Entdeckung metastasierender Regulatoren mit einem schnellen und quantitativen intravitalen Chick Chorioallantoic Membrane Model

Dies ist eine effektive Methode, um nach Suppressoren oder Treibern von Krebsmetastasen zu suchen. Zellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert werden, werden in das Gefäßsystem der Chorioallanto-Membran des Huhns injiziert, um metastatische Kolonien zu bilden. Kolonien mit verminderter oder erhöhter Invasivität werden herausgeschnitten, erweitert, neu injektiert, um ihren Phänotyp zu bestätigen, und schließlich mit Hochdurchsatzsequenzierung analysiert.

Jüngste Fortschritte in der Krebsforschung haben die hochkomplexe Natur der Krebsmetastasierung veranschaulicht. Es wurde festgestellt, dass mehrere Gene oder Gennetzwerke an der differentiell regulierenden Krebsmetastasat von Kaskadengenen und Genprodukten beteiligt sind, die von der Krebsart, dem Gewebe und den individuellen Patientenmerkmalen abhängen. Diese stellen potenziell wichtige Ziele für genetische Therapeutika und ansätze der personalisierten Medizin dar. Die Entwicklung von Schnellscreening-Plattformen ist für die Identifizierung dieser genetischen Ziele unerlässlich.

Die Chorioallantoic Membrane (CAM) ist eine stark vaskularisierte, kollagenreiche Membran unter der Eierschale, die den Gasaustausch im sich entwickelnden Embryo ermöglicht. Aufgrund der Lage und Vaskularisierung des CAM haben wir es als intravitaselles menschliches Krebsmetastasierungsmodell entwickelt, das eine robuste Xenotransplantation menschlicher Krebszellen und echtzeitfähige Bildgebung von Krebszellinteraktionen mit der kollagenreichen Matrix und dem Gefäßsystem ermöglicht.

Mit diesem Modell wurde eine quantitative Screening-Plattform zur Identifizierung neuartiger Treiber oder Suppressoren von Krebsmetastasen entwickelt. Wir transduzierten einen Pool von Kopf-Hals-HEp3-Krebszellen mit einer vollständigen shRNA-Genbibliothek des menschlichen Genoms und injizierten die Zellen dann mit geringer Dichte in das CAM-Gefäßsystem. Die Zellen vermehrten sich und bildeten Einzeltumorzellkolonien. Einzelne Kolonien, die nicht in das CAM-Gewebe eindringen konnten, wurden als kompakter Koloniephänotyp sichtbar und zur Identifizierung der in den Zellen vorhandenen transduzierten shRNA herausgeschnitten. Bilder einzelner Kolonien wurden auf ihre Invasivität untersucht. Mehrere Auswahlrunden wurden durchgeführt, um die Rate der Falschalarme zu senken. Einzelne, isolierte Krebszellklone oder neu entwickelte Klone, die Gene von Interesse exprimieren, wurden einem primären Tumorbildungstest oder einer Kooptionsanalyse der Krebszellengefäße unterzogen. Zusammenfassend stellen wir eine schnelle Screening-Plattform vor, die eine antimetastasierte Zielidentifikation und intravitasale Analyse einer dynamischen und komplexen Kaskade von Ereignissen ermöglicht.

Metastasierung ist die Hauptursache für den Tod von Krebspatienten^1,2,3. Metastasierte Krebszellen nutzen unterschiedliche Signalwege, abhängig von der Art des Krebses, während der fünf Schritte der metastasierten Kaskade: lokale Invasion, Intravasation, Überleben im Kreislauf, Extravasation und Kolonieexpansion an entfernten metastatischen Stellen. Das aktuelle Verständnis dieses metastasierten Prozesses legt nahe, dass es zwei Engpassschritte gibt, einer ist die gerichtete Invasion der Krebszelle aus dem Primärtumor und der zweite ist die Etablierung der metastasierten Läsion an der entfernten Stelle^4,5,6. Beide Schritte erfordern, dass Krebszellen aktiv mit Kollagen und Vaskulatur an den Stellen der anfänglichen Invasion oder der Bildung von fernen metastasierten Läsionen interagieren. Daher müssen metastasierende Krebszellen in der Lage sein, sich an Zellen zu binden, Kollagenfasern umzugestalten und direkt entlang der Gefäßwände einzudringen⁷. Screening-Modelle, die schnell antimetostatische therapeutische Ziele identifizieren können, um Krebszellen daran zu hindern, diese Schritte abzuschließen, sind von größter Bedeutung. Bestehende In-vitro-Screening-Modelle ahmen die komplexe Lebendgewebeumgebung nicht vollständig nach. Mausmodelle sind teuer und zeitaufwendig. Daher besteht ein dringender Bedarf an intravitalen Screening-Plattformen, die komplexe Lebendgewebeumgebungen und eine schnelle Identifizierung von Zielen ermöglichen.

In den letzten zehn Jahren hat sich der Hühnerembryo als robustes und kostengünstiges Modell der menschlichen Krebsmetastasierung etabliert^8,9,10,11,12. Das Chischorioallantoic Membrane (CAM) Gewebe ist dünn und durchscheinend, was es ideal für die intravitale mikroskopische Bildgebung von Zell- und Kolonieverhalten in Primärtumoren und / oder metastasierten Stellen^{macht 12}. Das primäre Tumorwachstum aus mehreren menschlichen Krebszelllinien kann innerhalb von nur wenigen Tagen nach der Mikroinjektion in das CAM-Gewebe initiiert und metastasiert werden. Krebszellen können auf verschiedene Arten in das CAM-Gewebe verabreicht werden, einschließlich intravenös, intra-CAM oder als Kollagen auf Pflanzen, diese Flexibilität ermöglicht es dem Forscher, sich auf bestimmte Stadien der Krebsprogression zu konzentrieren, zum Beispiel metastatische Läsionsbildung, Invasion aus dem Primärtumor oder Angiogenese.

