Wir erkennen an Austin Cyphersmith und mayandi Sivaguru (Carl R. Woese Institute for Genomic Biologie, Universität von Illinois in Urbana-Champaign) für die Unterstützung bei der Mikroskopie und für die großzügige Aufnahme von Bildschirm und Video-Capture in der Mikroskopie Kern.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In unseren Experimenten haben wir, dass die häufigste Defekt gefunden auf die Qualität der hergestellten Arrays verbunden sind und schlecht Reaktion im biologischen System von Interesse charakterisiert. Wir verweisen auf die Tabelle 1 für die gemeinsame Ausfallarten in Zellmikroarray - Experimenten und der damit verbundenen Schritte zur Fehlerbehebung. In Bezug auf die Qualität von Arrays insbesondere empfehlen wir folgendes. Bestätigen Sie die technische Qualität und Robustheit der Gruppierungs Programme, Parameter und Puffer fluoreszenzmarkierte Moleküle wie Rhodamin-konjugierten Dextran verwendet wird. Gründlich reinigen Stifte entweder vor oder nach dem Gruppierungs pro Anweisungen des Herstellers und weitere visuell zu überprüfen, dass die Stiftkanäle frei sind von Schutt mit einem Lichtmikroskop. Bestätigen Sie gruppierten Biomolekül Retention unter Verwendung der allgemeinen Protein Flecken oder Immunmarkierung. Man beachte , dass Biomoleküle mit einem Molekulargewicht unter 70 kDa sind, häufig nicht 23 in dem Hydrogel beibehalten </<html> sup&gt; 31. Validieren gruppierten Biomolekül Zell-Funktionalität mehrere Zelltypen verwendet. Beachten Sie, dass nur anhaftenden Zellen mit Arrays kompatibel sind; Zusätzlich Haftung auf Arrays hängt sowohl zellspezifischen Eigenschaften (zB Integrin - Expressionsprofil) und den ausgewählten ECM Proteine. Aufgrund des beschränkten Platz, haben wir nicht eine umfassende Behandlung von Array - Design, Layout und Fertigung hier und verweisen den Leser auf vorherigen 23 vorgesehen funktioniert, 25. Wir verwenden in der Regel 100 Spot Subarrays (150 &amp; mgr; m Fleckdurchmesser, 450 &amp; mgr; m von Mitte zu Mitte Abstand) , bestehend aus 10-20 einzigartigen Biomolekül Bedingungen (dh 5-10 Punkte / Zustand). Die Anzahl der Sub-Arrays in einem Array in Abhängigkeit von der Anzahl der Biomolekül Bedingungen von Interesse abhängig, die bequem bis zu einer 25 × 75 mm Objektträger bis 1.280 skaliert werden kann (~ 6.400 Spots in 64 Subarrays)xref &quot;&gt; 25, 31 Die Parameter weiter oben in Abhängigkeit von der Mustergröße von Interesse variieren;. Stifte in der Lage , Muster von 75 zu erzeugen - 450 &amp; mgr; m sind leicht verfügbar. Array-Experimente werden am besten durch die Validierung von High-Scoring angeordnet Bedingungen von Interesse unter Verwendung anderer Kulturformate, Assay Ablesungen ergänzt und biologische Modellsysteme. Insbesondere empfehlen wir weitere Effekte von ausgewählten Array - Bedingungen Validierung unter Verwendung von Massenkulturen in Verbindung mit molekularbiologischen Standardtechniken (zB qRT-PCR, Immunoblot) oder Standard - TFM. Genetische Manipulation (zB Zuschlags oder Überexpression) des Faktors von Interesse in einem geeigneten biologischen Modellsystem kann auch dazu dienen , Effekte in Arrays beobachtet , um zu bestätigen. In - vivo - Tiermodelle repräsentieren ein weiteres Mittel zur Validierung und wurden vor kurzem verwendet, zum Beispiel die zentrale Rolle von Galectin-3 und Galectin-8 in bestätigenmetastatischen Nische der Lungenkrebs, wie zunächst über Zellmikroarray identifiziert 31, 49. Eine Anzahl von anderen Verfahren verwendet wurden Mikroumgebungs Regulation von Zellfunktionen zu untersuchen, einschließlich einer Vielzahl von zweidimensionalen mikrofabrizierten Systeme 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 und dreidimensionale engineered Biomaterial Systeme 56, 57, 58 , 59, 60, 61. Im Vergleich mit anderen Verfahren, beschrieben die besonderen Vorteile der Zelle Microarray-Plattform hier bestehen aus: (1) einem Durchsatz von bis zuHunderte oder Tausende