Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das schnelle, einfache und zuverlässige Alternativen zur Blutentnahme für das Rattenmodell bietet. Je nach Kontext beschreiben wir drei verschiedene Methoden der Blutentnahme: Schwanzvenenpunktion unter Narkose oder bei bewusstem Bewusstsein und dorsale Penisvenenpunktion unter Narkose.
In den meisten Versuchstierversuchen werden Blutproben benötigt, um verschiedene hämatologische Parameter zu beurteilen. In dieser Arbeit werden zwei Verfahren zur Blutentnahme bei Ratten vorgestellt: die laterale Schwanzvenenpunktion und die dorsale Penisvenenpunktion, die erhebliche Vorteile gegenüber anderen zuvor beschriebenen Techniken bieten. Diese Studie zeigt, dass diese beiden Verfahren eine schnelle Probenahme (unter 10 min) ermöglichen und ausreichende Blutvolumina für die meisten Assays (202 μl ± 67,7 μl) liefern. Die Punktion der dorsalen Penisvene muss unter Narkose durchgeführt werden, während die Punktion der lateralen Schwanzvene bei einem bewussten, zurückgehaltenen Tier durchgeführt werden kann.
Der Wechsel dieser beiden Techniken ermöglicht daher eine Blutentnahme in jeder Situation. Es wird zwar immer empfohlen, dass ein Bediener während eines Eingriffs unterstützt wird, um das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten, aber diese Techniken erfordern nur einen einzigen Bediener, im Gegensatz zu den meisten Blutentnahmemethoden, bei denen zwei erforderlich sind. Während diese zuvor beschriebenen Methoden (z. B. Halsstab, Blutabnahme der Schlüsselbeinvene) eine umfangreiche vorherige Schulung erfordern, um eine Schädigung oder den Tod des Tieres zu vermeiden, sind die Punktion der Schwanzvene und der dorsalen Penisvene selten tödlich. Aus all diesen Gründen und je nach Kontext (z. B. bei Studien mit männlichen Ratten, während der perioperativen oder unmittelbaren postoperativen Phase bei Tieren mit dünnen Schwanzvenen) können beide Techniken abwechselnd eingesetzt werden, um wiederholte Blutentnahmen zu ermöglichen.
Die Blutentnahme ist für die meisten Tierversuche sowohl in vivo als auch in vitro erforderlich. Da bei Ratten die Häufigkeit und Menge der Blutentnahme von Bedeutung sein kann, ist es hilfreich, verschiedene Alternativen für die Entnahme zu haben. In früheren Studien wurden verschiedene Methoden beschrieben.
Die am häufigsten verwendeten Techniken sind die Schwanzvenenpunktion und die Blutabnahme der Vena saphena. Die Schwanzvenenprobenahme ist für alle Rattenstämme geeignet. Mit der richtigen Ausbildung ist der Eingriff einfach durchzuführen und verursacht dem Tier nur minimalen Stress1. Ebenso ist die Blutabnahme der Vena saphena, sofern sie richtig durchgeführt wird, eine schnelle und einfache Entnahmemethode. Keine der beiden Methoden erfordert eine Anästhesie, und beide ermöglichen die wiederholte Entnahme kleiner Blutmengen. Die Punktion der Vena saphena führt jedoch in der Regel zu einem geringeren Blutvolumen1 und erfordert die Anwesenheit von zwei Personen, um eine Hintergliedmaße für die Punktion2 freizulegen.
Wenn große Mengen Blut von einem einzelnen Tier entnommen werden müssen, kann eine Herzpunktion oder Punktion der Hohlvene verwendet werden (einer 150-g-Ratte mit Herzpunktionkönnen bis zu 10 ml Blut entnommen werden 2). Diese Techniken erfordern eine Anästhesie und sind unheilbare Eingriffe. Das Tier muss nach einer dieser beiden Techniken eingeschläfert werden2. Der Halsstab ist eine Alternative, die eingesetzt werden kann, wenn in einer Studie, die ihren Endpunkt noch nicht erreicht hat, große Mengen Blut entnommen werden müssen. Diese Technik erfordert jedoch auch erhebliche technische Fähigkeiten, um Schäden für das Tier zu vermeiden. Daher sollte seine Verwendung eingeschränkt werden3.