Hier beschreiben wir eine quantitative Screening-Plattform, mit der die Fähigkeit von Krebszellen gemessen werden kann, invasive metastatische Läsionen zu etablieren. Krebszellen, die mit einer Expressionsbibliothek transduziert wurden, werden intravenös in das CAM-Gefäßsystem mit geringer Dichte injiziert. Metastasierte Kolonien bilden sich für 4-5 Tage, dann wird die Invasionsfähigkeit und Vaskulaturinteraktion der resultierenden Kolonien bewertet. Einzelne Kolonien, die nicht eindringen, werden herausgeschnitten, vermehrt und ihr Phänotyp wird im CAM durch Reinjektion und Quantifizierung der Koloniekompaktheit und der Kontakt zwischen Krebszelle und Blutgefäßen bestätigt. Die Expressionsbibliothekskonstrukte, die für den einzelnen metastasierten Koloniemutantenphänotyp verantwortlich sind, werden aus isolierter koloniegenomischer DNA mittels Hochdurchsatzsequenzierung identifiziert. Die gleiche Plattform kann weiter verwendet werden, um den kausalen Zusammenhang zwischen einem Gen und dem beobachteten Phänotyp zu validieren oder um eingehende mechanistische Studien am beobachteten Phänotyp durchzuführen.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Alberta durchgeführt. Vogelembryonen werden von vielen Forschungsinstituten nicht als lebende Tiere angesehen und es sind keine Tierprotokolle erforderlich. Es ist jedoch eine akzeptierte Ansicht, dass Vogelembryonen Schmerzen empfinden können und daher so human wie möglich behandelt werden müssen. Die örtliche Tierversuchsbehörde muss vor DerAufnahme von Forschungsarbeiten kontaktiert werden, um sicherzustellen, dass die ordnungsgemäßen Vorschriften eingehalten werden.

1. Schalenlose Eikultur

1. Erwerben Sie befruchtete Hühnereier vom lokalen Anbieter. Dieses Experiment verwendet White Leghorn Hühnerrasse; es können jedoch auch andere Rassen verwendet werden.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 10% mehr Eier als nötig zu erwerben, falls einige der Embryonen während des Crackens beschädigt werden und in diesem Protokoll nicht verwendet werden können.
2. Die erforderliche Anzahl von Eiern in einen 60% befeuchteten Schaukelinkubator überführen. Der Rest der Eier kann bis zu zwei Wochen bei 12 °C ohne Verlust der Lebensfähigkeit gelagert werden.
3. Die Eier vier Tage lang im befeuchteten Schaukelbrutschrank bebrüten.
   HINWEIS: Tag 1 ist, wenn die Eier in den Schaukelinkubator überführt werden.
4. Bereiten Sie das Wiegegeschirr und die Kunststoffdeckel für die schalenlose Eikultur vor. Schneiden Sie eine der Ecken jeder der Wiegeschalen ab, um einen effizienten Luftzugang zum Embryo zu ermöglichen (Abbildung 1A).
5. Ordnen Sie das vorbereitete Wiegegeschirr in Reihen in der Flow-Hood an. (Abbildung 1b).
6. In einer separaten Wiegeschale 70% Ethanol für die Eispülung zubereiten.
7. Tauchen Sie das Ei kurz in 70% Ethanol und verwenden Sie dann das elektrische Rotationswerkzeug, um vorsichtig vier 2-3 mm Schnitte parallel zum größten Breitendurchmesser des Eies zu machen (Abbildung 1C).
8. Das geschnittene Ei in eine Wiegeschale geben und das Ei vorsichtig gegen den Tellerboden drücken, bis sich ein Riss in der Eierschale bildet (Abbildung 1D).
9. Ziehen Sie die Eischalenhälften auseinander und lassen Sie den Embryo in die Wiegeschale gleiten. Entsorgen Sie die Eierschale und bedecken Sie die Wiegeschale mit einem Deckel.
10. Die Embryonen werden in einen befeuchteten, nicht schaukelnden Inkubator überführen (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Wägeschalen mit den Embryonen werden in separate Kunststoffbehälter (12 Embryonen/Behälter) gegeben. Dies erhöht die Lebensfähigkeit des Embryos und ermöglicht eine experimentspezifische Embryoorganisation.
11. Inkubieren Sie Embryonen für weitere 6 Tage (bis sie 10 Tage alt sind). Überprüfen Sie täglich auf tote oder kontaminierte Embryonen und entfernen Sie sie aus dem Inkubator.
    HINWEIS: Embryonen können durch schimmelpilzgetragene Sporen kontaminiert sein. Schimmelpilzkontaminationen manifestieren sich zunächst als weiße Flecken auf der CAM-Oberfläche des Embryos. Entfernen Sie die kontaminierten Embryonen sofort und wischen Sie den Inkubator wöchentlich mit 70% Ethanol ab, um die Kontamination zu verhindern. Nach unserer Erfahrung sind die Kontaminationswerte sehr niedrig ~ 1-3%.
12. Verwenden Sie diese Embryonen für die Injektion von Krebszellen am Morgen des 10. Tages.

2. Vorbereitung der Krebszellen für die Injektion

HINWEIS: Die Metastasierte Kolonieselektion basiert auf einem Phänotyp, der von fluoreszierenden Krebszellen etabliert wurde, abgeleitet von einer Expressionsbibliothek oder einem Vektor, der mit fluoreszierendem Protein wie grünem oder rotem fluoreszierendem Protein markiert ist (siehe den gesamten Bildschirmfluss in Abbildung 2A). Es wird nicht empfohlen, Zellen zu verwenden, die vorübergehend mit fluoreszierenden Proteinen transfiziert oder mit zelldurchlässigen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, da das Signal durch die Proliferation von Krebszellen und ungleichmäßige Färbung schnell verblasst.