von unterschiedlichen Kombinationen von Faktoren, so dass Analyse Wechselwirkungen; (2) zugänglich, automatisierte Bildgebung und Analyse; (3) Integration der beiden biochemischen und biophysikalischen Ablesungen mit kontrollierter Darstellung von angeordneten Faktoren; (4) die Fähigkeit Substratmaterialeigenschaften zu variieren; und (5) High-Content-Single-Cell-Analyse von Zellschicksal und Funktion. Zusammenfassend ermöglicht die Kombination von Zell-Mikroarrays mit TFM auf Substraten von abstimmbaren Substrat Steifigkeit gründliche Charakterisierung der beiden biochemischen und biophysikalischen Signale. Wie hier dargestellt, ist diese Plattform generalizable und können leicht an eine Vielzahl von adhärenten Zelltypen und Gewebe Kontexten zu einem verbesserten Verständnis der kombinatorischen Mikroumgebungs Regulation der Zelldifferenzierung und Mechanotransduktion angewendet werden.

Wechselwirkungen zwischen Zellen und der umgebenden Mikroumgebungsfaktoren vermitteln eine Vielzahl von biologischen Prozessen während der Entwicklung, Homöostase und Pathogenese der Erkrankung 1, 2, 3, 4. Diese Mikroumgebungs Wechselwirkungen umfassen die Lieferung von löslichen Faktoren zu Zellen, Zell-Matrix-Bindung, und die Zell-Zell-Wechselwirkungen über Ligand-Rezeptor-Bindung. Zusätzlich zu den oben genannten biochemischen Überlegungen biophysikalischen Parameter, wie Substrat mechanischen Eigenschaften (beispielsweise Elastizitätsmodul, Porosität) und der Zellform und die damit verbundenen nachgeschalteten Mechanotransduktion zunehmend Anerkennung als wichtige Mediatoren der Zelldifferenzierung gewonnen haben , 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Die Signale aus diesen Mikroumgebungs Wechselwirkungen dienen als Eingänge für Gen-Netzwerke und Signalwege. Darüber hinaus sind diese Zellen intrinsische Komponenten bieten auch Rückmeldung an die Mikroumgebung über sekretierte Faktoren und Matrix-abbauende Enzyme, eine komplexe co-Regelungsschleife zwischen zell intrinsischen genetischen Programme und zell extrinsische Faktoren Mikroumgebungs 5, 11, 12 vervollständigt. Die Verwendung von technischen Systemen für die kontrollierte Darstellung von Mikroumgebungsfaktoren wurde in einer Reihe verschiedener Kontexte 13, 14, 15 bewährt. Mikrofabrizierte Systeme haben insbesondere präzise räumliche Strukturierung von Proteinen und Zellen erleichtert sowie hoch parallelisierte Analyse über Miniaturisierung 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Zelle Mikroarrays stellen eine solche mikrofabrizierten System , in dem Kombinationen von Biomolekülen sind berührungs gedruckt auf einem elastischen Polyacrylamidhydrogel Substrat 23, 24, 25. Die Einbeziehung von zellKlebstoffKomponenten (nämlich Matrixproteine) ermöglicht anhalt Zelladhäsion und Kultur auf Mikroarrays, die häufig durch nachgeschaltete Analyse mittels Immunzytochemie und fluoreszierende Reporter folgt. Zellmikroarrays wurden zur Verwirklichung eines verbesserten Verständnis von Leberzell - Phänotyp 23, 26, neurale Vorläufer Differenzierung 27, produktiv gerichtet Mammary Vorläufer Entscheidungen Schicksal 28, embryonalen Stammzellen Wartung / Differenzierung 23, 29, 30, Metastasen Lungenkrebs 31 und therapeutische Reaktion bei Melanom 32. Wir haben vor kurzem gezeigt , die Verwendung von Zell - Microarrays zur Bestimmung der Rolle der extrazellulären Matrix (ECM) Proteinzusammensetzung in Endoderm Spezifikation 33, Lebervorläufer Differentiation 34, 35, und die Zelllungentumorarzneimittelantwort 36. In diesen Arbeiten haben wir uns auf die Erweiterung der kombinatorischen Fähigkeiten der Array-Plattform und die Erkundung der Kreuzungen von Zell-Eigen Signalisierung mit extrazellulären Matrixzusammensetzung und Biomechanik konzentriert. Darüber hinaus haben wir biophysikalischen Ablesungen in diesem Array Plattform implementiert quantitativ Eigenschafte, um die Möglichkeit zu bieten,zeichnen die Rolle der Zellkontraktilität