Andere Techniken, wie z. B. die Blutabnahme der Schlüsselbeinvene, erfordern keine Anästhetika vor der Blutentnahme und ermöglichen die wiederholte Entnahme kleiner Blutmengen. Für diese Technik sind jedoch eine zurückhaltende Handhabung und ein entsprechender Nadelschnitt erforderlich. Eine unsachgemäße Operation kann zu Tierschmerzen oder sogar zum Tod führen, und das Training für diese Methode kann anspruchsvoll sein4.
Andere anekdotische Verfahren sind die Orbitapunktion und die sublinguale Venenpunktion, die beide eine Anästhesie erfordern und weder empfohlen noch weit verbreitet sind. Obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass die Blutentnahme durch Orbitapunktion schneller ist als durch eine Schwanzvenenpunktion, wurde festgestellt, dass die Orbitapunktion unter Diethyletheranästhesie weniger gut vertragen wurde als die letztere Methode (basierend auf den Erregungswerten der Tiere und der Urinproduktion)5. Darüber hinaus wird diese Methode stark von den Fähigkeiten der Person beeinflusst, die den Eingriff durchführt, und wird hauptsächlich von erfahrenen Tierärzten durchgeführt. Im Vergleich dazu ist die sublinguale Venenpunktion weniger belastend und wird für wiederholte Blutentnahmen empfohlen6. Diese Technik hat jedoch schwerwiegende Nebenwirkungen, wie z. B. eine verminderte Futter- und Wasseraufnahme, die zum Tod des Tieres führen können7.
In dieser Studie werden zwei Methoden beschrieben, die in unserem Labor zur wiederholten Blutentnahme verwendet werden. Die Punktion der Schwanzvene kann bei einem bewussten Tier durchgeführt werden, und die Gewebeschäden und unerwünschten Auswirkungen sind minimal. Die Modifikation dieser Technik in dieser Studie umfasst die Stabilisierung des Schwanzes mit Zeige- und Mittelfinger, wodurch ein einzelner Bediener die Blutentnahme durchführen kann. Die dorsale Penisvenenpunktion wurde bereits für einfache intravenöse Injektionen beschrieben. Diese Technik wird unter Narkose durchgeführt und ermöglicht eine zuverlässige Blutquelle bei Schwierigkeiten mit anderen Methoden (z. B. in der unmittelbaren postoperativen Phase bei einem Kleintier, bei der perioperativen Blutentnahme unter Narkose). Ähnlich wie bei der Schwanzvenenentnahme hat die Verletzung an der Einstichstelle im Vergleich zu den oben genannten Techniken einen geringen Gesamteffekt auf das Tier8. Ziel dieser Methodenarbeit ist es, unerfahrenen Forschern je nach Kontext einfache und zuverlässige Alternativen zur Blutentnahme anzubieten (z.B. für Eingriffe unter Narkose, für Studien mit männlichen Ratten, für Tiere mit dünnen Schwanzvenen).
Die Eingriffe wurden an 3 Monate alten männlichen Lewis-Ratten mit einem Gewicht von jeweils 300-400 g durchgeführt. Insgesamt wurden 24 Tiere mit drei Punktionsbedingungen eingeschlossen: 12 Ratten unterzogen sich einer Schwanzvenenpunktion ohne Narkose (Gruppen-TV ohne Anästhesie), und weitere 12 Ratten wurden anästhesiert, um sich sowohl einer Schwanzvenenpunktion (Gruppen-TV mit Anästhesie) als auch einer Penisvenenpunktion (Gruppe PV mit Anästhesie) zu unterziehen. Alle Verfahren wurden genehmigt und entsprechen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle Tiere wurden am Ende der Studie (nach einer 1-monatigen Nachbeobachtung) durch eine Überdosis Kohlendioxid eingeschläfert. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Allgemeine Richtlinien
2. Blutentnahme aus der Penisvene
3. Punktion der Schwanzvene
Abbildung 1: Schematische Darstellung der verschiedenen Punktionsmethoden in diesem Protokoll. (A) Modifizierte Schwanzvenenpunktion bei einem bewussten, gefesselten Tier; (B) modifizierte Schwanzvenenpunktion und Penisvenenpunktion unter Narkose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Erfolg wurde definiert als eine Blutabnahme, die mindestens 100 μl Blut in weniger als 10 Minuten (von der Einstichzeit bis zum Ende der Blutentnahme) lieferte, und ein Misserfolg wurde definiert als eine Blutabnahme, die weniger als 100 μl Blut ergab oder mehr als 10 Minuten benötigte, um das erforderliche Blutvolumen zu gewinnen. Pro Probe waren maximal 250 μl Blut erlaubt. Die statistischen Analysen wurden mit einem einfaktoriellen ANOVA-Test für Mehrfachvergleiche und dem Chi-Quadrat-Test durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, und p < 0,05 wurde als Cut-off zur Bestimmung der statistischen Signifikanz verwendet.