1. Kultur Krebszellen zu 60-70% Konfluenz zum Zeitpunkt der Injektion. Die Verwendung von Krebszellen auf höheren Konfluenzstufen verringert ihre Lebensfähigkeit, was zu einer geringen Effizienz der metastasierten Koloniebildung führt. Stellen Sie sicher, dass die verwendeten Krebszellen frei von Mykoplasmen sind, da eine Mykoplasmenkontamination zu einer verminderten Lebensfähigkeit von Hühnerembryonen führen kann.
2. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS pH 7,4. Entfernen Sie das restliche PBS, fügen Sie dann 0,5% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie es bei 37 °C für 2-5 min, bis alle Zellen von der Oberfläche der Kulturschale angehoben sind.
3. Die Zellsuspension in 15 mL konisches Röhrchen und Zentrifugenzellen bei Raumtemperatur bei 200 x g für 5 min geben.
4. Resuspend Zellen in 10 ml PBS und zentrifugieren Sie die Zellen wieder wie in Schritt 2.3, um Trypsin und andere Nährmedienkomponenten wie Antibiotika zu entfernen.
   HINWEIS: Das Vorhandensein von Trypsin oder Zellkulturkomponenten wie Antibiotika in der Krebszellsuspension kann zu einer verminderten Lebensfähigkeit des Hühnerembryons führen.
5. Saugen Sie vorsichtig die überstandenden und resuspendierten Zellen mit 1 ml eiskaltem PBS ab.
6. Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem anderen verfügbaren Zellzählgerät.
   HINWEIS: Dieses Screening-Protokoll erfordert, dass jede metastasierende Kolonie von einer einzelnen Zelle initiiert wird. Achten Sie beim Zählen der Zellen darauf, dass die Zellen vollständig trypsinisiert sind und als Einzelzellsuspension existieren (es sind keine Zellklumpen vorhanden).
7. Für intravenöse (IV) Injektion konzentrieren Sie Zellen auf 0,5 x 10⁶ bis 1,0 x 10⁶ Zellen/ml. Verwenden Sie eiskaltes 1x PBS, um Zellkonzentrate zu verdünnen und/oder wieder aufzuziehen. Erwarten Sie, dass etwa 1 ml Zellsuspension für jeweils zehn Embryonen benötigt wird.
   HINWEIS: Die notwendige Zellsuspensionskonzentration in suspension wird hauptsächlich durch den Grad der Experimentiererfahrung bestimmt. Weitere Informationen finden Sie im nächsten Abschnitt.

3. Intravenöse Injektion von Krebszellen zur metastasierenden Koloniebildung

HINWEIS: Nach diesem Protokoll können innerhalb eines Tages bis zu hundert Embryonen injiziert werden. Es dauert im Allgemeinen länger, die metastasierten Kolonien zu isolieren (Schritt 5) als die Krebszellen zu injizieren, und daher wird empfohlen, ein erstes Experiment durchzuführen, um die Zeit abzuschätzen, die benötigt wird, um alle Schritte abzuschließen. Die Verwendung differentieller Fluoreszenzmarker von Krebszellen hilft, die Anzahl der Tiere und die für jedes Experiment erforderliche Zeit zu reduzieren. Beispielsweise können Kontrollzellen mit RFP (rot fluoreszierendes Protein) markiert werden, während mutierte Tumorzellen alternativ mit GFP (grün fluoreszierendes Protein) markiert werden können. In diesem Fall verfügt jedes Experiment über eine integrierte Steuerung, die die Variabilität zwischen den Embryonen korrigiert.

1. Bauen Sie die Injektionsvorrichtung wie in Abbildung 2Bdargestellt zusammen. Montieren Sie zuerst eine Nadel auf die Spritze und verlängern Sie dann die Spritzennadel mit einem 3-5 cm langen Stück Schlauch.
2. Brechen Sie die Spitze der Borosilikatnadel mit der feinen Zette (~20-60 μL breit) ab.
3. Beladen Sie die Spritze mit der Krebszellsuspension (50-200 μL) und führen Sie die Borosilikatnadel in den Schlauch ein (Abbildung 2B).
4. Untersuchen Sie die Borosilikatnadel auf Zellverstopfungen und Luftblasen. Es ist wichtig, Zellen als Einzelzellsuspension zu injizieren, um sicherzustellen, dass jede metastatische Kolonie von einer einzelnen Zelle initiiert wird.
   HINWEIS: Krebszellen neigen dazu, sich innerhalb von 1-2 Stunden nach der Trypsinisierung in PBS zu aggregieren und sollten daher unmittelbar vor der Injektion vorbereitet werden. Bei Bedarf können die Zellen periodisch mit der 1-ml-Spritze, die für Injektionen verwendet wird (ohne Borosilikatnadel), resuspendiert werden.
5. Wenn eine Zellverstopfung innerhalb der Kapillare beobachtet wird, entfernen Sie die Kapillare, suspendieren Sie die Zellen erneut und ersetzen Sie sie durch eine neue Kapillare. Verwenden Sie den Kolben, um Blasen herauszudrücken. Wenn keine Zellverstopfung oder Blasen beobachtet werden, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
6. Entfernen Sie den Deckel und übertragen Sie den Embryo unter das Stereoskop. Identifizieren Sie die geeignete Vene, die auf die CAM-Oberfläche injiziert werden soll. Venen und Arterien bilden das komplizierte Netzwerk innerhalb des CAM-Gewebes (Abbildung 2C). Venen zeichnen sich durch die hellere rote Farbe aus, da sie sauerstoffreiches Blut zum Embryo transportieren.
   HINWEIS: Für die allgemeine Embryomanipulation, die Injektion von Krebszellen und die Exzision metastasierender Kolonien verwenden Sie ein fluoreszierendes Stereomikroskop, das mit 0,8-fachen und 1,5-fachen Zielfernrohren und 10-fachen Okularen zur Visualisierung ausgestattet ist. Auch weniger fortschrittliche Mikroskope können je nach Erfahrungsniveau der Benutzer erfolgreich eingesetzt werden. Leser können sich an die Autoren wenden, um detailliertere Empfehlungen zu erhalten.
7. Finden Sie die ideale Vene, um Zellen zu injizieren, die normalerweise nur geringfügig breiter (10-20%) als der Durchmesser der Borosilikatnadelspitze ist und sich in der Mitte zwischen dem Embryo und der Wiegeschalenwand befindet. Es ist im Allgemeinen einfacher, an der Stelle zu injizieren, die unmittelbar an die Venenverzweigung angrenzt.
   HINWEIS: Die Injektion in eine größere Vene kann einfacher erscheinen, führt jedoch zu übermäßigen Blutungen und einem verminderten Überleben des Embryos.
8. Drücken Sie die Nadelspitze gegen die Blutgefäßwand und drücken Sie sanften Druck in die gleiche Richtung wie der Blutfluss aus. Verwenden Sie bei Bedarf einen Wattestäbchen (in der anderen Hand gehalten), um das injizierte Gefäß zu verankern oder zu stabilisieren.
9. Drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig ab. Man kann sich eine erfolgreiche Injektion vorstellen, indem man eine "Reinigung" des Blutgefäßes beobachtet, wenn die Krebszellsuspension in den Blutkreislauf gelangt.
10. Drücken Sie den Spritzenkolben für 2-10 s weiter, bis das gewünschte Suspensionsvolumen in den Blutkreislauf der Vene injiziert wird. Alles in allem kann die Injektion eines einzelnen Embryos je nach Erfahrungsniveau des Benutzers 1-10 Minuten in Auftrag ziehen. Wenn an der Injektionsstelle übermäßige Blutungen oder eine klare Flüssigkeitsansammlung auftreten, verwerfen Sie den Embryo.
    HINWEIS: Es ist einfach, einen Embryo zu "überinjizieren". Die allgemeine Überlegung, die beachtet werden sollte, ist, dass metastatische Kolonien sich nach einer Wachstumsperiode von 4-5 Tagen nicht berühren sollten. Idealerweise sollten ~ 5-10% der terminalen CAM-Venenkapillaren nach einer erfolgreichen Injektion Zellen immobilisiert haben (Abbildung 2D, E). Wie in Schritt 2 erwähnt, kann ein Bereich der Zellkonzentration verwendet werden (0,5 x 10⁶ - 1,0 x 10⁶ Zellen/ml). Niedrigere Konzentrationen erfordern eine längere Injektionszeit, verringern jedoch die Verstopfung der Nadel. Höhere Konzentrationen erfordern kürzere Injektionszeiten, erhöhen jedoch die Nadelverstopfung. Es wird empfohlen, mehrere Konzentrationen auszuprobieren, um diejenige zu finden, die für einen Bediener am bequemsten ist. Im Allgemeinen wird eine höhere Konzentration (1,0 x 10⁶ Zellen/ml) bevorzugt, um die Injektionszeit zu verkürzen.
11. Entfernen Sie die Nadel aus dem CAM und tupfen Sie die Injektionsstelle vorsichtig mit einem Wattestäbchen ab, um Blut oder überschüssige Krebszellen zu entfernen.
12. Decken Sie den Embryo in der Wiegeschale mit einem Deckel ab und geben Sie den injizierten Hühnerembryo in den Inkubator zurück.
13. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem nächsten Embryo, bis alle Embryonen injiziert sind.

