Diese Arbeit wurde vom NSERC Zuschuss unterstützt 386634. Wir möchten die Mitglieder des Screaton Lab für hilfreiche Diskussionen danken.

1. Vorbereitung der Reagenzien, Platten und Zellen <ol><li> Bilden 500 ml Lyse-Puffer: 25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-Glycerophosphat, 5% Glycerin. Lagerung bei 4 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, fügen Sie 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 1 mM Natriumvanadat. Nach diesem Schritt wird PMSF in keiner Spülpuffer erforderlich. </li><li> Machen 20 ml 10x Kinase-Puffer: 200 mM Tris pH 7,5, 50 mM beta-Glycerophosphat (FW 216), 2 mM Natriumvanadat. Aliquot in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, fügen Sie 5 mM DTT. </li><li> Machen Sie 20 ml 10x M-ATP-Puffer: 300 um Adenosintriphosphat (ATP), 66 mM MgCl 2, 33 mM MnCl 2 Aliquot in 1-ml-Röhrchen und bei -20 ° C. </li><li> Auf 100 ml 2x Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer: 1,5 g Tris-Base, 20 ml Glycerin, 30 ml H 2 O. Auflösen und pH-Wert auf 6,8 mit HCl. In 40ml 10% SDS, die Lautstärke auf 100 ml. In 25 mg Bromphenolblau. </li><li> Spot 4 ul 25 ng / ul Säuger-Expressionsplasmid ein GST-Kinase 14 pro in Sätze von 96-Well-Platten und Kennzeichenschilder entsprechend kodiert gut. Dichtung und gefrier Platten bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> 1-2 Tage vor der Transfektion, Kultur HEK293T-Zellen in Komplett Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika in einem 37 ° C-Inkubator mit CO 2 (5% final) ergänzt. Passage mit Trypsin und erlauben nicht die Aktie um&gt; 80% konfluent während der Expansion zu werden. Für den Bildschirm (ca. 3 x 15 cm-Schalen aus HEK293T-Zellen bei 80% Konfluenz) sind mindestens 6 x 10 7 Zellen erforderlich. </li></ol> 2. Transfektion Hinweis: Siehe Abbildung 1 für ein Flussdiagramm des gesamten Protokoll. <ol><li> Wenn Platten, die Kinase-Plasmide wurden eingefroren, bei Raumtemperatur auftauen einnd Zentrifuge bei 1.900 × g für 3 min, vorhandene Feuchtigkeit an der Unterseite der Vertiefungen sammeln. </li><li> Mischungs 8,6 ml reduzierte Serummedium (zB OPTI-MEM) mit 312,7 &amp; mgr; l Lipid basierende Transfektionsreagenz. Lassen Sie sitzen für 5 min. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l der reduzierten Serummedium zu jeder Vertiefung unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung mit einem kleinen Volumen Kassette angebracht. </li><li> In 10 ul pro Vertiefung der reduzierten Serum-Medium / Transfektionsreagenz Mischung aus Schritt 2.2 unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem kleinen Volumen Kassette ausgestattet. Lassen Sie sich für 20 bis 45 min. </li><li> Resuspendieren 293T-Zellen mit 7,5 × 10 5 Zellen / ml in 80 ml ​​vollständigem DMEM. 100 ul Zellsuspension (dh 7,5 × 10 4 Zellen) pro Vertiefung unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsabgabevorrichtung mit einem Standardvolumen Kassette angebracht. </li><li> Überprüfen Brunnen unter dem Mikroskop für eine gleichmäßige Zellverteilung und zum Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 3. GST-Pulldown-Kinase <ol><li> Stellen Sie fresh: 4 mM Pervanadat-Lösung durch Mischen von 60 ul 0,2 M Natriumvanadat mit 540 &amp; mgr; l H 2 O In einem zweiten Rohr Mischung 2,7 ul 30% Wasserstoffperoxid und 1,4 ml PBS. Fügen Sie die beiden Lösungen zusammen und lassen Sie sich für 15 Minuten vor dem Gebrauch. </li><li> Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette (verwenden Sie nicht eine automatische Flüssigkeitsspender, wie es erzeugt zu viel Turbulenz in der gut) verzichtet werden 2 ul von 0,25 M CaCl 2 in jede Vertiefung, gefolgt von 2,5 ul des Pervanadat in Schritt 3.1 vorbereitet. Inkubieren jede Platte bei 37 ° C für 10 min und dann auf Eis zu stellen. </li><li> Vorbereitung 35 ml Lyse-Puffer durch Zugabe von DTT, PMSF und Natriumvanadat, wie in Abschnitt 1 (Herstellung der Reagentien) angegeben. </li><li> Keeping Platten auf Eis zu entfernen