Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Der Beitrag der Mitochondrien zur onkogenen Transformation ist ein Thema von großem Interesse und aktiver Studie. Da das Feld des Krebsstoffwechsels komplexer wird, wird das Ziel, Mitochondrien mit verschiedenen Verbindungen anzugreifen, die mitochondriale Schäden verursachen (sogenannte Mitocans), immer beliebter. Leider benötigen viele bestehende Zytotoxizitätstests, wie z. B. solche, die auf Tetrazoliumsalzen oder Resazurin basieren, funktionelle mitochondriale Enzyme für ihre Leistung. Der Schaden, der durch Verbindungen verursacht wird, die auf Mitochondrien abzielen, beeinträchtigt oft die Genauigkeit dieser Assays. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das auf Differentialfärbung mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen basiert, von denen einer zellpermeant (Hoechst 33342) und der andere nicht (Propidiumiodid) ist. Der Unterschied in der Färbung ermöglicht es, lebende und abgestorbene Zellen zu diskriminieren. Der Assay ist für die automatisierte Mikroskopie und Bildanalyse zugänglich, was den Durchsatz erhöht und Verzerrungen reduziert. Dies ermöglicht auch die Verwendung des Assays in High-Throughput-Manier mit 96-Well-Platten, so dass es eine praktikable Option für Drogenentdeckungbemühungen, vor allem, wenn die betreffenden Medikamente haben ein gewisses Maß an Mitotoxizität. Wichtig ist, dass die Ergebnisse des Hoechst/PI-Färbetestes eine erhöhte Konsistenz aufweisen, sowohl mit Trypan-Blau-Ausschlussergebnissen als auch zwischen biologischen Replikationen, wenn der Test mit anderen Methoden verglichen wird.

Der erste Schritt zur Identifizierung wirksamer Krebsbehandlungen ist die Auswahl eines robusten, unvoreingenommenen Zytotoxizitäts-Assays, der verwendet werden kann, um die Wirkung der Behandlung zu untersuchen. Eine häufige Wahl für Versuche mit niedrigem Durchsatz ist der Ausschluss von Trypan-Blaufarbstoff enthäupfen zellendes. Diese Methode wird bevorzugt, weil sie eine relativ unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung des Zellüberlebens ermöglicht. Trypan blau diffundiert passiv in Zellen, deren Membranen kompromittiert sind, aber es wird effektiv daran gehindert, in gesunde Zellen einzudringen¹. Der Quotient der lebenden Zellen und der Gesamtzellen stellt die prozentuale Lebensfähigkeit dar, was auf die Wirksamkeit der Behandlung hinweist. Der größte Nachteil des Trypan-Blau-Assays ist, dass er für Methoden mit hohem Durchsatz schlecht geeignet ist. Es hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und längere Färbung kann zu Artefakten aufgrund der Färbung lebensfähiger Zellen führen. Folglich wird Trypan-Blau-Ausschluss in der Regel, aber nicht immer², auf manuelle Zählung reduziert. Dies macht es zu langsam und führt die starke Möglichkeit der Voreingenommenheit aufgrund der subjektiven Beurteilung des Forschers (es sei denn, blendende oder unabhängige Zählungen verwendet werden, die den Labordurchsatz weiter reduzieren). Im Allgemeinen ist der Durchsatz dieses Assays nicht ausreichend für die moderne Entdeckung von Medikamenten.

Viability Assays, die im Allgemeinen einen viel höheren Durchsatz haben, ermöglichen es forschern, diese Einschränkung zu umgehen, haben aber erhebliche Vorbehalte (siehe Tabelle 1). Diese Methoden lassen sich in der Regel in zwei Gruppen unterteilen. Eine Gruppe besteht aus kolorimetrischen Assays, die auf der Funktion zellulärer Redoxenzyme basieren. Farblose oder nicht fluoreszierende Substrate werden in lebendige Produkte umgewandelt, die mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden können. Klassische Beispiele sind Tetrazoliumsalze (MTT, WST-1, XTT, etc.) und Resazurin. Diese Kategorie umfasst auch lumineszierende Assays, die Luziferin verwenden, um ATP-Niveau zu bewerten. Assays dieser Art haben die zugrunde liegende Einschränkung, dass sie den Zellstoffwechsel messen, was nicht die zelluläre Lebensfähigkeit per se ist. Es ist durchaus üblich, dass Zellen unter widrigen Bedingungen still werden, aber immer noch die Fähigkeit behalten,^3,4,5zu teilen. Zum Beispiel, Krebsstammzellen sind oft relativ metabolisch^{ruhend 6,7,8,9}, und sind wahrscheinlich schwierig, mit diesen Techniken zu assay. Die Wirksamkeit von Behandlungen, die die mitochondriale Funktion schädigen, wie die meisten Mitocans, wird wahrscheinlich ebenfalls deutlich überschätzt.