4. Embryo-Erhaltung während des metastasierten Koloniewachstums

1. Untersuchen Sie die Embryonen visuell. Wenn es tote und / oder mit Bakterien oder Schimmel kontaminierte sind, entfernen Sie sie aus dem Inkubator, dann autoklavieren und entsorgen Sie sie gemäß den Laborentsorgungsverfahren.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, dass Embryonen jeden zweiten Tag (Tage 1, 3, 5 nach der Injektion von Krebszellen) auf metastasierendes Koloniewachstum untersucht werden. Vermeiden Sie es, die injizierten Embryonen unnötig zu bewegen, da dies zu Embryoschäden und / oder Zum Tod führen kann.
2. Wenn Zellen überwuchert (metastatische Kolonien überlappen sich miteinander) oder eine ungleichmäßige Verteilung innerhalb des CAM-Gewebes (metastatische Kolonien in kleinen Unterbereichen der CAM-Oberfläche) aufweisen, entfernen Sie diesen Embryo aus dem Experiment. Euthanasierte weggeworfene Embryonen durch Einfrieren bei -20 °C (oder einer anderen zugelassenen Methode) unmittelbar nach der Entfernung aus dem Experiment. Die Anzahl der lebensfähigen metastasierten Zellen im CAM-Gewebe nimmt zunächst ab (Tage 1-2) und nimmt dann zu (Tage 2-5).
   HINWEIS: Einige Embryonen können die Krebszellen "abstoßen", dh alle Krebszellen verschwinden aus dem CAM-Gewebe. Diese Embryonen sollten aus dem Experiment entfernt werden. Normalerweise können Krebszellenkolonien durch den transparenten Deckel unter dem fluoreszierenden Stereomikroskop gesehen werden, ohne die Wiegeschale zu öffnen.
3. Stellen Sie sicher, dass metastatische Kolonien einheitlich aussehen (erste 1-3 Tage nach der Injektion). Identifizieren Sie invasive oder nicht-invasive metastatische Kolonien an den Tagen 4-5 nach der Injektion (siehe Abschnitt 5 für weitere Details).