in Differenzierungsprozessen 35. Dazu integriert wir Traktionskraftmikroskopie (TFM) mit Zellmicroarrays Hochdurchsatzbewertung von zell erzeugten Traktion zu ermöglichen. TFM ist ein weithin genutzt Verfahren zell erzeugten Zugkräfte zu messen und hat sich mit der Zusammensetzung und der Biomechanik des lokalen Mikro 37, 38, 39, 40 in Bezug auf die Koordinierung der einzelnen Zelle und Gewebe-Ebene Funktion wichtige Erkenntnisse zur Verfügung gestellt. Somit liefert für Meßtaste, physiologisch relevanten biophysikalischen Parameter eines Hochdurchsatzsystem mit Zellmicroarrays TFM kombiniert. Die Zelle Microarray-Plattform hier beschriebene besteht aus vier Abschnitten: Herstellung von Polyacrylamid-Substrate, die Herstellung von Arrays, Zellkultur und Assay Auslesung und Analyse von Daten. SehenFigur 1 eine schematische Zusammenfassung der ersten drei Versuchsabschnitte; siehe Abbildung 2 für eine schematische Zusammenfassung des letzten Abschnitts mit einem Schwerpunkt auf der Analyse von Immundaten. Um die Zelle Microarray - Plattform auf Studien von biomechanischen Zell-Substrat - Wechselwirkungen anzupassen, haben wir Polyacrylamid - Substrate von abstimmbaren Elastizitätsmodul , aber ähnliche Porosität, je Wen et al. 41. TFM Messungen der Kräfte, die durch Zellen, die auf ihrem Substrat ausgeübt zu ermöglichen, haben wir ein Glasboden-Petrischale Format neben dem dicken Glasobjektträgern durch andere Gruppen häufig genutzt. Somit ist diese Zelle Microarray Plattform, die parallel Messungen der Zelldifferenzierung mittels Immunofluoreszenz auf Objektträgern und zell erzeugten Kräfte über TFM auf separaten Glasbodenschalen. Wir haben auch eine Reihe von Verbesserungen an den analytischen Ansatz häufig verwendete mit Zellmikroarrays angewendet. specifically statt parametrischer Z-Scoring der gesamten Insel Intensität messen wir Intensität Einzelzelle und Quantil Normalisierung, um für Nicht-Normalverteilungen und genauer Zellverhalten beschreiben zu berücksichtigen gilt. Wir glauben, dass diese Verbesserungen einen besonderen Nutzen auf Untersuchungen von biologischen Prozessen schaffen, bei dem sowohl biochemische und biophysikalische Signale signifikant, sich schneidende Rollen spielen. Ferner ermöglichen es unseren analytischen Verbesserungen, um die Anwendung von Zellmikroarrays Studien einer Reihe von zellulären Funktionen, für die das Verhalten Einzelzelle und Bevölkerungsebene abweichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>4433</td>
			<td>Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; penicillin&#8211;streptomycin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22&#215;60 mm coverglasses</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>63765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440159</td>
			<td>Store under inert gas per manufacturer&#39;s instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes</td>
			<td>Cell E&#38;G</td>
			<td>GBD00002-200</td>
			<td>13 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1823-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well polystyrene microplates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td>35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easying array fabrication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, rat tail</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>08-115MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen III, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV, human</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker, 365 nm</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDa</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1841</td>
			<td>Used as a marker for array location.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific (HyClone)</td>