Eine alternative Methode nutzt die chemischen Eigenschaften verschiedener Substanzen, die es ihnen ermöglichen, biologische Membranen entweder zu kreuzen oder nicht. Ein Beispiel sind nukleare Flecken wie SYTOX oder Propidiumiodid (PI). Diese Kategorie umfasst auch Assays, die im Konzept ähnlich sind, aber in ihrer Funktion unterschiedlich sind, wie z. B. der Lactatdehydrogenase (LDH)-Assay, der die Freisetzung von LDH in das extrazelluläre Milieu als Indikator für zelluläre Nekrose misst (Abbildung 1,Tabelle 1). Diese Assays sind eher in der Lage, zwischen metabolisch inaktiven und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden.

Tabelle 1. Liste der Zytotoxizitäts-Assays. Cytotoxizität-Assays, von denen einige in dieser Studie verwendet wurden, wurden zusammen mit der kurzen Beschreibung ihrer wichtigsten Merkmale aufgeführt.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass der mitochondriale Stoffwechsel bei einigen Krebsarten verändert wird^{19,20,21,22,23,24,25}. Zum Beispiel, akute myeloische Leukämien (AML) haben gezeigt, dass ihre mitochondriale Masse, mtDNA-Gehalt und mitochondriale Atmung zu upregulieren, um ihre Energieanforderungen zu erfüllen^19,26,27. Auf der anderen Seite sind einige solide Tumoren durch mitochondriale Dysfunktion, oder besser gesagt "metabolische Reprogrammierung", wie Downregulation von mitochondrialen Proteinen in OXPHOS beteiligt oder verminderte mtDNA-Gehalt, die mit Tumor-Invasivität, metastasierendem Potenzial und Resistenz gegen Apoptose-induzierende Medikamente verbunden ist^28,29. Darüber hinaus hat in letzter Zeit ein erhöhtes Interesse an der Verwendung mechanistisch vielfältiger Verbindungen, die mitochondriale Funktion beeinflussen (im Allgemeinen mitocans³⁰genannt), als mögliche Therapien für bestimmte Krebsarten. Diese Medikamente zielen auf ATP-Synthese, mitochondriale DNA, OXPHOS, und ROS-Produktion, sowie pro-apoptotische und anti-apoptotische Proteine im Zusammenhang mit Mitochondrien^30,31. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieser Ansatz hat erhebliche Versprechen^19,32,33,34. Diese metabolischen Abweichungen in der Krebszellbiologie oder mitochondrien-targeting-Behandlungen können jedoch die konventionellen Lebensfähigkeitstests, die auf mitochondrialer Funktionalität basieren, signifikant beeinflussen.

Hier wird ein optimiertes Protokoll für einen differenziellen kerniellen Färbetest beschrieben. Das Protokoll ermöglicht eine schnelle und genaue Bestimmung der Zytotoxizität von Mitocanen oder deren Kombinationen mit anderen Verbindungen. Hoechst 33342 ist ein zellpermeant Kernfarbstoff, der Zellmembranen leicht kreuzt, um DNA zu färben, so dass die Gesamtzellzahl ermittelt werden kann. Durch die Co-Färbung mit PI, die nur in die Kerne abgestorbener Zellen eindringt, kann der Anteil der lebenden (nur Hoechst) und toten (mit beiden) Zellen genau bestimmt werden. Dieses Protokoll verfeinert den veröffentlichten Assay³⁵ durch Hinzufügen eines Schritts zur Optimierung der Farbstoffkonzentration (durch Querverweise mit orthogonalen Trypan-Blau-Verfahrens) und Zentrifugieren der Platte vor der Bildgebung. Da viele Zelllinien halbhaft oder suspendiert sind, erhöht die Zentrifugation den Anteil der abgebildeten Zellen und verbessert die Genauigkeit erheblich. Der Test hat mehrere Vorteile, einschließlich, dass Färbung nicht die Entfernung von Medien oder Waschen erfordert. Die Farbstoffmischung ist auch kostengünstig, einfach zu zubereiten und kompatibel mit Mehrkanal-/Roboter-Pipettiersystemen.

Nachdem Zellen gefärbt wurden, werden sie mit einem automatisierten Mikroskop abgebildet. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, eine permanente Aufzeichnung der Bilder zu erstellen, die später neu analysiert werden kann und die Auswirkungen bestimmter Verbindungen können durch visuelle Inspektion von aufgenommenen Bildern neu bewertet werden. Sobald Bilder erhalten wurden, können Zellen entweder manuell oder mithilfe eines von mehreren Softwarepaketen gezählt werden, einschließlich freier (z. B. ImageJ, CellProfiler, etc.) und kommerzieller Software (z. B. Metamorph, Gen5 usw.). Automatisierte Zellzählung ist im Allgemeinen vorzuziehen, da ordnungsgemäß entwickelte automatisierte Zellzählpipelines genauer und weniger verzerrt sind als manuelle Zählungen. Sie ignorieren auch leichter Zellablagerungen oder unlösliche Komplexe. Die Entwicklung dieser Rohrleitungen ist im Allgemeinen einfach und wird durch die Effizienz der verwendeten Flecken vereinfacht. Die Ausgabe ist quantitativ, da die tatsächliche Anzahl der abgestorbenen Zellen automatisch in Bezug auf die Gesamtzahl der Zellen berechnet wird und verschiedene Schwellenwerte angewendet werden können, um die Stringenz der Erkennung zu erhöhen oder zu verringern³⁵. Für den Komfort sind optimierte Parameter für das Zählen von Zellen mit Gen5 v. 3.00 softwarekompatiblem Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader enthalten.