Medium aus jeder Vertiefung unter Verwendung einer Vakuumstrahlpumpe. Sofort im 50 ul / Vertiefung von eiskaltem Lyse-Puffer unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einer Standardkassette ausgestattet. Lassen Sie sitzen 30 Minuten lang auf Eis zu lysieren (optional: Hier können gegebenenfalls durch Versiegelung plat stoppene und Lagerung bei -80 ° C. Um auftauen Platten auf Eis) fortsetzen. </li><li> Spin-Platten bei 1.900 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Kratzen Zellen aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und übertragen Sie alle Inhalte in geeigneter Weise V-Boden Platten mit 96 Vertiefungen gekennzeichnet. Spin-Platten bei 1.900 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Während Spin, füllen Glutathion-beschichteten Platten (eine für jede 96-Well-Platte) mit 100 ul / Vertiefung von eiskaltem Lyse-Puffer (ohne PMSF) als Spülung. Halten Platten auf Eis. </li><li> Entfernen V-Bodenplatten aus der Zentrifuge. Ein zu einer Zeit, zu invertieren die Glutathion-Platten über ein Waschbecken zu schütteln den Lysepuffer und Blot auf einem Papiertuch. Bringen Lysepuffer aus den V-Bodenplatten auf die Glutathion-Platten durch Kippen der Platte und mit einer Mehrkanalpipette, man aufpassen, nicht das Pellet am Boden stören. Abdeckplatten und lassen auf Eis für mindestens 2 Stunden zu binden. </li><li> In der Nähe des Ende der 2 Stunden Bindungsschritt, bereiten Sie einen Radiostation, die Gewährleistung tEr erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen bestehen für radioaktive Arbeit. Stellen Hybridisierungsofen bis 30 ° C. </li><li> Vorbereitung 200 ml Lysispuffer durch Zugabe von DTT und Natriumvanadat wie in Abschnitt 1. PMSF deutet ist in diesem Stadium nicht erforderlich. </li><li> Kehren Sie die Glutathion-Platten über ein Waschbecken zu schütteln den Lysepuffer und tupfen Sie auf einem Papiertuch. Spülen Sie die Taschen 3x mit 100 ul Lysepuffer (ohne PMSF). Lassen Sie sich nicht Brunnen sitzen trocken - halten sie in Spülung bis bereit zu gehen. </li><li> Bereiten Sie 55 ml 1x Kinasepuffer (KB) durch Verdünnen des 10fach und das Hinzufügen von DTT, wie in Abschnitt 1. Spülen Platten einmal mit 50 ul 1x KB mit Hilfe eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem Standardvolumen Kassette ausgerüstet angezeigt. Lassen 1x KB in Brunnen, bis die Lösung A bereit ist: <ol><li> Vorbereitung der Lösung A durch Zugabe von 500 bis 530 ug des Substrats von Interesse ist, 500 &amp; mgr; g des basischen Myelinproteins (MBP), 2,65 ml 10 × KB, 13,25 &amp; mgr; l 1 M DTT, und H 2 O bis auf 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Ein zu einer Zeit, zu invertieren die Platten über ein Waschbecken, um 1x KB Spülung entfernen, Fleck auf Papiertuch, und sofort fügen 30 ul Lösung A unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkeitsspender mit einem kleinen Volumen Kassette ausgestattet. Halten Platten auf Eis. </li><li> Vorbereitung der Lösung B in den Arbeitsbereich der Radioaktivität durch Zugabe von 2,5 ml 10x M-ATP, 500 &amp; mgr; Ci 32 P ATP gamma- und H 2 O auf 10 ml. <ol><li> In 20 ul Lösung B pro Vertiefung mit einem Repeater-Pipette, die aufgrund von Ausstoßkraft Mischhilfen. Decken und Inkubation in 30 ° C Hybridisierungsofen für 30 min. </li></ol></li><li> Nach 30 min Übertragungsplatten wieder auf Eis. Zugabe von 50 ul 2 x SDS-Lysepuffer zu jedem Well mit einer Mehrkanalpipette. Kann an dieser Stelle, um zum nächsten Schritt, oder dichten die Platten mit Aluminiumfolie und bei -20 ° C, bis praktisch. </li></ol> 4. Laufsport, Färbung und Trocknung Gele Hinweis: Alle Arbeiten sind in einem Gebiet durchgeführt werden DESIGNAted auf Radioaktivität. <ol><li> Schalten Sie Hybridisierungsofen und auf 85 ° C eingestellt. Tau-Platten bei Raumtemperatur. Sobald Backofen Temperatur, Übertragungsplatten zum Ofen und Inkubation für 10 min, um Proben zu denaturieren erreicht. </li><li> Last 26-Well-Fertig Gele mit 15 ul jeder