			<td>SH3001302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL1, mouse</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5026-DL-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant DLL4, mouse</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-40A-0145-C050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-recombinant JAG1, rat</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>599-JG-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, human</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope, inverted</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td>Ensure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 &#176;C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G with DAPI</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure 2959</td>
			<td>BASF Corporation</td>
			<td>55047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin, mouse</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>CC095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner</td>
			<td>GenePix</td>
			<td>4000B</td>
			<td>Fluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarrayer</td>
			<td>Digilab</td>
			<td>OmniGrid Micro</td>
			<td>Other microarrayerse of similar or greater capability can readily be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides, 25&#215;75 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS294775X25</td>
			<td>~0.9&#8211;1.1 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td>CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA), 16% v/v</td>
			<td>Electron Microscope Sciences</td>
			<td>RT15710</td>
			<td>Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A/G, recombinant</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex drying tray, 2000 ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-242B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4-chambered culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific (Nunc)</td>
			<td>12-565-495</td>
			<td>For cell culture on arrayed microscope slides.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>415413</td>
			<td>CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth pin for arraying</td>
			<td>ArrayIt</td>
			<td>SMP3</td>
			<td>Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75&#8211;450 microns) as suited to your particular application.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput cell microarray platform for correlative analysis of cell differentiation and traction forces

Mikrofabrizierten zelluläre Mikroarrays, welche der kontakt gedruckten Kombinationen von Biomolekülen auf einem elastischen Hydrogel Oberfläche bestehen, bieten eine streng kontrolliert, Hochdurchsatz-engineered System für den Einfluss von angeordneten biochemische Signale auf die Zelldifferenzierung zu messen. Die jüngsten Bemühungen der Zelle unter Verwendung von Microarrays haben ihre Nützlichkeit für kombinatorische Studien nachgewiesen, in denen viele Mikroumgebungsfaktoren sind parallel dargestellt. Allerdings haben diese Bemühungen konzentriert sich hauptsächlich auf die Auswirkungen der biochemischen Signale auf Zell-Reaktionen zu untersuchen. Hier präsentieren wir eine Zelle Microarray-Plattform mit abstimmbaren Materialeigenschaften für die Beurteilung sowohl der Zelldifferenzierung durch Immunofluoreszenz und biomechanische Zell-Substrat-Wechselwirkungen, die durch Traktion Kraftmikroskopie. Dazu haben wir zwei verschiedene Formate unter Verwendung von Polyacrylamid-Hydrogele unterschiedlicher Young-Modul entweder auf Mikroskop-Objektträger oder Glasboden-Petrischalen hergestellt entwickelt. Wir bieten BESt Praktiken und Problemlösungen für die Herstellung von Microarrays auf diesen Hydrogel-Substrate, die nachfolgende Zellkultur auf Mikroarrays, und der Übernahme von Daten. Diese Plattform ist gut geeignet für die Verwendung bei Untersuchungen der biologischen Prozesse , bei denen sowohl biochemische (beispielsweise extrazelluläre Matrixzusammensetzung) und biophysikalischen (beispielsweise Substrat Steifigkeit) cues signifikante spielen können, sich schneidende Rollen.

