece floresan koloniler arasında seçilen bir klon dizildi ve aday AP bir ORF tespit edilmiştir. bir plasmid vektöre yerleştirilir ORF akış sitometrisi AP etkinliğe sahip olduğu teyit edilmiştir. Şekil 3&#39;te, isabet boş plazmid (negatif) taşıyan hücrelerin daha güçlü floresan sinyalini göstermektedir. Dizisinin ve in vitro enzimatik aktivite daha fazla analizi, bu AP düşük sıcaklıklarda yüksek katalitik aktivite (35 ° C) ve 15 dakika ila 6 olan, önemli bir termal instabilite (65 ° C) hariç enzimatik özelliklerindeki diğer bilinen AP çok benzer olduğunu keşfettik . Buna ek olarak, elenmiş AP doğrusallaştırılmış plazmid DNA 6 yapışkan ve küt uçlar terminal fosfat giderilmesinde piyasada bulunan AP karşılaştırılabilir. Şekil 1:. Alt-tabaka olmadan floresan gösteren yanlış pozitif hücrelerin çoklu enzim Tarama Proses (a) çıkarılması. Kapı toplam hücrelerin% 10 içerir, böylece ayırma kapısı hücre popülasyonu yoğunluğunun ortasında yer alır. Uygun bir alt-tabakanın mevcudiyetinde, R1 ve R2, kapılar karşılayan (b) yüksek floresan Sıralama (FITC-A) (pozitif) hücreleri. (C) seçimi ve tek bir hücre izolasyonu sonra aday enzimlerin aktivitesi ve tabaka olmadan incelendiğinde (sırasıyla, W olarak belirtilir ve / W / O yüzeyler). İki örnek arasındaki net bir sinyal farkı hücrelerinin Fosmid vektör ilgi hedef genetik bilgiyi içerir anlamına gelir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </p&gt; <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig2.jpg" /> Şekil 2: Enzim Aktivitesi Değerlendirme Akış Sitometri kullanılarak, üç farklı alt-tabaka (A) p-nitrofenil asetat (pNPA), (B) p-nitrofenil-β-D-selobiosidi (pNPG2) ile PnP-gess ile taranmıştır Metagenomic enzim adayları. (c) fenil fosfattır. Tüm adaylar ile ve substrat olmaksızın hücreler arasındaki net bir sinyal farkı göstermek. Kontroller bunlara karşılık gelen substrat tedavi olmadan hücrelerdir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54059/54059fig3.jpg" /> Şekil 3: Alkalen Fosfataz Iters düşer. Sol panel hit enzim ve boş plazmid vektörü (Negatif) içeren hücreler arasındaki net floresan farkı gösterir. Sağ tarafta, bir kolorimetrik alt-tabaka olarak 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat ihtiva eden LB agar üzerine bir plasmid vektörü içinde fosfataz aday gen taşıyan hücrelerin fosfataz tahlili gösterilmiştir. Mavi koloniler seçilir hücreler fosfataz kodlayan metagenomic geni içerdiğini göstermektedir. Daha fazla ayrıntı için 6 Bkz. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> EC Numarası </td><td> Açıklama </td><td> P-nitrofenol üreten enzimlerin No </td><td> Fenol üreten enzimlerin No </td></tr><tr><td> EC 1 &lt;/ Td&gt; <td> 1.3 </td><td> donörlerin CH-CH grubunun üzerine harekete </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> oksidoredüktazlar </td><td> 1.11 </td><td> Peroxygenase </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> 1.14 </td><td> dahil edilmesi ile, eşleştirilmiş donörlerin üzerine harekete veya </td><td rowspan="2"> - </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td></td><td> moleküler oksijenin azaltılması </td></tr><tr><td> EC 2 </td><td> 2.3 </td><td> açiltransferazlar </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> transferazlar </td><td> 2.4 </td><td> glıkosıltransferazlar </td><td> 8 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td> metil grubu dışında aktarma alkil ya da aril grupları, </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.7 </td><td> Fosfor-ihtiva eden gruplar aktarma </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.8 </td><td> Sülfür ihtiva eden gruplar aktarma </td><td> 3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AK 3 </td><td> 3.1 </td><td> ester bağları Yasası </td><td> 67 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> hidrolazlar </td><td> 3.2 </td><td> glikosilazlar </td><td> 75 </td><td> 21 </td></tr><tr><td></td><td> 3.4 </td><td> peptid bağları Kanunu - peptidaz </td><td> 26 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td> peptid bağları dışındaki karbon-azot bağlarının, Yasası </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td></td><td> 3.6 </td><td> asit anhidritler Yasası </td><td> 4 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 3.7 </td><td> karbon-karbon bağları Yasası </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td> EC 4 </td><td> 4.1 </td><td> Karbon-karbon Hazlar </td><td> - </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Liyazlar </td><td> 4.2 </td><td> Karbon-oksijen liyazlar </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 4.3 </td><td> Karbon-nitrojen liyazlar </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="3"> enzimlerin subtotal sayısı </td><td> 197 </td><td> 53 </td></tr><tr><td colspan="3"> enzimlerin sayısı (çakışan enzimler hariç) </td><td colspan="2"> 211 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Brenda Database p-nitrofenolu veya Fenol üretin Enzimler sayısı.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System at JoVE.com

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Görüntüleme.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate). 

Video: Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

İçte düzeltici Potasyum Kanallarının Küçük moleküllü Modülatörler için Yüksek throughput Eleme

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food applications or in the replacement of petro-based chemicals. We describe an analytical platform to be automated on a liquid handling system that allows the fast and reliable analysis of the type and the amount of EPS produced by microorganisms. It enables the user to identify novel natural microbial exopolysaccharide producers and to analyze the carbohydrate fingerprint of the corresponding polymers within one day in high-throughput (HT). Using this platform, strain collections as well as libraries of strain variants that might be obtained in engineering approaches can be screened. The platform has a modular setup, which allows a separation of the protocol into two major parts. First, there is an automated screening system, which combines different polysaccharide detection modules: a semi-quantitative analysis of viscosity formation via a centrifugation step, an analysis of polymer formation via alcohol precipitation and the determination of the total carbohydrate content via a phenol-sulfuric-acid transformation. Here, it is possible to screen up to 384 strains per run. The second part provides a detailed monosaccharide analysis for all the selected EPS producers identified in the first part by combining two essential modules: the analysis of the complete monomer composition via ultra-high performance liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection (UHPLC-UV-ESI-MS) and the determination of pyruvate as a polymer substituent (presence of pyruvate ketal) via enzymatic oxidation that is coupled to a color formation. All the analytical modules of this screening platform can be combined in different ways and adjusted to individual requirements. Additionally, they can all be handled manually or performed with a liquid handling system. Thereby, the screening platform enables a huge flexibility in order to identify various EPS.

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.