Der Vergleich der Erfolgsraten zeigte ähnliche Ergebnisse für die Schwanzvenenpunktion bei bewussten Ratten (92 %) und die Penisvenenpunktion unter Narkose (83 %) (p = 0,0543), wie in Abbildung 4 dargestellt. Interessanterweise wurde die Schwanzvene unter Narkose sehr unzuverlässig, und die Schwanzvenenpunktion unter Narkose hatte in dieser Studie nur eine Erfolgsquote von 25%, wahrscheinlich aufgrund einer Ausdünnung der Vene. In der Narkose war die Penisvenenpunktion erfolgreicher als die Schwanzvenenpunktion zur Probenahme (p < 0,0001).
Wir verglichen die gesammelten Blutvolumina und die Dauer des Eingriffs zwischen der Punktion der Schwanzvene und der dorsalen Penisvene, die bei Ratten unter Narkose durchgeführt wurde, und der Schwanzvenenpunktion, die bei bewussten Ratten durchgeführt wurde. Abbildung 5 zeigt, dass die Schwanzvenenpunktion ohne Narkose (217,5 μL ± 69,04 μL) und die Penisvene unter Narkose (185,8 μL ± 66,4 μL) vergleichbare Blutmengen ergaben (p = 0,4966), und diese Blutvolumina waren signifikant höher als das Volumen, das mit der Schwanzvenenpunktion unter Narkose (54,4 μL ± 68,8 μL) gewonnen wurde (p < 0,0001).
Die Dauer des Eingriffs war in der Gruppe der Penisvenenpunktion unter Narkose (315,2 s ± 160 s) und in der Gruppe der Schwanzvenenpunktion ohne Narkose (262,5 s ± 171 s) ähnlich (p = 0,6632). Abbildung 6 zeigt, dass die Probenahme in beiden Gruppen in weniger als 6 min durchgeführt wurde, während die Schwanzvenenpunktion unter Narkose aufgrund mehrfacher Misserfolge mehr als 8 min (500,8 s ± 196 s) dauerte (p < 0,0382).