Mit dieser Plattform haben wir untersucht die Rolle der beiden biochemischen und biophysikalischen Signale in das Schicksal Spezifikation der Leber Vorläufern 34, 35. Protein A / G-konjugierten Notch - Liganden zeigten verbesserte Retention und clustering in dem Polyacrylamid - Hydrogel (3A) und waren weiterhin fähig ist zu einer Gallengang - Zellschicksal Differenzierung der Leber - Vorläufern Antriebs (3B). Verwendung von Einzelzellanalyse quantifiziert wir die Antwort auf die Notch - Liganden für die ECM - Proteine Kollagen I, Kollagen III, Kollagen IV, Fibronectin und Laminin (3C), Feststellung , dass die Antwort von Lebervorläuferzellen an den Liganden auch auf die hängt ECM Kontext. Zuletzt verwendeten wir shRNA Knockdown Leber Vorläufern ohne den Liganden DLL1 und JAG1 zu erzeugen. Die Reaktion auf die aufgereiht Notch-Liganden variiert in Abhängigkeit von der prEsence von beiden Liganden zu bestätigen, dass die Reaktionsfähigkeit der Zell extrinsischen Liganden ist auch eine Funktion des Zell intrinsischen Liganden - Expression (Abbildung 3D). Ferner beobachteten wir eine deutliche Subpopulation von doppelt positiven (ALB + / OPN +) Zellen im DLL1 Knockdown (3D). Zusammen zeigen diese repräsentative Ergebnisse: (1) die kombinatorischen Fähigkeiten des Array-Format, wie es durch die Paarung von mehreren aufgereiht ECM Proteine ​​und Notch-Liganden mit Zuschlags einzelner Liganden veranschaulicht; (2) die Funktionalität nicht nur angeordnet Proteine ​​ECM, sondern auch Zell-Zell-Liganden mittels Protein A / G-vermittelte Konjugation angeordnet sind; und (3) die Umsetzung unserer Single-Cell-Analyse und seine Fähigkeit, einzigartige Subpopulationen zu erkennen. Wir beobachteten auch , dass die Differenzierung der Leber - Vorläufern ist sowohl abhängig von der Substrat Steifigkeit und der ECM - Zusammensetzung (4A </str<html> Ong&gt;), ist , dass Kollagen IV speziell der Suche nach nur der Differenzierung unterstützend auf beiden weichen und steifen Substraten während Fibronektin Differenzierung auf steife Substrate (4B) unterstützt. Repräsentative Wärme Karten von TFM Messungen vorgeschlagen , dass nachhaltige Zugspannung bei niedrigen Substratsteifigkeit auf Kollagen IV Differenzierung in den Gallengang - Zellen (4C) gefördert, die Feststellung bestätigt durch das durchschnittliche Effektivwert-Quadrat - Werte (4D). Zusammen zeigen diese repräsentative Ergebnisse: (1) die erfolgreiche Integration von TFM mit Zellmikroarrays auf Substraten mit einer abstimmbaren Steifigkeit sowohl die Zell-Phänotyp und die Traktion Stress zu bewerten; (2) die Koordination der Lebervorläuferzellschicksal sowohl mit der Matrix-Zusammensetzung und dem Substrat Steifigkeit; und (3) die Umsetzung unserer TFM Analyse und typische Traktionsspannungsprofile in Zellmikroarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Schematische Übersicht der ersten drei Versuchsteilen angezeigt. In Abschnitt 1 werden Glassubstrate gereinigt und silanisiert die Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogele zu erleichtern. In Abschnitt 2 werden die Biomolekül Kombinationen von Interesse in einer Quelle Mikrotiterplatte mit 384 gut vorbereitet. Ein Roboter-Arrayers wird dann mit sauberen Nadeln, die Quelle Mikrotiterplatte und die Polyacrylamid-Hydrogele und initialisiert, Herstellung Arrays auf den Hydrogelen geladen. In Abschnitt 3 werden die Zellen auf die Array-Domänen ausgesät und haften gelassen, wonach das Kulturprotokoll von Interesse durchgeführt wird. Am Endpunkt werden die Zellen entweder für Immunzytochemie / Immunofluoreszenz analysiert feste oder TFM verwenden. Maßstabsbalken sind 75 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> innerhalb-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Abbildung 2: Verarbeitung und Analyse von Immunfluoreszenz - Daten aus Arrays. (A) Fliesen-, Composite - 32-Bit - RGB - Bilder werden zuerst binned und dann aufgeteilt in einzelne 8-Bit - Kanäle. Verwendung einer Kombination von angeordneten fluoreszierenden Marker und Zellinseln, drei Ecken des Arrays identifiziert für die automatische Ausrichtung und Rasterung der Arrays zu ermöglichen. (B) Einzelzellendaten für jeden Kanal der eingegebenen Arrays erzeugt. Um für experimentelle Drift zu berücksichtigen, wird Quantils Normalisierung durch biologische Replikation angewendet, um eine Shared Verteilung über alle Replikate zu erzeugen. Quantile normalisierten Daten werden anschließend über die Berechnung der Ensemblemessungen (zB Zellen / Insel, mittlere Intensität, Prozent Zellen positiv für ein Label) oder direkte Analyse von Einzelzellverteilungen aufgetragen und interpretiert.