1. Zytotoxizitätstest: Setup

1. Herstellung von Lösungen von Verbindungen von Interesse bei gewünschten Konzentrationen in den entsprechenden Medien (serumfrei oder 1, 2,5 oder 5% FBS RPMI-1640).
   1. Zur Messung der Zytotoxizität einer einzelnen Verbindung (z. B. zur Bestimmung der effektiven Dosen) bereiten Sie Verbindungen in 2x Endkonzentration vor.
   2. Zur Messung der Zytotoxizität von zusammengesetzten Kombinationen, bereiten Sie Verbindungen in 4x Endkonzentration vor.
   3. Bereiten Sie nur Lösungsmittelsteuerungen vor, indem Sie die gleiche Menge Lösungsmittel mit dem entsprechenden Medium mischen. Wenn z. B. in DMSO und Methanol gelöste Prüfstoffe hergestellt werden, können Sie für jedes Lösungsmittel nur lösungsmittelhaft steuern.
2. Sammeln Sie Zellen aus Kulturschale oder Kolben in einem 15 ml konischen Rohr.
3. Übertragen Sie 10 l Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenrohr und färben Sie mit 10 l 0,4% Trypanblau. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um lebensfähige und nicht lebensfähige Zellen für jede Zellquelle zu zählen.
4. Pelletzellen bei 200 g für 5 min. Aspirat oder Dekanat überstand.
5. Zellpellet in assay-geeigneten Medien (serumfrei oder 1, 2,5, 5% FBS RPMI-1640) bei einer Zelldichte von 3*10⁵ Zellen/ml wieder aufsetzen.
   ANMERKUNG 1: Die Zelldichte von 3*10⁵ Zellen/ml bietet eine Sädichte von 15.000 Zellen/Well. Die Saatdichte ist ein wichtiger Parameter und sollte idealerweise vor dem Experiment vordefiniert werden. Die Saatdichte sollte 1) die Zellgröße berücksichtigen – in der Regel werden größere Zellen mit einer niedrigeren Dichte gesät; 2) Behandlungsdauer – Zellen werden in der Regel mit einer niedrigeren Dichte für Experimente gesät, die länger dauern; und 3) Zellteilungsrate – Zellen mit einer höheren Teilungsrate werden mit einer niedrigeren Dichte gesät. Spezifische Beispiele für optimierte Sädichten: K562-Zellen, größer, 24 h Dauer – 10.000 Zellen/Well; MOLM-13-Zellen, moderate Größe, 24 h Behandlung – 15.000/well; MOLM-13-Zellen, 48 h Behandlung – 8.000/well; kleine gesunde periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs), 24 h Behandlung – 50.000/gut; primäre AML-Zellen, 24-h-Behandlung – 15.000-20.000/well.
   ANMERKUNG 2: Das Vorhandensein von FBS in Medien kann die Aktivität der Verbindungen beeinflussen. Die Verringerung der FBS-Konzentration kann die Interpretation der Assay-Ergebnisse vereinfachen, aber auch die physiologische Genauigkeit verringern.
6. Samen 50 l Zellsuspension von Schritt 1,5 in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
7. Fügen Sie Verbindungen wie folgt hinzu:
   1. Für einzelne zusammengesetzte Assays fügen Sie jedem Bohrgut 50 l 2x Compoundlösung hinzu. Für Lösemittel-Kontrollbrunnen 50 l Testmedien hinzufügen, die das Lösungsmittel in der 2x-Konzentration enthalten.
   2. Für Kombinationstests fügen Sie jeweils 25 L der Verbindung (4x Lösungen) in jeden Brunnen ein. Für einzelne Compound-Kontroll-Bohrungen, fügen Sie 25 l 4x Compound-Lösung und 25 l Testmedium. Für Lösemittel-Kontrollbrunnen 50 l Prüfmedium oder Prüfmedium hinzufügen, das das Lösungsmittel enthält.
      ANMERKUNG 1: Die endgültige Konzentration von DMSO sollte 0,5 % nicht überschreiten.
      ANMERKUNG 2: Es wird empfohlen, die Medien, die die Verbindungen enthalten, mit der Pipette hinzuzufügen, die die Wand jedes Brunnens aufgrund des geringen Volumens berührt.
8. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um das Mischen des Inhalts der Brunnen zu gewährleisten.
9. Inkubieren Sie Platten bei 37 °C in einer befeuchteten 5%_{CO2-Atmosphäre} für eine angemessene Zeit, z.B. 24 h.