Reaktion unter Verwendung einer Mehrkanalpipette um mehrere Brunnen auf einmal zu füllen. Ist darauf zu achten, dass alle Spitzen ausgerichtet entsprechend gut, bevor Proben werden. Führen Gel bei 150 V Lassen Sie die Markierungsfarbstoff (blaue Linie) ablaufen der Unterseite des Gels, da dies enthält den unincorporated ATP. </li><li> Demontieren Sie die Gele und schneiden Sie die nicht rechtsfähige ATP (blaue Linie) mit einem Skalpell oder gerade Kante, wie es die Filme überbelichtet. Legen Sie die Gele in beschriftete Behälter geben und mit Coomassie-Färbung für 15 min. </li><li> Entfernen Sie die Coomassie-Färbung, kurz spülen Sie die Gele mit Wasser, und fügen Sie destain Lösung. Entfärben der Gele bis die Proteine ​​sind deutlich sichtbar. Ein Band für MBP und ein Band für das Substrat solltewerden für jede Probe sichtbar. </li><li> Um die Gele trocken: <ol><li> Schneiden Sie ein großes Blatt Filterpapier und legen Sie es auf dem Trockner. </li><li> Befeuchten Sie ein Cellophanfolie in destilliertem Wasser, bis es glatt ist und knitterfrei, und legen Sie sie auf dem Papier. </li><li> Verlegen Sie die Gele auf dem Zellophan Blech, die eine Anmerkung in der Größenordnung von Gelen. Befeuchten Sie ein zweites Blatt Cellophan und legen Sie auf der Gele. </li><li> Rollen Sie alle Luftblasen (eine Platte Siegelwalze funktioniert gut für diese) für eine schöne gleichmäßige Oberfläche. Schließen Sie die Klappe, schalten Sie das Vakuum und trocknen Sie die Gele für 3 Stunden bei 80 ° C. </li></ol></li><li> Sobald Gele trocken sind, setzen Sie sie XAR-Film mit einem Bildschirm, um das Signal zu verstärken. Wickeln Sie die Kassette mit Frischhaltefolie oder eine Plastiktüte und verschließen Sie mit Klebeband gegen Frost draußen zu halten. Bewahren Sie die Kassette bei -80 ° C über Nacht. </li></ol> 5. Entwicklung XAR Films <ol><li> Am folgenden Tag, entfernen Kassette aus dem Gefrierschrank und lassen bei Raumtemperatur auftauen. Entwickeln Sie den Film inDunkelkammer unter Verwendung eines Filmprozessors gemß den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Überprüfen Sie die Folien nach Beweisen für Kinase-Substrat-Paare. Ein zweiter längerer Exposition kann auch nützlich sein schwächer Phosphorylierungsereignisse detektieren. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Seit den ursprünglichen Veröffentlichungen über den Ansatz 14,15 ist die ursprüngliche Bibliothek 180 GST-Kinasen wurden in 420 Mitglieder oder ~ 80% des menschlichen Protein Kinoms erweitert. Der erweiterte Bibliothek, die wie beschrieben Protokoll dauert 4-5 Tage und dann 1-4 Tage, um Filme zu entwickeln (wie dies notwendig erscheint), die durch die Verwendung von Phosphorimaging und digitale Signalverstärkung verkürzt werden konnte. Es gibt mehrere wichtige Schritte, bei denen darauf geachtet werden muss (siehe Abbildung 1 für die Übersicht über Protokoll). Erstens ist der gesunde Bestand von Zellen (Mykoplasmen freie, niemals zur Konfluenz während der Expansion zu erreichen, und mit Trypsin behandelt bei jedem Durchgang) während des Chargenexpansionsphase und in den 96-Well-Platten bei der Transfektion. Zellen sollten gleichmäßig ausgesät werden, und 80% konfluent, wenn die Transfektion erfolgt (Schritt 1.5). Zweitens ist es ideal bei der Transfektion ein automatisiertes Flüssigkeitsspender zu verwenden, um die Lautstärke zu minimieren transfer Fehler, so Begrenzungskoeffizienten von Variationen (&quot;cvs&quot;) zwischen den Wells. Für kleine Volumina, Einpassen der Spender mit einem kleineren Volumen Kassettengrenzen Reagenzienverlust aufgrund der reduzierten Totvolumina und erhöht die Dosiergenauigkeit. Der Behandlungsschritt mit Natrium Pervanadat, einer Pfanne Tyrosinphosphataseinhibitor wird als allgemeiner Anreiz zur Phosphorylierung von Zielkinasen erhöhen. Die Aufnahme von Calcium in diesem Schritt erhöht die Zell-Matrix-Adhäsion, verhindert Zellverlust durch Runden der Zahlen bei längerer Pervanadat Behandlung