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Abbildung 3: Notch - Liganden Präsentation Vermittelt Leber Progenitor Differenzierung. (A) Fc-rekombinante Notch - Liganden Jagged-1 (JAG1) und Delta-like 1 (DLL1) zeigten verbesserte Retention und Clustering , wenn sie mit Protein A / G angeordnet. Maßstabsbalken ist 50 &amp; mgr; m. (B) Leber Vorläufern differenziert in den Gallengang - Zellen bei Vorlage mit Notch - Liganden. 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) ist ein Kern Etikett, Albumin (ALB) ein Leberzellmarker ist, und Osteopontin (OPN) ist eine Gallengang-Zellmarker. Maßstabsbalken ist 150 &amp; mgr; m. (C) Quantifizierung der Prozentsatz der Zellen , die positiv für OPN für den Notch - Liganden JAG1, DLL1 und Delta-like 4 (DLL4) auf die ECM - Proteine Kollagen I, collagen III, Kollagen IV, Fibronectin und Laminin. Student-t -Tests wurden für jede aufgereiht Notch - Liganden gegen Kontroll - IgG durchgeführt innerhalb jedes ECM - Proteins mit P-Werte angegeben für P &lt;0,05 (*). (D) Imaging - Zytometrie von ALB und OPN für Zellen auf Kollagen III mit den Notch - Liganden präsentiert JAG1, DLL1 und DLL4. Leber - Vorläufern ohne die Notch - Liganden DLL1 und JAG1 (dh shDll1 und shJag1) wurden shRNA Knockdown generiert. Daten in (C) dargestellt als Mittelwert ± SEM Diese Zahl wurde von Kaylan et al modifiziert. 34. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Abbildung 4: Matrixzusammensetzung und Substrat Stiffness Coordinate Leber Progenitor Differenzierung. (A) Differenzierung Liver Vorläuferzellen zu Gallenkanal ist abhängig von sowohl ECM - Zusammensetzung und dem Substrat Steifigkeit. DAPI ist ein Kern Etikett ist ALB eine Leberzellmarker und OPN ist ein Kanalzellmarker Galle. (B) Quantifizierung der Prozentsatz der Zellen positiv für OPN auf Substraten des Elastizitätsmoduls 30 kPa, 13 kPa, und 4 kPa für Kollagen I (C1), Kollagen IV (C4), Fibronectin (FN), und alle Zwei-Wege - Kombinationen diese ECM-Proteine. (C) Zell Zug beansprucht wird sowohl Substrat Steifigkeit und ECM - Zusammensetzung abhängig. (D) Die Quantifizierung der root-mean-square Werte der Zugspannung auf Substraten des Elastizitätsmoduls 30 kPa und 4 kPa für Kollagen I (C1), Kollagen IV (C4), Fibronektin (FN) und alle Zwei-Wege - Kombinationen derjenigen ECM-Proteine. In (B) und (D) wurden die Daten als Mittelwert ± SEM und Student t -Tests präsentiertfür jede ECM Kombination mit P-Werten gegenüber 30 kPa wurden für P &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**) und P &lt;0,001 (***) angegeben durchgeführt. Maßstabsbalken sind 50 &amp; mgr; m. Diese Zahl wurde von Kourouklis et al modifiziert. 35. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Abschnitt </td><td fo:width="1.5in"> Problem </td><td fo:width="1.5in"> Mögliche Ursachen </td><td> Lösung </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. Herstellung von Polyacrylamid-Substrat. </td><td> Abdeckglas nicht aus Hydrogel entfernt werden. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reduzieren Polymerisationszeit auf &lt;10 Minuten (4 W / m 2). Überprüfen Sie, dass UV-crosslinker Ausgang ist im erwarteten Bereich. </td></tr><tr><td> Schlechte Polyacrylamid-Hydrogel-Polymerisation. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Erhöhen Polymerisationszeit auf&gt; 10 Minuten (4 W / m 2). Überprüfen Sie, dass UV-Vernetzer Ausgang innerhalb des erwarteten Bereichs liegt. </td></tr><tr><td> Polyacrylamide Hydrogele werden nach Entfernung der beschädigten Abdeckglas. </td><td> Soft-Polyacrylamid-Hydrogele sind leicht zu beschädigen. </td><td> Wir beobachten Abnahme Hydrogel Fertigungsausbeute (~ 50%) für den weichsten (dh 4 kPa) Hydrogele im Besonderen. Griff Hydrogele sanft und Startnummern erhöhen, um die gewünschte Ausbeute zu erreichen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. Herstellung von Arrays. </td><td rowspan="2"> Schlechte oder inkonsistent Stelle Morphologie. </td><td> Uneinheitliche Luftbefeuchter Funktion. </td><td> Überprüfen Sie, dass Luftbefeuchter und Rheometer eine funktionelle während jeder Auflage und 65% relativer Feuchtigkeit halten. </td></tr><tr><td> Pins stecken in Druckkopf oder Clogged. </td><td> Reinigen Sie den Druckkopf kostenlos Stift Bewegung zu ermöglichen. Saubere Stifte gründlich vor oder nach jedem Drucklauf Aggregate von Stiftkanälen zu entfernen. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Zellkultur und Execution-Assay. </td><td rowspan="2"> Zellablösung oder Tod auf Arrays nach der ersten Anlage. </td><td> Nachsaat und übermäßige Vermehrung. </td><td> Reduzieren anfängliche Aussaatdichte und Zeit. Verwenden Sie &quot;Wartung&quot; oder &quot;Differenzierung&quot; Medien während Array Kultur Zellproliferation zu reduzieren. </td></tr><tr><td> Freisetzung toxischer Acrylamidmonomer aus Hydrogel. </td><td> Einweichen Hydrogele in dH 2 O für mindestens 3 d für die Diffusion / Freisetzung von Acrylamidmonomer zu ermöglichen und Zelltoxizität reduzieren. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Die Zellen nicht legen zu Arrays. </td><td> Underseeding. </td><td> Erhöhen anfängliche Aussaatdichte und Zeit. Verwenden Sie eine stärker adhärenten Zelltyp. </td></tr><tr><td> Schlechte Ablagerung vonMatrix oder Biomolekül Zustand. </td><td> Saubere Stifte und Aggregate, Druckparameter bestätigen und zu bewerten Spotten von Fluoreszenzmarkern, zB Rhodamin-konjugierten Dextran. </td></tr><tr><td> Spezifität der Zell-Matrix-Wechselwirkungen. </td><td> Verschiedene Zelltypen haften spezifisch an einige, aber nicht andere ECM-Proteine. Testen Sie mehrere verschiedene ECM-Proteine ​​mit Ihren Zellen. </td></tr><tr><td> Suboptimale Array Lagerung nach der Herstellung. </td><td> Wir empfehlen über Nacht bei 65% relativer Luftfeuchtigkeit und Raumtemperatur hergestellten Arrays speichern, teilweise Phasenänderungen zu vermeiden, während des Einfrierens. Zelladhäsion ist empfindlich gegenüber sowohl Feuchtigkeit, Temperatur und Lagerzeit; sicherstellen, dass diese Parameter für Ihre Experimente konsistent / optimiert sind. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Detachment von Hydrogel aus Glassubstrat während der Zellkultur. </td><td> Schlechte Rutsche Reinigung und Silanisierung. </td><td> Ersetzen Arbeitslösungen für Dia-Reinigung undSilanisierung. </td></tr><tr><td> Overdehydrated Hydrogel. </td><td> Lassen Sie keine Hydrogele auf einer heißen Platte länger als 15-30 Minuten auszutrocknen. </td></tr><tr><td> 4. Analyse der Daten. </td><td> Hohe Variabilität zwischen Replikat Flecken und Dias. </td><td> Variability in der Arrayherstellung. </td><td> Überprüfen Sie, ob Stifte und Druckkopf sauber sind. Bestätigen Luftbefeuchter Funktion. Visualisieren und zu quantifizieren Stelle und Array Qualität unter Verwendung von fluoreszierenden Markern. Shop-Arrays, wie oben empfohlen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Fehlerbehebung.

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A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Aufrufe.  University of Illinois at Urbana–Champaign.  Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten. 

Serie: A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Forschung

Biotechnik

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

High-throughput Protein Expression Generator mit einem mikrofluidischen Plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

High-Throughput-Einzel-Zell-und Multiple-Zelle Mikroverkapselung

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Eine neue Methode zur Lokalisierung Reporter fluoreszierende Kügelchen In der Nähe der Zellkulturoberfläche für Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Ein Mikrofluidik-Plattform für Hochdurchsatz-Einzelzell-Isolierung und Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...