2. Cytotoxizität Assay: Färbung mit Hoechst 33342 und Propidium Iodid

1. Bereiten Sie 10x Färbelösung vor. Diese Lösung muss vor jedem Experiment neu vorbereitet werden, sie kann nicht gespeichert werden. Die endgültigen Farbstoffkonzentrationen sollten vor dem Experiment bestimmt werden.
   1. Bei Leukämie-Zelllinien und primären Leukämiezellen enthält 1 ml 10x Färbepuffer 10 l von 20 mM Hoechst 33342 und 50 l von 1 mg/ml Propidiumjodid in sterilem PBS (Endkonzentrationen: Hoechst 33342 20 'M, PI 5 g/ml).
   2. Für gesunde PBMCs enthält 1 ml 10x Färbepuffer 10 l mit 20 mM Hoechst 33342 und 10 l mit 1 mg/ml Propidiumjodid in sterilem PBS (Endkonzentrationen: Hoechst 33342 20 mM, PI 1 g/ml).
      HINWEIS: Die endgültige Konzentration von Propidiumjodid muss vor den Experimenten bestimmt werden. Die Zellen sollten mit einer Reihe von PI-Konzentrationen (1, 2,5, 5 g/ml) getestet werden, und dann sollte die von Hoechst/PI berechnete Lebensfähigkeit mit der Lebensfähigkeit verglichen werden, die über Trypanblau gemessen wird. Die oben aufgeführten PI-Konzentrationen wurden auf der Grundlage der Lebensfähigkeit der Zielzellen in Medienkontrollbrunnen ausgewählt (über 90 % bei Leukämie-Zelllinien, über 70 % für gesunde PBMCs).
      VORSICHT: Hoechst 33342 und Propidiumiodid sind potenzielle Karzinogene. Tragen Sie beim Umgang mit ihnen geeignete persönliche Schutzausrüstungen.
2. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Mehrkanalpipette, um jedem Bohrwert 10 L mit 10x Färbepuffer hinzuzufügen.
   HINWEIS: Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen das Medium nicht berühren.
3. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um Blasen zu mischen und zu löschen. Bei 37 °C für 15 min.
4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 4 min, um alle Zellen an den Boden der Platte zu bringen. Wischen Sie den Boden der Platte vorsichtig mit einem feuchten Kimwipe ab, um Fasern und/oder Schmutz zu entfernen, die die Bildgebung stören.
   ANMERKUNG 1: Die Zentrifugierung der Platte stellt die höchsten Chancen sicher, dass alle Zellen im Bild erfasst werden. Oft lösen sich abgestorbene Zellen und schweben, was irreführende Werte der Zytotoxizität liefert. Zentrifugation mildert diesen Effekt.
   ANMERKUNG 2: Die Platte sollte so schnell wie möglich nach der Zentrifugation abgebildet werden, idealerweise innerhalb von 15 min. Zentrifugation kann die Selektivität der PI-Färbung reduzieren und es den Zellen ermöglichen, langsam Propidiumjodid anzusammeln. Die Verbesserung der Genauigkeit, die durch die Visualisierung der abgestorbenen Zellen gewonnen wird, überwiegt den leichten Anstieg der PI-Färbung. Es wird empfohlen, die Bildgebung innerhalb von 1 h zentrifugierend abzuschließen.

3. Cytotoxizität Assay: Datenerfassung

1. Stellen Sie die Software für den automatisierten Mikroskop-/Plattenbildner ein, um Diefluoreszenz sowohl für Hoechst 33342 (Anregungsmaximum 350 nm, Emissionsmaximum 461 nm) als auch für PI (Anregungsmaximum 493 nm, Emissionsmaximum 636 nm) zu erkennen. Erfassen Sie Bilder für jeden Brunnen in beiden Kanälen.
2. Mit der Software (wie CellProfiler, einem kostenlosen Bildanalysestudio basierend auf MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ oder proprietärer Software wie Gen5) zählen die Zellen in jedem Brunnen in jedem Kanal.
   HINWEIS: Da jede Zelle mit Hoechst 33342 gefärbt werden sollte und abgestorbene Zellen mit PI befleckt werden sollten, stellt das Verhältnis von Totzutot zu allen den Bruchteil der toten Zellen dar. Wenn beispielsweise die automatisierte Anzahl in unbehandelten Proben 467 Zellen zeigt, die mit PI (tote Zellen) und 2335 Zellen mit Hoechst 33342 (Gesamtzellen) befleckt sind, beträgt der tote Anteil 0,2 oder 20 %. Dieser Wert wird dann mit einer identisch behandelten Probe verglichen, in der die Behandlung verwendet wurde.
3. Detaillierte Beschreibung der Hoechst/PI Datenerfassung mit Cytation5 Cell Imaging Multi-Mode Reader und Gen5 v. 3.00 Software:
   1. Stellen Sie den Cytation5 Multimode-Plattenleser/-bildwands auf Bildzellen in flachen unteren, 96-well, generischen schwarzen Kunststoffplatten ein.
   2. Legen Sie ein Imaging-Protokoll fest, um die standardmäßigen Filtersätze DAPI und Texas Red zu verwenden. Nehmen Sie Bilder in der Brunnenmitte mit einem 4-fachen Vergrößerungsobjektiv auf. Verwenden Sie keinen Offset (X/Y oder Z). Verwenden Sie die folgenden Bildeinstellungen: DAPI – LED - 10, Integrationszeit - 99, Gain - 0; Texas Red – LED - 8, Integrationszeit - 950, Gewinn - 18. Automatische Stellik mit dem DAPI-Signal durchführen; es sollte keinen Versatz bei der Fokussierung zwischen den Kanälen geben.
   3. Bildanalyse mit Gen5-Software v 3.00 durchführen. Definieren Sie in den Softwareeinstellungen Zellen als Formen zwischen 5 und 25 m größe. Schließen Sie primäre Kantenobjekte aus und teilen Sie berührende Objekte, indem Sie die spezielle Option "Berührende Objekte teilen" aktivieren.  Als Nächstes verarbeiten Sie das Bild, um den Hintergrund zu entfernen (dunkle Hintergrundsubtraktion), wenden Sie eine Kernmaske (Schwellenwert DAPI >= 6000 AE) an und zählen Sie Objekte. Führen Sie eine Subpopulationsanalyse basierend auf PI-Färbung (Schwellenwert Texas Rot >= 5000 AE) durch, und zählen Sie Objekte. Die Zelllebensfähigkeit % ist definiert als (1 - .