5. Isolierung metastasierender Kolonien

1. Am Tag 5 nach der Injektion embryonieren Embryonen aus dem Inkubator und untersuchen die EMBRYO-CAMs auf metastatische Kolonieverteilung. Identifizieren Sie die Embryonen mit gleichmäßiger Kolonieverteilung, in denen kompakte (oder übermäßig invasive) Kolonien vorhanden sind.
   HINWEIS: Der Prozess der Kultivierung von Hühnerembryonen ist nicht steril, daher müssen alle Screening-Schritte unter sehr sauberen Bedingungen durchgeführt werden, um eine zukünftige Gewebekulturkontamination zu vermeiden. Kontamination es ist ziemlich selten und kann leicht vermieden werden, indem Handschuhe und eine Maske getragen werden und nur sterile Werkzeuge während der Zellinjektion und Kolonieisolation verwendet werden. Es wird empfohlen, Embryonen einzeln zu untersuchen, um ihre Exposition gegenüber der Umgebungstemperatur des Labors zu verringern und eine Kontamination zu verhindern.
2. Lokalisieren Sie die metastatische Kolonie von Interesse. Eine kompakte Kolonie kann als eine mit den meisten Krebszellen beschrieben werden, die sich in einem begrenzten Bereich im CAM-Gewebe befinden (Zellen erscheinen "zusammengeklumpt"). Eine invasive Kolonie kann als Kolonie beschrieben werden, bei der Krebszellen im CAM-Gewebe "streuen" (Abbildung 3A, B).
   HINWEIS: Die "Kompaktheit" der metastasierten Kolonie kann entweder durch die Hemmung der Invasion von Krebszellen, die Hemmung der Proliferation von Krebszellen oder beides erklärt werden. Auf alle Szenarien sollte geachtet und Kontaktkolonien isoliert werden (Abbildung 3A,B). Ein einfaches fluoreszierendes Stereomikroskop kann verwendet werden, um zwischen kompakten und invasiven metastasierten Koloniephänotypen zu unterscheiden.
3. Unter dem Präpariermikroskop das CAM-Gewebe, das die metastatische Kolonie von Interesse enthält, mit einer feinen Handzette vorsichtig nach oben ziehen (Abbildung 3C).
4. Schneiden Sie das CAM-Gewebe, das die metastatische Kolonie enthält, mit einer chirurgischen Schere ab.
5. Übertragen Sie das CAM-Gewebe, das die metastatische Kolonie enthält, in ein leeres, steriles 1,5-ml-Röhrchen (auf Eis) und schließen Sie den Röhrendeckel.
   HINWEIS: Isolierte Kolonien können bis zu 3 Stunden ohne Verlust der Lebensfähigkeit auf Eis gehalten werden.
6. Wiederholen Sie den Exzisionsprozess, bis alle interessierenden Kolonien in separaten Röhrchen gesammelt sind. Um Tierleid zu vermeiden, schneiden Sie nicht mehr als 2-3 Kolonien aus einem Embryo heraus. Euthanasiern Sie Embryonen durch Einfrieren bei -20 °C (oder einer anderen zugelassenen Methode) unmittelbar nach der Kolonieexzision.
7. Zerhacken Sie das CAM-Gewebe vorsichtig in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer sterilen 18-Gauge-Nadel. Verwenden Sie für jede Kolonie eine separate Nadel.
8. 100 μL 1x Kollagenaselösung 1x hinzufügen und 30 min bei 37 °C inkubieren.
9. Drehen Sie die Zellen und das CAM-Gewebe bei 300 x g für 5 min bei Umgebungstemperatur herunter.
10. Saugen Sie die Kollagenaselösung ab und resuspendieren Sie die Zellen in vollständigen Medien, die für die zellige Linie von Interesse verwendet werden.
    HINWEIS: Normalerweise wird CAM-Gewebe nach der Kollagenase-Behandlung nicht vollständig dissoziiert und Krebszellen vermehren sich zuerst in den CAM-Gewebestücken und wandern erst später auf die Gewebekulturschale.
11. Drehen Sie die Zellen und das CAM-Gewebe erneut bei 300 x g für 5 min bei Umgebungstemperatur.
12. Resuspend Zellen und CAM-Gewebestücke in 1 ml vollständigem Medium plus Selektionsfaktor (falls vorhanden), dann in eine einzelne 12-Well-Gewebekulturschale übertragen.
    HINWEIS: Hühner-CAM-Fibroblasten können in Gewebekultur für mehrere Passagen persistieren, die die klonale Expansion hemmen. Die Fähigkeit, die metastasierten Kolonien in Gegenwart eines Selektionsfaktors zu erweitern (d.h. wenn ein Vektor, der verwendet wurde, um Krebszellen fluoreszierend zu machen, auch für ein Antibiotikaresistenzgen von Säugetieren kodiert), kann die klonale Expansion erheblich beschleunigen. Vor dem Screening sollte ein Tötungskurvenexperiment durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die richtige Konzentration des Antibiotikums verwendet wird.
13. Für die nächsten 1-3 Wochen überwachen Sie Krebszellen täglich auf Wachstum und Kontamination.
14. Wenn Zellen 70-80% der Konfluenz erreichen, übertragen Sie Zellen in eine kulturstärkere Kulturschale.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen zu erweitern, bis mindestens zwei kryogene Fläschchen jedes Klons eingefroren werden können. Die Aufrechterhaltung großer Mengen an Gewebekultur kann mühsam und unnötig sein.
15. Fahren Sie mit der Sequenzierung oder der nächsten Selektionsrunde fort, sobald genügend Krebszellenzahlen erreicht sind. Im Allgemeinen sind 1 x 10⁶ Krebszellen für moderne Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken ausreichend.
16. Fahren Sie mit der Klon-Reinjektion und der Bildgebung und Quantifizierung der Koloniekompaktheit oder des Kontakts zwischen Krebszelle und Blutgefäß fort (Abbildung 2A). Alternativ können Sie mit der Hochdurchsatzsequenzierung fortfahren oder die Kolonieauswahl wiederholen.
    HINWEIS: Um die Anzahl der Falschalarme zu verringern, werden mindestens zwei Auswahlrunden empfohlen. Zwei Ansätze wurden erfolgreich eingesetzt. 1) Erweitern Sie jeden Klon und werfen Sie ihn einzeln aus, um den Koloniephänotyp zu bestätigen. 2) Mischen Sie alle expandierten Klone im Verhältnis 1:1, werfen Sie sie als Mischung neu ein und wiederholen Sie den Auswahlzyklus.

6. Injektion von fluoreszierend markierten Lektinen in das CAM-Gefäß.

1. Identifizieren Sie die zu injizierenden Vene. Es ist einfacher, die gleiche Injektionsstelle für Lektin zu verwenden, die für die Injektion von Tumorzellen verwendet wurde.
2. Fluoreszierende Lektin-Stammlösung (5 mg/ml) 50-100x mit 1x PBS verdünnen und in die gleiche Injektionsvorrichtung wie für die Injektion von Krebszellen laden.
   HINWEIS: Die Menge an Lektin, die zur Visualisierung der Blutgefäße injiziert werden muss (normalerweise 20-100 μL), hängt von der Mikroskopempfindlichkeit ab und sollte vor dem Screening experimentell bestimmt werden.
3. Injizieren Sie Lektin mit der gleichen Technik wie bei der Injektion von Tumorzellen (siehe Schritte 3.6.-3.10.).
4. Nach der Lektininjektion legen Sie den Embryo in den Inkubator, um sich für 5 Minuten zu erholen. Injizieren Sie nur einen Embryo gleichzeitig und unmittelbar vor der Bildgebung des Embryos.
   ANMERKUNG. Embryonen, die 12 Tage oder älter sind, erholen sich in der Regel gut von den Lektininjektionen und können am nächsten Tag wieder mit Lektin für die sequenzielle Bildgebung insejektiert werden. Jüngere Embryonen sind empfindlicher und können blutgerinnungsformulieren.