ausgelöst. Dieser Schritt sollte nur unter Einhaltung der 10-minütigen Inkubationszeit durchgeführt werden. Drittens, für den Kinase-Assay selbst, gibt es verschiedene Überlegungen bei der Auswahl des rekombinanten Substrats: Peptide, Proteindomänen, oder intakte Proteine ​​so groß wie 120 kDa können alle verwendet werden. Wenn eine spezifische Phosphorylierungsstelle ist bekanntlich ein Peptidsubstrat die geradlinige Ansatz, aber groß genug sein muss, um zu erkennen seinauf einem SDS-PAGE Gel. Somit können Peptidsubstrate mit GST fusioniert und gereinigt werden von den Bakterien bis ein MG von&gt; 25 ergeben. Größere Proteine ​​haben den Vorteil, daß sie wahrscheinlich gefaltet und ihre phosphorylierten Resten ausgesetzt, wie sie in der Zelle sein, doch sind mit dem Nachteil, dass sie zusätzliche Reste, die phosphoryliert werden kann und gibt Signal in dem Assay umfassen. Wir bevorzugen, um einen Bildschirm unter Benutzung einer Peptidsubstrat von 15-20 Aminosäuren einen Rückstand, der bekanntlich in vivo phosphoryliert werden und ist dafür bekannt, eine biologische Ereignis regulieren Umgebung besteht, wie dies macht Validierung der Kandidaten Kinasen vom Bildschirm sowohl in vitro und in vivo viel schneller. Letzten, im Idealfall der Menge an Protein, Ansätze oder mehr als 1 &amp; mgr; g pro Napf; dies natürlich variiert mit dem Molekulargewicht von dem Substrat. Weniger Protein pro Vertiefung kann sinn Treffer ergeben, aber die &quot;mehr ist besser&quot; gilt, wie es erhöht Signal: noise. Norm wird, sind nicht zu empfehlen, da Gradientengelen Gradientengelen knacken zu oft beim Trocknen. Nach Trocknung der Gele, Feststellung eines radioaktiven Signals gegenüber dem Hintergrund mit einem Geigerzähler gibt einen ausgezeichneten Erfolgsmeldung des Assays. Der Bildschirm ist in vitro und weitere Komplexitätsebenen in vivo vorhanden ist, muss ein Kandidat-Kinase (n) für ein gegebenes Substrat in Zellen bestätigt werden. Insbesondere kann der Bildschirm ein Mitglied der Familie, die die biochemische Kapazität, um das Substrat in vitro phosphorylieren hat, aber doch nicht im gleichen Zelltyp oder in demselben subzellulären Kompartiment als Substrat exprimiert werden. Zum Beispiel, während MARK2 und MARK3 waren beide Treffer in einem Bildschirm für Kinase, CRTC2 auf Ser275 phosphorylieren konnten nur MARK2 gebildete Komplex mit dem Substrat in den Zellen 14. Im folgenden sind eine Reihe weiterer Experimente, die verwendet werden, um die physiologische Relevanz der Kandidat-Kinase zu bestätigen. First, Mobilitätsverschiebungen des Substrats, auf SDS-PAGE folgenden Coexpression des Kandidaten Kinase kann als Bestätigungssteuerung verwendet werden. Geeignete Kontrollen wie Co-Transfektion eines katalytisch inaktiven Kinase kann Spezifität zu bestätigen. Zweitens kann das Substrat aus Zellextrakten, die mit 32 P-Orthophosphat eine katalytisch inaktive Kinase inkubiert wurden, um den Einbau von Phosphat in das Substrat in Gegenwart des Wildtyp zu bestätigen und nicht immungefällt werden. Drittens kann ein phosphospecific Antikörper gegen das phosphoacceptor Sequenz (falls bekannt) erzeugt und verwendet, um einen Anstieg der Substratphosphorylierung zu bestätigen, wenn die Kinase überexprimiert werden. Ein zweites Screening unter Verwendung eines Mutanten-Substrat, das eine nicht-phosphorylierten Rest an der Zielstelle kann Spezifität vor der Erzeugung eines phosphoantibody eine besonders wichtige Steuer mit größeren Domäne und Vollängenprotein Materialien zu prüfen. Pharmakologische Hemmung nähert, um einen Kandidaten zu hemmenDatum Kinase kann auch verwendet werden, jedoch ist Vorsicht geboten, wie die Hemmung der verwandten Kinasen ausgeübt wird, ist eine underappreciated Realität. Schließlich RNAi-vermittelte Silencing des Kandidaten-Kinase (n) in Zellen verfolgt und Western-Blotting zum Verlust der Zielstelle mit einer Phosphorylierung phosphospecific Antikörper Überwachung durchgeführt werden kann.