Das oben genannte Protokoll wurde mit OCI-AML2-Zellen entwickelt, die als repräsentative akute myeloische Leukämie-Zelllinie genommen wurden. AML ist durch abnorme Proliferation undifferenzierter und nicht-funktioneller hämatopoetischer Zellen im Knochenmark^{gekennzeichnet 26}. Trotz der jüngsten Entwicklungen in der AML-gezielten Therapie, ist der Standard der Pflege seit mehreren Jahrzehnten unverändert geblieben, und besteht aus Induktionstherapie (in der Regel bestehend aus drei Tagen Anthracyclin, z. B. Daunorubicin, Idarubicin, oder Anthracenedione Mitoxanthrone), und 7 Tage Cytarabin) gefolgt von Konsolidierung (in der Regel bestehend aus Runden von Cytarabin Behandlung gefolgt von Perioden der Erholung)³⁶.

Nach dem in Abbildung 1Abeschriebenen Protokoll wurden OCI-AML2-Zellen in 96-Well-Platten ausgesät und mit dem mitochondrialen Unkoppler Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydraon (CCCP) oder dem Glykolytikum2-Inhibitor 2-Deoxy-D-Glucose (2-DG) in einer Reihe von Konzentrationen behandelt. Die Zellen wurden 24 h bei 37 °C in serumfreien RPMI-1640-Medien behandelt und die Lebensfähigkeit wurde dann mit Trypanblue (TB)-Ausschluss oder einem von vier Lebensfähigkeitstests (Hoechst/PI Differential-Kernfärbung, LDH-Freisetzungstest, MTT oder alamarBlue) bewertet. Repräsentative Bilder von Zellen, die mit Hoechst/PI gefärbt sind, sind in Abbildung 2Adargestellt. Mehrere wichtige Beobachtungen können sofort gemacht werden. Erstens ist die Gesamtzahl der Zellen (Hoechst-Färbung) relativ hoch und deutlich größer als die Anzahl der abgestorbenen Zellen (PI-Färbung). Dies deutet darauf hin, dass die Medienbedingungen keine hohen Raten des Zelltodes auslösen. Zweitens ist die Wahrscheinlichkeit, dass Trümmer gezählt werden, da nur Zellen, die sowohl mit Hoechst als auch mit PI beschriftet sind, als tot gezählt werden (lila Zellen im zusammengeführten Bild), und die Wahrscheinlichkeit, Trümmer zu zählen, ist sehr gering. Dieses Bild zeigt ein gutes Beispiel für richtig gefärbte Zellen.

Abbildung 1. Experimentelle Randzeit und Vergleich bestehender Zytotoxizitätstests. (A) Flussdiagramm, das den Zeitplan für das experimentelle Verfahren zusammenfasst, z. B. Hoechst/PI-Färbung. (B) Vergleich von Zytotoxizitäts-Assays, von denen einige in dieser Studie verwendet wurden. Dye-Ausschluss-Assays beinhalten ungeahnte Kernfarbstoffe, die abgestorbene Zellen mit kompromittierter Plasmamembran färben: TB – Trypan blue, PI – Propidiumiodid, EtBr – Ethidiumbromid und SYTOX. Die zweite Gruppe von Assays hängt vom Zellstoffwechsel ab, z. B. Tetrazoliumsalze MTT, XTT und CKK-8 (WST-8), Reazurin-basiertere Reagenz alamarBlue, etc. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Vergleich eines Panels von Zytotoxizitäts-Assays mit Trypan-Blau-Ausschluss. (A) Repräsentative Bilder von insgesamt (Hoechst 33342) und toten (Propidiumiodid, PI) OCI-AML2-Zellen über Hoechst/PI-Färbung. (B) Beurteilung der Lebensfähigkeit von OCI-AML2-Zellen mit unterschiedlichen Methoden nach der Behandlung mit einem Gradienten von CCCP -oben) oder 2-DG (unten) Konzentrationen. OCI-AML2 wurden mit CCCP oder 2-DG in serumfreiem RPMI-1640 für 24 h behandelt, bevor die Zelllebensfähigkeit bestimmt wurde. Gezeigt ist mittelwert, Fehlerbalken stellen SEM dar. C. Unterschied in der Zelllebensfähigkeit zwischen Zytotoxizitäts-Assays in (B) vs. Trypan-Blaufärbung (siehe Ergänzungstabellen S1-2 für die genauen Zahlen und medianen Unterschied). Sterne weisen auf signifikante Unterschiede gegenüber. Trypan blau Färbung. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – nicht signifikant. Der Gruppenvergleich erfolgte über t-test mit Korrektur für Mehrfachhypothesentests. Es wurden drei unabhängige biologische Repliken durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wie wir vor kurzem berichtet¹⁹, Leukämien sind sehr empfindlich auf mitoxtoxische Behandlungen, was darauf hindeutet, dass die Zellen bereits zugrunde liegenden mitochondrialen Schäden haben. Auf dieser Grundlage sagten wir voraus, dass die MTT- und alamarBlue-Assays, die auf der mitochondrialen Enzymaktivität basieren, die zelluläre Lebensfähigkeit ungenau messen würden. Wie erwartet zeigten diese Assays (insbesondere alamarBlue) eine deutlich geringere Lebensfähigkeit im Vergleich zum Trypan-Blauausschluss(siehe Abbildung 2B,C, Ergänzende Tabellen S1-S2). Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass Dosen dieser Verbindungen erforderlich, um Apoptose oder Nekrose zu induzieren sind höher als diejenigen, die benötigt werden, um mitochondriale Funktion zu kompromittieren.