7. Visualisierung von Krebszell-Blutgefäß-Kontakten

1. Stellen Sie das temperaturgeregelte Mikroskopgehäuse ca. 6 h vor der Bildgebung auf 37 °C ein. Dies stabilisiert die Mikroskoptemperatur und trägt dazu bei, die XYZ-Drift während der Bildgebung zu minimieren.
   ANMERKUNG. Für dieses Experiment wurde eine spezielle Hühnerembryo-Bildgebungskammer^9,10,11, 12^,13 verwendet. Ein einfaches fluoreszierendes Dissektionsmikroskop kann für alle Schritte verwendet werden, angefangen bei der Injektion von Krebszellen über die Klonselektion und Klonwieinfektion bis hin zur Bewertung der Koloniekompaktheit. Ein konfokales Mikroskop, das mit einer Bildgebungskammer ausgestattet ist, ist für die Bildgebung und Quantifizierung von Kontakten zwischen Krebszelle und Blutgefäßen notwendig. Bis zu 1 h ist keine Erwärmung erforderlich und im Allgemeinen überleben Embryonen mindestens zwei aufeinanderfolgende Bildgebungssitzungen ohne Auswirkungen auf ihre Lebensfähigkeit.
2. Stellen Sie sicher, dass das erforderliche Objektiv (20x oder 25x Wasserimmersionsobjektiv wird empfohlen) installiert wurde.
3. Tragen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf die Unterseite des Deckels der Bildkammer auf, um eine sichere Abdichtung mit dem Deckdeckel zu schaffen.
4. Positionieren Sie vorsichtig einen Deckdeckel in den Deckel und wischen Sie überschüssiges Vakuumfett ab.
5. Nehmen Sie den mit dem Lektin injizierten Embryo aus dem Inkubator und schneiden Sie bei Bedarf die Ränder der Wiegeschale ab.
6. Positionieren Sie den Embryo in der Bildgebungskammer, wobei der Abdeckr direkt auf den Bereich des CAM abgesenkt wird, in dem sich die metastasierten Kolonien von Interesse befinden. Senken Sie langsam den Deckel auf den Embryo, bis der Deckdeckel nur noch die CAM kontaktiert. Ziehen Sie die Schrauben fest, um den Deckel an Ort und Stelle zu befestigen, stellen Sie sicher, dass der Deckel nivelliert ist und dass der Deckdeckel keinen Abwärtsdruck auf das CAM ausübt.
7. Erfassen Sie Bilder von mehreren, zufälligen Kolonien aus Kontroll- und Experimentalgruppen (10-20) von mehreren (5-10) Embryonen.
   ANMERKUNG. Es wird empfohlen, zufällige 3D-Stacks (1-5um Z-Schritte; 50-100um Bereich; 25x) aus jedem Feld zu erwerben.
8. Verwenden Sie die Feldstichoption in der Mikroskoperfassungssoftware, falls verfügbar. Da Bilder, die für die Quantifizierung verwendet werden, keine Publikationsqualität haben, verwenden Sie schnelle Aufnahmemodi wie resonantes Scannen, falls verfügbar. Verwenden Sie 25x Objektiv und 3 x 3 Nähte mit 5-10 μm Z-Schritt, 100 μm Gesamtbereich. Stellen Sie sich mindestens 100 Zellen (~ 20 Kolonien) pro Bedingung vor.

8. Quantifizierung von Blutgefäßkontakten von Krebszellen

1. Öffnen Sie die 3D-Datei als Z-Stack mit der erforderlichen Software.
   ANMERKUNG. Spezielle Software muss verwendet werden, um hochauflösende Bilder zu erfassen und zu analysieren, um den Kontakt zwischen Krebszelle und Blutgefäßen zu quantifizieren. Es stehen mehrere Softwarepakete zur Verfügung, die in der Lage sind, 3D-Bildanalysen durchzuführen. Weitere Informationen finden Sie in der Materialtabelle.
2. Wenn während der Bildaufnahme eine signifikante XY-Bewegung aufgetreten ist, richten Sie den Z-Stack mit dem ImageJ StackReg-Plugin aus (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
3. Suchen Sie die Zelle(n) von Interesse.
4. Scrollen Sie durch das XYZ-Bild in Z-Richtung und identifizieren Sie den optischen Abschnitt, der die maximale Länge des Blutgefäßkontakts der Krebszelle für die interessierende Zelle enthält (Abbildung 2E).
5. Messen Sie den Kontakt zwischen Krebszelle und Blutgefäßen mit der "manuellen Längenmessfunktion".
6. Geben Sie die Messungen in das Datensoftwarepaket ein, das für die statistische Analyse verwendet wird.
   HINWEIS: Die Fähigkeit von Krebszellen, sich an die Blutgefäße zu binden, kann entweder als Länge der Kontakt zwischen Krebszelle und Blutgefäßen oder als Prozentsatz der Zelle, die mit dem Gefäßkontakt für einen bestimmten Krebszellklon (oder beides) in Kontakt steht, gemessen werden.
7. Fahren Sie mit der nächsten Zelle von Interesse fort.
8. Analysieren Sie die Daten auf statistische Signifikanz, indem Sie mutierte Klone und Kontrolldatensätze vergleichen.