Protein posttranslationale Modifikationen (PTMs) essentiell für die intrazelluläre Kommunikation. Vielleicht ist die am besten untersuchten aller PTMs ist Phosphorylierung durch Proteinkinasen, die eine Vielzahl von Proteinfunktionen, einschließlich ihrer biochemischen Aktivität, subzelluläre Lokalisierung, Konformation und Stabilität regulieren katalysiert. Die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen auf Zielproteine ​​können durch tryptische Phosphopeptid Kartierung oder jetzt Standard Proteomics Techniken unter Verwendung von Proben für die phosphorylierten Peptide 1,2 angereichert erreicht werden. Während drei Viertel der zum Ausdruck Proteom sollen phosphoryliert 3 und eine identifizierte 200.000 Phosphorylierungsstellen 5, wobei die Schätzungen bis zu 1 Mio. 6, viele von ihnen haben keine zugewiesenen Biologie, Signalwegs oder Proteinkinase. Während Identifizierung der phosphorylierten Websites ist relativ einfach, eine vergleichsweise größere Herausforderung ist es,identifizieren die verwandten Kinase (n), dass diese Seiten abzielt, ein Prozess, wir als Mapping-Kinase: Substrat-Paare. Mehrere Ansätze zum Identifizieren von Kinase: Substrat-Paare beschrieben wurden, entweder ausgehend von einer Kinase von Interesse und der nach seiner Substrate oder beginnend mit einem Substrat von Interesse und zu versuchen, eine modifizierende Kinase experimentell 7-11 oder rechnerisch 12 finden. Kinasen für eine bekannte phosphorylierte Substrat identifizieren kann Bioinformatik verwendet, um Proteine, die eine kurze konservierte Aminosäuresequenz flankieren den phosphorylierten Rest (der Konsensusstelle), sowie die Identifizierung Kinasen, die einen präzipitierbaren Komplex mit dem Substrat enthalten identifizieren. Allerdings sind diese Ansätze zeitaufwendig und oft nicht von Erfolg gekrönt. Wir entwickelten eine systematische funktionalen Ansatz schnell zu identifizieren Kinasen, die eine gegebene Substrat 13 phosphorylieren kann. Der Bildschirm Assay produziert hervorragende spezifischekeit, mit sehr klaren Auswahl für eine mögliche verwandte Kinasen. Angesichts der Zentralität der Phosphorylierung an biologischen Signal, der Bildschirm ist nützlich für die Entdeckung in nahezu allen Zellsignalwege 14-16. Der Bildschirm beinhaltet die Durchführung einer großen Kinase-Assay mit einer Bibliothek von menschlichen Proteinkinasen. Die Kinasen wurden mit bakteriellen Glutathion-S-Transferase (GST) -Protein, markiert worden und werden aus Säugetierzellextrakten gereinigt ist, was bedeutet, daß die rekombinanten Enzyme - im Gegensatz zu den aus Bakterien hergestellt, - in Gegenwart der vorgeschalteten Proteinkinasen oft die erforderliche erzeugten rekombinante Enzyme Aktivität haben in vitro. Tatsächlich, während Serin, Threonin und Tyrosin Kinaseaktivität für nachgeschaltete Kinaseaktivierung in Hefe 10 vorhanden sind, codiert das Hefegenom 122 Proteinkinasen, die anzeigt, dass die Säuger Kinoms, mit mehr als 500 Gene 17 ist wesentlich komplexer zu werden, um Regulate die Prozesse eindeutig höherer Ordnung Organismen. Darüber hinaus kann die Wirkung der relevanten Zellbiologie und menschlichen Erkrankungen (wie beispielsweise kleinen Molekülen, Wachstumsfaktoren, Hormone, etc.) verschiedene Reize zu 14,15 modulate Kinase-Aktivität in einem geeigneten Kontext eingesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