Unter den getesteten Assays hatte die Doppelfärbung mit Hoechst 33342 und PI die beste Kombination aus Robustheit, Empfindlichkeit und Konsistenz mit TB-Färbung, mit der kleinsten medianen Abweichung von der TB-Ausschlussmethode nach DER CCCP- oder 2-DG-Behandlung (Zusatztabellen S1-2). Interessanterweise wurde bei höheren Dosen von CCCP (50 und 100 m) die mit Hoechst/PI oder TB geschätzte Lebensfähigkeit im Vergleich zu niedrigeren Dosen erhöht(Abbildung 2B, oben). Dies ist wahrscheinlich auf die Ausfällung von CCCP in höheren Dosen aufgrund seiner Hydrophobie, Verringerung seiner effektiven Konzentration und Auswirkungen auf Zellen. Durch die Erhöhung der CCCP-Dosis verringerte sich die hoechst/PI-geschätzte mittlere Lebensfähigkeit von OCI-AML2-Zellen jedoch weiter: 74 % bei 150 M, 62 % bei 200 m, 6 % bei 300 M(Daten nicht dargestellt).

Der Hoechst/PI-Assay war auch wirksam bei der Bestimmung der zellulären Lebensfähigkeit nach der Behandlung mit anderen Mitochondrien-targeting-Molekülen. Dazu gehörten Roton, ein Gift, das den Komplex I der mitochondrialen Elektronentransportkette³⁷kompromittiert, und 3-Brompyruvat, ein glykolytischer Inhibitor und Alkylierungsmittel, das die mitochondriale Atmung und den mitochondrialen Stoffwechsel beeinträchtigt³⁸ (Abbildung 3A-D, Ergänzende Tabellen S3-4).

Abbildung 3. Validierung des Hoechst/PI-Zytotoxizitäts-Assays in Leukämiezellen. (A,B) OCI-AML2 (AML) Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Roton (A) oder 3-Bromopyruvat, 3-BP (B) in serumfreien RPMI-1640 Medien für 24 h behandelt, dann wurde die Lebensfähigkeit bestimmt. Gezeigt ist mittelwert mit SEM. (C,D) Vergleich der Lebensfähigkeitsdifferenz zwischen Hoechst/PI-Assay und Trypan-Blaufärbung (für die Zellen in A-Bsiehe Ergänzungstabellen S3-4 zur Quantifizierung). Sterne zeigen statistische Signifikanz im Vergleich zu Trypanblaufärbung. ** p < 0,01, *** p < 0,001, ns – nicht signifikant. Der Gruppenvergleich erfolgte über t-test mit Korrektur für Mehrfachhypothesentests. E. MOLM-13 (AML), primäre AML-Zellen, die von einem Patienten isoliert wurden, MOLT-4 (ALL) und K562 (CML) Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von Roton in serumfreien RPMI-1640-Medien für 24 h behandelt, bevor die Lebensfähigkeitsbestimmung mit Hoechst/PI-Färbung vorliegt. Gezeigt ist mittelwert mit SEM. Es wurden drei unabhängige biologische Repliken durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Hoechst/PI-Zytotoxizitätstest wurde weiter mit einem Panel von Leukämie-Zelllinien validiert, die mehrere Arten von Leukämie sowie Primärzellen darstellen. Dazu gehörten MOLM-13 (eine AML-Zelllinie), primäre AML-Zellen, die aus einer repräsentativen Patientenprobe gewonnen wurden, MOLT-4 (eine akute lymphoblastische Leukämie-Zelllinie, ALL) und K562 (eine chronische myelogene Leukämie-Zelllinie, CML) (Abbildung 3E, Ergänzende Abbildung S1). Die Ergebnisse des Hoechst/PI-Assays zeigten, dass diese Zellen tiefe Unterschiede in der Rotenon-Empfindlichkeit aufwiesen, die von sehr empfindlichen (MOLT-4) bis zu resistenten (K562) Zellen reichten.