9. Quantifizierung der Koloniekompaktheit

1. Die Zellen aus dem erweiterten Klon mit der gleichen Technik wie in Schritt 2 erneut auswerfen.
2. Fünf Tage nach der Injektion erfassen Sie Bilder von 10-50 zufälligen metastasierten Kolonien für jeden Klon.
   HINWEIS: Für die Quantifizierung der Metastasierung der Koloniekompaktheit sind keine qualitativ hochwertigen Bilder erforderlich. Monochromatische, stereomikroskopische (10-fache Vergrößerung) Bilder sind ausreichend. Es sollte auf die Helligkeit des Bildes (die meisten Zellen innerhalb der Kolonie sollten gesehen werden) und den Kontrast (Unterschied zwischen einer oder zwei Zellen) geachtet werden.
3. Isolieren Sie das Koloniebild digital (siehe Abbildung 2C,D) und fahren Sie mit der Quantifizierung der Koloniekompaktheit mit dem eigenständigen Quantifizierungsmodul für die Koloniekompaktheit oder der Blindbewertung¹³fort.
4. Fahren Sie mit der nächsten Kolonie von Interesse fort.
5. Analysieren Sie die Daten auf statistische Signifikanz, indem Sie mutierte Klone vergleichen und Datensätze kontrollieren (d. H. Scramble shRNA).

Die Injektion von Krebszellen gilt als erfolgreich, wenn die Mehrheit der Zellen, die sich in den Kapillaren befinden, einzeln sind und sich in einem signifikanten Unterschied zueinander (~ 0,05-0,1 cm) befinden, so dass sich die Kolonien nach 5-6 Tagen Inkubationszeit nicht überlappen (Abbildung 3A). Die Injektion war nicht erfolgreich, wenn in den meisten Kapillaren eine Ansammlung von Krebszellen zu sehen ist, Embryonen, die dies zeigen, sollten verworfen werden (Abbildung 2E). Eine signifikante Anzahl von injizierten Krebszellen verendet innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion, so dass einige Embryonen alle Krebszellen abzustoßen scheinen. Das Überleben von Krebszellen variiert je nach lokalem Eizelllieferanten (d. H. Die Menge der zu injizierenden Zellen kann variieren) und wir empfehlen dringend, dass optimale Injektionsbedingungen (Krebszellkonzentration versus Injektionsdauer) bestimmt werden, bevor mit dem Experiment fortgefahren wird. Wir empfehlen eine Zellkonzentration im Bereich zwischen 0,5 x 10⁶ bis 1,0 x 10⁶ Zellen/m. Wenn die optimale Zellkonzentration und -dauer erreicht ist, sollten die transduzierten Zellen am Tag 5 nach der Injektion eine Vielzahl von Koloniephänotypen produzieren, wobei die Mehrheit der Kolonien invasiv erscheint, wie durch die im CAM-Gewebe verstreuten Krebszellen bestimmt wird (Abbildung 3A). Es sollte auf die metastasierten Kolonien geachtet werden, die "kompakt" erscheinen und weit genug von benachbarten Kolonien entfernt sind, dass sie mit Einerzette und Schere in einem Stück CAM-Gewebe herausgeschnitten werden können (Abbildung 3C). Ein isolierter positiver Bildschirmtreffer (d. h. eine kompakte Kolonie) sollte den kompakten Koloniephänotyp bei der Erneuteinlösung anzeigen (Abbildung 3B). Eine Abnahme des Zellüberlebens (oder der Zellproliferationsrate innerhalb der Kolonie) kann ebenso beobachtet werden. Daher ist es möglich, dass für einige der positiven Bildschirmtreffer höhere Zellzahlen injiziert werden müssen, um genügend Koloniezahlen zu erhalten. Bei der Messung der Kontakte zwischen Krebszelle und Blutgefäßen sollte auf die Helligkeit der Gefäßwandflecken (fluoreszierendes Lektin; Abbildung 3D,E) und die entsprechende Menge an Lektin sollte für das helle/kontrastreiche Gefäßwandsignal injiziert werden. Jede verfügbare Bildanalysesoftware kann während der Quantifizierungsschritte nach Durchführung der Mikroskop-Software-Kalibrierung verwendet werden.

Abbildung 1: Übersicht über die schalenlose Kultur des Hühnerembryons. (A) Eine Wiegeschale mit Deckel, die für die schalenlose Kultur vorbereitet ist. Der Pfeil zeigt auf die Schnittecke. (B) Wägeschalen in Reihen in der Durchflusshaube angeordnet. (C) Schneiden einer Eierschale mit einem elektrischen Rotationswerkzeug. (D) Ein Ei in eine Wiegeschale knacken. (E) Embryonen, die im befeuchteten Inkubator kultiviert werden. Maßstabsleisten =1 cm (A-D) oder 5 cm (E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Überblick über die Injektion von Krebszellen und die Isolierung metastasierender Kolonien. (A) Flussdiagramm, das die Schritte der Screening-Plattform für Hühnerembryonen umreißt. (B) Krebszelleninjektion auf der Stereo-Fluoreszenzmikroskop-Stufe. (C) Injektion der Krebszellen in das CAM-Gefäßsystem. (D) Bild mit erfolgreicher Injektion von Krebszellen (akzeptable Krebszelldichte), unmittelbar nach der Injektion aufgenommen. (E) Bild mit schlechter Injektion von Krebszellen, die als überinjizierter Embryo angesehen wird. Beachten Sie, dass sich Krebszellen in den Blutkapillaren ansammeln (weiße Pfeile). Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für verschiedene Schritte des Screening-Protokolls. (A) Metastatische Kolonien, die von heterogenen (bibliothekstransduzierten HEp3-Zellen) gebildet werden, 5 Tage nach der Injektion. Der rote Pfeil zeigt eine kompakte Kolonie (potenzieller positiver Treffer), die herausgeschnitten werden sollte. (B) Metastatische Kolonien, die durch einen der isolierten Siebtreffer (KIF3B) nach der Wiedereinjektion, 5 Tage nach der Injektion, gebildet werden. Insets zeigen digital ausgeschnittene metastatische Koloniebilder aus den gestrichelten Quadraten. Dies ist eine akzeptable Bildqualität für die C.I-Quantifizierung. Der durchschnittliche C.I.-Wert für die Treffer-Reinjektion (KIF3B) wird angezeigt. (C) Isolierung der metastasierten Kolonie von Interesse aus dem CAM-Gewebe. Repräsentative optische Abschnitte von (D) einer Kontrollkolonie und (E) einer KIF3B shRNA-überexprimierenden Kolonie, die beide Krebszell-Blutgefäß-Kontaktmessungen zeigen. CAM-Vaskulatur ist mit fluoreszierendem Lektin-649 markiert. Maßstabsstäbe =1 cm (A-C) oder 50 μm (D, E). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hier beschreiben wir ein auf schneller Fluoreszenzmikroskopie basierendes intravitales Screening-Protokoll, das für wichtige Anwendungen wie genetische oder Arzneimittelkandidaten-Screens verwendet werden kann. Krebszellen, die mit einer genetischen Bibliothek von Interesse transduziert oder mit einzelnen Expressionskonstrukten transfiziert wurden, können mit diesem Chick CAM-Modell schnell gescreent und auf den interessierenden Phänotyp quantifiziert werden. Da Transduktions- oder Transfektionsprotokolle je nach Bibliothekstyp erheblich variieren, sind sie in diesem Verfahren nicht enthalten. Phänotypisch relevante metastatische Kolonien werden aus dem CAM herausgeschnitten, expandiert und DNA für die Hochdurchsatzsequenzierung isoliert, um das expressionskonstrukt von Interesse zu identifizieren. Im Allgemeinen ist jede genetische Bibliothek mit Primersequenzen und empfohlenen Methoden der genomischen DNA-Aufreinigung ausgestattet. Wir empfehlen, lokale Anlagenrichtlinien für die besten Sequenzierungsergebnisse mit hohem Durchsatz zu verwenden.