Wir haben ein Screening-Plattform zu dedizierten menschliche Proteinkinasen phosphoryliert für Substrate, die verwendet werden können, um neue Signaltransduktionswege aufzuklären identifizieren. Unsere Vorgehensweise bietet die Verwendung einer Bibliothek von gereinigtem GST-markiertes humanes Protein-Kinasen und ein rekombinantes Protein Substrat von Interesse. Wir haben diese Technologie ein Protein für die Beta-Zellproliferation erforderlich ist, sowie die verwendet werden, um MAP / Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase 2 (Modell 2) als Kinase für eine Glucose-regulierten Website auf CREB-Regulated Transcriptional Koaktivator 2 (CRTC2) zu identifizieren, Axl Familie von Tyrosinkinasen als Regulatoren der Zellmetastasen durch Phosphorylierung des Adapterprotein ELMO. Wir beschreiben diese Technologie und diskutieren, wie sie helfen können, eine umfassende Karte, wie Zellen auf Reize aus der Umwelt zu etablieren.

Repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm werden in Abbildung 2 dargestellt. 180 Kinasen wurden unter Verwendung eines GST-tagged Peptidsubstrat entsprechend zu AS 268-283 von CRTC2 sowie klassischen Kinaseassays Substrat das basische Myelinprotein (MBP) gescreent. Nur zwei Kinasen, MARK2 und die eng verwandte Kinase phosphoryliert das MARK3 CRTC2 Peptids. MBP ist als eine interne Kontrolle in allen Assays eingeschlossen, da es enthält viele phosphorylierbare Reste und läuft bei 18 kDa, in Richtung der Unterseite des Gels. Dies ermöglicht eine Interpretation der Spezifität: einige Kinase phosphoryliert wird kräftig ein Substrat und MBP. Der Hinweis ist, dass die Wells GST alleine (dh ohne die Kinase Kontrollen) enthalten reinigen immer eine endogene Kinaseaktivität, wodurch es immer Hintergrund Phosphorylierung in dem Assay. Während dies nicht ausschließen, dass die Phosphorylierung des Substrats ist real, legt es nahe, daß bei der in vitro-Setzen der Kinase kann weniger selektiv.Es ist besonders informativ, um mehrere Substrate unterschiedlicher MW Rückschlüsse auf Kinase-Substratspezifität zu ziehen sind. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> Abbildung 1. Flussdiagramm, das wesentliche Schritte in Protokoll. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> Abbildung 2. Beispiel Bildschirm Ergebnis. Autoradiographien eines Bildschirms der Version 1 der Bibliothek (180 menschliche Proteinkinasen) durchgeführt unter Verwendung von GST-Peptid-Substrat entsprechend zu AS 268-283 des Maus CRTC2 (von Jansson reproduziert et al., 2008). MBP, das basische Myelinprotein ist angegeben. Der hohe Grad der substrate Auswahl von verwandten Kinasen ist eine Funktion des Bildschirms. Jede Spur stellt die Reaktionsprodukte von einer verschiedenen Kinase-Assay. MARK3 (Gel 1) und MARK2 (Gel 16), die einzigen Kinasen zu TORC2 268-283 Peptid phosphorylieren, sind angezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identifikation von Kinase-Substrat-Pairs Mit High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Aufrufe.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Serie: Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Forschung

Biochemie

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identifizierung von Cyclin-abhängige Kinase 1 spezifische Phosphorylierung Websites durch eine In-vitro- Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Eine einfache Methode zur Identifizierung von Kinasen, die die embryonale Stammzell-Pluripotenz durch Hochdurchsatz-Inhibitor-Screening regulieren

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Entwicklungsbiologie

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biologie

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Biotechnik

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput Screening niedermolekularer Modulatoren von Inward Gleichrichter-Kaliumkanäle

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...