Um die Robustheit des Assays zu demonstrieren, wurden OCI-AML2-Zellen mit einem Konzentrationsgradienten von 3-Bromopyruvat behandelt, wie im obigen Protokoll beschrieben. Die Zellzählungen wurden für 6 Brunnen bei jeder Konzentration erhoben und sind dargestellt (Abbildung 4A,B). Diese Zählungen wurden zur Berechnung der Lebensfähigkeit verwendet und zeigten, dass nur 4 Brunnen ausreichten, um das Assay-Ergebnis genau zu erfassen (Abbildung 4C). Die resultierende Dosis-Wirkungs-Kurve wird angezeigt (Abbildung 4D).

Abbildung 4. Reproduzierbarkeit von Hoechst/PI Färbung. Lebensfähigkeit von OCI-AML2-Zellen nach 24 h Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 3-Bromopyruvat (3-BP). (A) Gesamtzahl der Zellen, die über Hoechst 33342 Färbung gezählt werden, (B) Anzahl der toten Zellen, die über Propidiumjodidfärbung gezählt werden. (C) Lebensfähigkeit (%) berechnet mit (A-B). (D) Repräsentatives Dosis-Wirkungs-Diagramm. Gezeigt ist mittelwert mit SEM. Es wurden drei unabhängige biologische Repliken durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Obwohl der Test relativ robust ist, muss dennoch Vorsicht geboten sein. Unsachgemäße Leistung des Testes kann seine Genauigkeit beeinträchtigen. Zur Fehlerbehebung werden mehrere kompromittierte Ergebnisse angezeigt(Abbildung 5). Der erste Bildsatz zeigt die Folgen einer Überfärbung mit PI, die aus folgenden Quellen entstehen kann: Verwendung des Farbstoffs bei zu hoher Konzentration, zu lange Färbung oder zu hohe LED-Intensität/Integrationszeit im roten Kanal (Abbildung 5A). Diese Fehler erzeugen künstlich überhöhte Anzahl abgestorbener Zellen. Die zweite Frage ergibt sich aus der Vernachlässigung des Zentrifugationsschritts. Oft beginnen abgestorbene Zellen, ihre Befestigung von der Oberfläche der Schale zu verlieren. Folglich werden sie bei der Bildaufnahme, die in der Regel in der Nähe der Unterseite des Brunnens auftritt (Abbildung 5B). Schließlich erweitert die Überbelichtung im Hoechst-Kanal künstlich die Größe der Zellen, wodurch die Gesamtzahl pro Bohrkörper deutlich reduziert und die Assayleistung begrenzt wird (Abbildung 5C).

Abbildung 5. Vergleich optimaler und suboptimaler Assay-Parameter. Vergleich der ergebnisse, die über optimierte Parameter (links) oder suboptimale Parameter (rechts) erfasst werden. (A) Gesunde PBMCs wurden vor der Bildgebung 15 min lang mit Propidiumjodid mit 1 g/ml (links) oder 5 g/ml (rechts) gefärbt. (B) Bilder von OCI-AML2-Zellen, die mit (links) oder ohne (rechte) Plattenzentrifugation aufgenommen wurden. (C) Bilder von OCI-AML2-Zellen, die mit optimaler (links) oder übermäßiger (rechts) Integrationszeit für den Hoechst-Kanal erfasst wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Zusatztabelle S1. Rentabilitätsunterschiede für ein Panel von Assays in OCI-AML2-Zellen nach der CCCP-Behandlung. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit wurde nach 24 h Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von CCCP durchgeführt. Die unterschiede bei der medialen Lebensfähigkeit zwischen getesteten Assays (Hoechst/PI, LDH, MTT oder alamarBlue) und Trypan-Blaufärbung mit automatisierter Zählung wurden auf der Grundlage von Rentabilitätsunterschieden bei jeder Arzneimittelkonzentration berechnet.

Zusatztabelle S2. Lebensfähigkeitsunterschiede für ein Panel von Assays in OCI-AML2-Zellen nach 2-DG-Behandlung. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit wurde nach 24 h Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 2-DG durchgeführt. Die Unterschiede bei der medialen Lebensfähigkeit zwischen getesteten Assays (Hoechst/PI, LDH, MTT oder alamarBlue) und Trypan-Blaufärbung mit automatisierter Zählung wurden auf der Grundlage von Rentabilitätsunterschieden bei jeder Arzneimittelkonzentration berechnet.

Zusatztabelle S3. Lebensfähigkeitsdifferenz zwischen Hoechst/PI und TB-Ausschlussmethode in OCI-AML2-Zellen nach Roton-Behandlung. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit wurde nach 24 h Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von Roton durchgeführt. Der mittlere Rentabilitätsunterschied zwischen Hoechst/PI und Trypan-Blaufärbung mit automatisierter Zählung wurde auf der Grundlage von Rentabilitätsunterschieden bei jeder Arzneimittelkonzentration berechnet.

Zusatztabelle S4. Lebensfähigkeitsdifferenz zwischen Hoechst/PI und TB-Ausschlussmethode in OCI-AML2-Zellen nach 3-Brompyruvat-Behandlung (3-BP). Die Beurteilung der Lebensfähigkeit wurde nach 24 h Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von 3-BP durchgeführt. Der mittlere Lebensfähigkeitsunterschied zwischen Hoechst/PI und Trypanblaufärbung mit automatisierter Zählung wurde auf der Grundlage von Lebensfähigkeitsunterschieden bei jeder Wirkstoffkonzentration berechnet.