Es wird empfohlen, die optimale Multiplizität der Infektion (M.O.I.) für eine Bibliothek und Zelllinie vor dem Screening zu bestimmen. Idealerweise sollte jede Zelle (und damit zukünftige metastatische Kolonie) nur ein Genexpressionskonstrukt enthalten, was jedoch nach unserer Erfahrung nicht immer erreichbar ist. Wir empfehlen, das Protokoll des Bibliotheksherstellers zu befolgen und eine breite Palette von M.O.I. (0.01-5) zu testen, um so nahe wie möglich an 1 zu kommen. Das Vorhandensein mehrerer Bibliotheksexpressionskonstrukte innerhalb jeder metastasierten Kolonie kann die Koloniephänotypanalyse erheblich erschweren. Wir empfehlen auch, in Ihren Experimenten die vom Bibliothekshersteller bereitgestellte Negativkontrolle zu verwenden (d. H. Scramble shRNA-exprimierender Vektor, der fluoreszierend markiert ist).

Unser Screening-Protokoll basiert auf der Auswahl nicht-invasiver fluoreszierender Kolonien; Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle in den Experimenten verwendeten Zelllinien eine ähnliche Fluoreszenzintensität aufweisen. Eine ungleichmäßige Fluoreszenzintensität zwischen den Zellen (und metastasierten Kolonien) kann zu einer verzerrten Kolonieauswahl aufgrund der Zell- oder Koloniehelligkeit anstelle der Invasivität führen.

Im Vergleich zu bestehenden Methoden bietet unser Protokoll mehrere einzigartige Vorteile wie Geschwindigkeit, niedrige Kosten und die Fähigkeit, den intravitalen Bildschirmzyklus ohne Notwendigkeit für anspruchsvolle Bildgebungsgeräte^{abzuschließen 12,13,14}. Darüber hinaus kann der gesamte Screening-Zyklus mit 3 bis 6 Wochen von der Zellinjektion bis zur Sequenzierungsphase abgeschlossen werden. Für die Injektion von Krebszellen oder die Isolierung metastasierender Kolonien ist kein hochauflösendes Mikroskop erforderlich, da diese Schritte mit einem einfachen fluoreszierenden Stereomikroskop durchgeführt werden können, das den meisten Forschern zur Verfügung steht. Da die schalenlose Embryonenzucht vollständig selbsttragend ist, sind keine komplizierten Haltungs- oder Fütterungspläne für Forschungstiere erforderlich. Die meisten Forschungseinrichtungen betrachten Hühnerembryonen nicht als lebende Tiere, was die mit diesem Modell verbundenen Kosten und Dokumentationslasten erheblich verringert.

Es gibt jedoch einige Einschränkungen, die mit dem schalenlosen Embryomodell verbunden sind. Erstens arbeiten nicht alle Krebszelllinien in diesem Modell effizient. In unserem Labor verwenden wir routinemäßig mehrere Krebszelllinien wie HT1080 (humanes Fibrosarkom), HEp3 (Kopf & Hals) und Maus b16 Melanom und 4T1 Brustkrebszelllinien, die robust metastatische Kolonien bilden, wenn sie in das Hühner-CAM-Gefäßsystem injiziert werden. Andere Zelllinien mit verschiedenen Krebsarten wie Brust (MDA468), Gehirn (U87 und U118) oder Eierstöcke (A2780s) bilden bei der Injektion in die CAM leicht metastatische Kolonien und können daher in diesem Screening-Protokoll auch verwendet werden^12,14,15. Unserer Erfahrung nach schneiden häufig verwendete Krebszelllinien wie LnCaP und PC3 in diesem Modell jedoch nicht gut ab (unveröffentlichte Beobachtungen). Eine weitere Einschränkung ist, dass ein konfokales Mikroskop mit einem Bildgebungsbereich von 100 bis 200 μm für hochauflösende Bildgebung, wie z.B. die Visualisierung von Blutgefäßkontakten von Krebszellen, erforderlich ist, dieses Gerät ist für viele Forscher möglicherweise nicht verfügbar.

Insgesamt beschreibt dieses Protokoll eine schnelle intravitales Screening-Plattform, die zur Entdeckung von Krebsmetastasensuppressoren und -treibern verwendet werden kann. Wir sind fest davon überzeugt, dass die Robustheit und Benutzerfreundlichkeit dieses Modells es zu einem wesentlichen Screening-Modell für viele Forscher machen wird.

Nichts zu verraten.

Diese Arbeit wurde durch den Canadian Cancer Society Research Institute Grant #702849 an JDL und KS unterstützt. Dr. Lewis ist Inhaber des Frank und Carla Sojonky Lehrstuhls für Prostatakrebsforschung, der von der Alberta Cancer Foundation unterstützt wird.