Abbildung 2: Punktionsmethode der dorsalen Penisvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Modifizierte Methode der Schwanzvenenpunktion. Beachten Sie, dass der Schwanz nach unten gehalten wird und sich die Einstichstelle zwischen Zeige- und Mittelfinger befindet. Die Spritze sollte aufliegen und gegen den Zeigefinger gleiten, um einen stabilen Einstichwinkel zu erhalten. Die Verwendung der nicht-dominanten Hand ermöglicht die Stabilisierung des Schwanzes bei einem bewussten Tier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Erfolgsraten bei Schwanzvenenpunktion unter Narkose, Penisvenenpunktion unter Narkose und Schwanzvenenpunktion ohne Narkose . **** p < 0,0001 mit dem Chi-Quadrat-Test. Abkürzungen: TV = Schwanzvene; PV = Penisvene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich der erhaltenen Blutvolumina (in μL) in den drei Gruppen. ***p < 0,001; p < 0,0001 mit ANOVA-Analyse für Mehrfachvergleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Vergleich der Probenahmedauer (in Sekunden), definiert als die Zeit vom Zeitpunkt der Punktion bis zum Ende der Blutabnahme, in den drei Gruppen. Ein Versagen wurde definiert als eine Blutentnahmedauer, die länger als 600 s (10 min) dauerte. *p < 0,05; **p < 0,01 mit ANOVA-Analyse für Mehrfachvergleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Schwanzvenenpunktion ist eine effiziente Methode, um Blut von einer bewussten Ratte zu gewinnen. Wenn ein Tier jedoch unter Narkose steht, kann die Wirkung von Isofluran zu Gefäßkrämpfen führen und eine Schwanzvenenpunktion ungeeignet machen11. Wie in dieser Studie gezeigt wurde, besteht eine Alternative in dieser Situation darin, Blut aus der Penisvene zu entnehmen, was erfolgreicher ist und in kürzerer Zeit ein deutlich größeres Blutvolumen liefert. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass im Falle eines Scheiterns mit dieser Methode beim ersten Versuch nachfolgende Versuche erfolglos sein können. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Schwanzvenenpunktion mehrere aufeinanderfolgende Punktionen, falls es beim ersten Versuch schwierig ist (es gibt zwei Venen, und es kann versucht werden, weiter oben am Schwanz zu punktieren)1. Iterative Punktionen können jedoch eine Hämolyse in der Probe verursachen, die die Ergebnisse aufgrund der Freisetzung von Hämoglobin und den internen Komponenten der Erythrozytenmembranen verzerrt. Dies gilt insbesondere, wenn das Plasma analysiert wird12. Es ist vorzuziehen, mehrere Punktionen zu vermeiden und die Probe in einer einzigen Blutentnahme zu entnehmen.
Bei dieser Arbeit überstieg die Blutentnahme 250 μl pro Probe in Übereinstimmung mit diesem Protokoll und den IACUC-Richtlinien zur Berücksichtigung des Tierschutzes bei Mehrfachprobenentnahmen nicht. Fortschritte in der Bioanalytik haben die Verwendung von Mikroproben von weniger als 50 μl zur Beurteilung der biochemischen und metabolischen Parameter des Blutes ermöglicht 13. Daher reichen 250 μl aus, um zu dem Schluss zu kommen, dass beide Methoden für zukünftige Studien effizient sind. Sowohl die Schwanzvene als auch die Penisvene sind jedoch kleine Gefäße und lassen keine großen Blutmengen zu. Diese beschriebenen Methoden eignen sich für die wiederholte Probenahme und die Überwachung lebender Tiere. Wenn große Blutmengen erforderlich sind (z. B. für Eingriffe am Ende der Studie), sollten andere Methoden in Betracht gezogen werden, die mehr Blut liefern, wie z. B. eine Herzpunktion.
Diese beschriebenen Verfahren sind zwei von vielen; Unsere Wahl des Verfahrens wurde durch einige Vorteile motiviert. Beide Techniken können von einem einzigen Bediener ausgeführt werden. Die Verwendung von Zeige- und Mittelfinger zur Stabilisierung der Schwanzvene bei der modifizierten Schwanzvenentechnik macht eine komplementäre menschliche Fixierung überflüssig. Es ist jedoch notwendig, das Wohlergehen des Tieres zu beurteilen, und es wird immer empfohlen, die Hilfe eines Fachmanns (z. B. eines Tierarztes oder Veterinärtechnikers) zu erhalten, um unnötige Schmerzen oder Leiden zu vermeiden2.