Ergänzende Abbildung S1. Repräsentative Bilder von Zellen, die mit Hoechst/PI gefärbt sind, mit oder ohne Rotonbehandlung in indizierten Konzentrationen in serumfreien RPMI-1640-Medien für 24 h: A-B. AML: MOLM-13-Zelllinie (A), und primäre AML-Zellen (B) aus einer repräsentativen Patientenprobe abgeleitet. C. ALL: MOLT-4-Zelllinie. D. CML: K562 Zelllinie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Obwohl das Protokoll für Hoechst/PI Cytotoxizität-Assay robust ist und vergleichsweise wenig Hands-on-Zeit erfordert, gibt es mehrere experimentelle Details, die sehr wichtig sind, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Zunächst ist darauf zu achten, dass die DMSO-Konzentration unter 0,5 % (v/v) bleibt. Es ist allgemein vereinbart, dass die Exposition gegenüber selbst niedrigen Dosen von DMSO die Morphologie und Anhaftung von Zellen wesentlich verändern und die Zellzyklusprogression signifikant verzögern kann^39,40.

Zweitens sollte die Färbung so schnell wie möglich nach der Behandlung durchgeführt werden. Da es keine Waschschritte gibt, bleibt die Verbindung in den Brunnen und kann den Zellen weiterhin Schaden zufügen. Im Vergleich zum früheren Protokoll³⁵wurden die Zellen nur 15 Minuten lang befleckt. Dies schränkt die Möglichkeit ein, dass lebensfähige Zellen versehentlich mit Propidiumjodid befleckt werden könnten. Aus diesem Grund empfehlen wir verblüffende Behandlungen und Färbung, wenn mehr als zwei Platten behandelt werden. Dies ermöglicht die Bildgebungszeit zwischen den Platten und verbessert die Reproduzierbarkeit.

Drittens ist die angemessene Farbstoffkonzentration vom Zelltyp abhängig. Es ist wichtig, empirisch die optimierte Propidiumjodidkonzentration zu bestimmen, beginnend mit unbehandelten Zellen, wobei Trypanblaufärbung als orthogonale Referenz verwendet wird.

Schließlich ist auch der Zentrifugationsschritt unmittelbar vor der Visualisierung kritisch. Basierend auf diesem Protokoll wird ein Bereich von 500-4.000 Zellen aufgezeichnet (abhängig von der Saatdichte). Dies ist eine bemerkenswerte Verbesserung gegenüber den 100-400 Zellen pro gut genutzten zuvor³⁵. Angesichts der Variation der Population von Krebszellen (insbesondere Primärzellen) ist es wichtig, mehr Zellen zur Analyse zu haben, und kann eine robustere Datenanalyse ermöglichen.

Aufgrund der relativen Einfachheit der Methode kann eine Vielzahl von Änderungen leicht durchgeführt werden. Zum Beispiel sind viele andere zellimpermeant Farbstoffe von einer Reihe von Anbietern erhältlich und können durch Propidiumjodid ersetzt werden. Während diese Substitution allein relativ wenig Wert hat, bedeutet die erhöhte Farbpalette, dass komplexere Experimente durchgeführt werden können. Beispielsweise ermöglicht die Zugabe einer dritten Farbe die Bewertung des Differentialüberlebens zwischen Subpopulationen von Zellen, wie dies häufig mit der Durchflusszytometrie durchgeführt wird.

Eine wesentlichere Änderung des Protokolls ist der Vorbenehmen an der Zellvisualisierung und stattdessen die Verwendung eines Spektralphotometers. Dieser Ansatz hat den Vorteil, dass ein nahezu allgegenwärtiges Gerät (ein Standardspektralphotometer mit Mikroplattenleser) verwendet wird und ist die schnellste Methode, um Daten zu erfassen. Diese Methode ist jedoch weit weniger genau. Die Fluoreszenzintensität ist repräsentativ für die Zellfärbung, aber stochastische Variationen der Färbeintensität in Kombination mit dem relativ kleineren Probenbereich führen zu einer signifikanten Variabilität. Während eine weitere Optimierung (z. B. die Einbeziehung eines fixativen, zusätzlichen Waschschritte oder einer größeren Anzahl von Proben) diese Probleme beheben kann, ist die Fluoreszenzmikroskopie im Allgemeinen ein überlegener Ansatz.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das modifizierte Hoechst/PI-Protokoll ein schneller, präziser, kostengünstiger, hochdurchsatzbezogener Zytotoxizitätstest ist, der unabhängig von der mitochondrialen Funktion ist. Dieser Assay hat einen erheblichen Nutzen für das effiziente Screening von Verbindungen oder zusammengesetzten Kombinationen, die auf Mitochondrien abzielen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

NVK, ein CPRIT-Stipendiat in der Krebsforschung, dankt dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) für die großzügige Unterstützung, CPRIT-Stipendium RR150044. Diese Arbeit wurde auch durch den Welch Foundation Research Grant C-1930 und von den National Institutes of Health R35 GM129294 an NVK verliehen. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.