Darüber hinaus erfordern die zuvor beschriebenen Methoden (z. B. Halsstab, Blutentnahme der Schlüsselbeinvene) eine umfangreiche vorherige Ausbildung, um Schäden oder den Tod des Tieres zu vermeiden. Im Gegensatz dazu ist eine Punktion der Schwanzvene oder der dorsalen Penisvene für die Ratte selten tödlich, auch wenn sie nicht gut ausgeführt wird. Diese Studie hatte einige Misserfolge bei beiden Methoden, aber es wurden keine anderen unerwünschten Wirkungen oder Todesfälle beobachtet. Es wurde über einige Fälle von Urinverhalt nach dorsalen Penisinjektionen berichtet, aber es ist unklar, ob die Injektion selbst oder das injizierte Mittel für dieses Ergebnis verantwortlich ist. Weder diese nachteilige Wirkung noch eine abnorme Heilung oder Infektion an der Einstichstelle wurden während des Studienzeitraums festgestellt. Darüber hinaus ergaben die täglichen Beurteilungen des Zustands der Tiere in keiner Gruppe Schmerzen oder Leiden (keine Porphyrinfärbung, kein Gewichtsverlust, Tiere, die vom Forschungsteam und den Tierärzten als angenehm beurteilt wurden). Längeres Fixieren und mehrfache Einstiche können jedoch zu Tierquälen führen. Um dies zu vermeiden, sollte die Nadel gedreht werden, wenn sich der Blutfluss verlangsamt, anstatt den Einstich zu wiederholen. Es wird empfohlen, den Schwanz mit heißem Wasser und einem Heizkissen richtig zu erwärmen, um die Schwanzvene zu vasodilatieren, sowie diese Methoden zu üben, um die Rückhaltezeit zu verkürzen.
Die Methoden der Schwanzvenenpunktion und der dorsalen Penisvenenpunktion ermöglichen eine schnelle Probenahme (unter 6 Minuten) und liefern ausreichende Blutvolumina für die meisten Assays. Wenn sie bei einem bewussten Tier durchgeführt wird, ist die Schwanzvenenpunktion eine effiziente und zuverlässige Methode, um Blut zu gewinnen. Bei einem sedierten Tier neigen Anästhetika jedoch dazu, Gefäßkrämpfe zu verursachen, und die Schwanzvene unterliegt einer erheblichen Ausdünnung11. In diesem Szenario bietet die Punktion der Rückenvene des Penis eine bessere Erfolgsrate als die Punktion der Schwanzvene, die für die Blutentnahme tendenziell unzuverlässig ist. Eine Einschränkung der Penisvenenblutabnahme besteht jedoch darin, dass sie nur an männlichen Ratten durchgeführt werden kann und daher für weibliche Rattenstudien ungeeignet ist. Daher können je nach Kontext (d. h. Geschlecht des Tieres, perioperative oder postoperative Blutabnahme, Tiere mit dünnen Schwanzvenen) sowohl die Penisvenenpunktion als auch die Schwanzvenenpunktion abwechselnd für wiederholte Blutentnahmen verwendet werden, auch von Forschern mit wenig bis gar keiner Erfahrung mit Tierversuchen.
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.
Diese Arbeit wurde von Shriners Children's Boston (B. E. U., K.U., C.L.C.) finanziert. L.C. wird von "La Bourse des Gueules Cassées", "La Bourse Année Recherche" und "La Bourse de l'Amicale des Anciens Internes des Hôpitaux de Paris" finanziert. Y.B. wird von "La Bourse des Gueules Cassées" gefördert. Y.B. und I.F.V.R. werden von den Shriners Hospitals for Children finanziert (die Fellowships-ID lautet #84308-BOS-22 bzw. #84302-BOS-21). Dieses Material basiert teilweise auf Arbeiten, die von der National Science Foundation im Rahmen des Stipendiums Nr. EWG 1941543. Die teilweise Unterstützung durch die US-amerikanischen National Institutes of Health (R01EB028782, R56AI171958 und R01DK114506) wird dankbar gewürdigt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 mL | 28 G ½ Insulin Syringes | BD | 329424 | for tail vein puncture |
0.5 mL | 30 G x 5/16 Insulin Syringes | BD | 320468 | for penile vein puncture |
250 L Microtainer blood collection tubes with K2EDTA | BD | 365974 | |
Gauze Sponges | Curity | 6939 | |
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine | E-Z Systems | EZ-190F | for penile vein puncture |
Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | for penile vein puncture |
Nosecone for Anesthesia | World Precision Instruments | EZ-112 | for penile vein puncture |
Rodent Restraint Cone | Harvard Apparatus | ST2 52-95-86 | for tail vein puncture |
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable) | Peco Services Ltd | 69023 | |
Webcol Alcohol prep pads | Simply Medical | 5110 |
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