Analyse der Entwicklung der kardialen Kammer in der Maus Embryogenese mit ganzen Mount Epifluoreszenz

Wir präsentieren Ihnen die Protokolle, um die Maus Herz Entwicklung mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie auf Mausembryonen seziert von ventrikulären spezifische MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns, jede Stufe der ventrikulären Formation während der Maus Herz Entwicklung ohne arbeitsintensive histochemische Methoden direkt zu visualisieren.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Zerlegung von Mäuseembryonen und Visualisierung der embryonalen Maus ventrikuläre Kammern während Herz-Entwicklung mit ventrikulären bestimmte fluoreszierende Reporter Knock-in Mäusen (MLC-2v-TdTomato Mäuse) zu beschreiben. Herz-Entwicklung beinhaltet eine lineare Herz Rohr Formation, das Herz Rohr Schleifen und vier Kammer Septation. Diese komplexen Prozesse sind hoch bei allen Wirbeltieren konserviert. Das embryonale Herz Maus hat seit Herz Studien weit verbreitet. Allerdings ist aufgrund ihrer sehr geringen Größe sezieren embryonalen Mäuseherzen technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus braucht Visualisierung der kardialen Kammer Bildung oft in-situ Hybridisierung, Beta-Galaktosidase Färbung mit LacZ Reporter Mäuse oder Immunostaining geschnittenen embryonale Herz. Hier beschreiben wir wie sie sezieren embryonalen Mäuseherzen und ventrikuläre Kammer Bildung von MLC-2v-TdTomato Mäuse mit ganzen Berg Epifluorescent Mikroskopie direkt zu visualisieren. Mit dieser Methode ist es möglich, direkt Herz Rohr Bildung und looping und vier-Kammer-Bildung ohne weitere experimentelle Manipulation von Mäuseembryonen untersuchen. Obwohl die MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Maus Zeile in diesem Protokoll als Beispiel verwendet wird, kann dieses Protokoll auf andere Herz-spezifischen fluoreszierenden Reporter transgene Mauslinien angewendet werden.

Kammer-Formation während Herz-Entwicklung ist ein komplexer Prozess, der Übergang durch mehrere morphologisch unterschiedliche embryonalen Phase^1,2. Die sichelförmige Form von kardialen Progenitorzellen Bevölkerung bildet eine lineare Herz Rohr und dann erfährt, Dehnung und Schleife um die Spirale form des entwickelnden Herzen. Nach seiner Septation Prozess wandelt sich entwickelnden Herzen in vier Kammern Herzen. Unterbrechung der Prozesse führt zu Entwicklungsstörungen Herzfehler. Daher ist es wichtig zu verstehen, die molekularen Mechanismen Kammer Bildung bei der Entwicklung von Herzen. Trotz zahlreichen früheren Studien über Herz-Entwicklung bleibt unser Verständnis dieses komplexen Prozesses begrenzt.

In-situ Hybridisierung, Immunohistochemistry und Beta-Galaktosidase Färbung mit LacZ Reporter Mäusen wurden weithin verwendet, um die Kammer Bildung während der Maus Herz Entwicklung untersuchen durch Kennzeichnung bestimmten Herz- oder Kammer bestimmte STRUKTURGENE oder Proteine (z. B. Nppa, Putsch-TFII, Irx4, MLC-2a und MLC-2v)^{3,4,5,6,7,8,9,10}. Diese Experimente mit Mausembryonen erfordern jedoch viel Zeit und Know-how, weil mehrere verschiedene experimentelle Schritte werden nacheinander¹¹durchgeführt. Hier beschreiben wir eine einfache ganze Berg Epifluorescent Mikroskopie Methode um entwickelnden Embryonen von MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen¹²seziert Ventrikel zu visualisieren. Der Vorteil dieser Methode im Vergleich zur bisher verwendeten Methoden ist es, komplexe experimentelle Schritte zu vermeiden, die oft experimentelle Variationen erstellen kann. Der Hauptzweck dieses Protokolls soll beschreiben, wie Mausembryonen und entwickelnden Herzen zu sezieren und zu jedem Entwicklungsschritt Maus kardiale Kammer ohne mühsame histochemische Experimente zu prüfen. Diese Methode kann leicht verwendet werden, um Herz-Entwicklung mit verschiedenen anderen transgene Mauslinien frühen kardialen Marker beschriften zu bewerten (z. B. Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³, Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³, Hcn4H2BGFP¹⁴, Hcn4Cre: Rosa mT /mG¹⁴, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Hcn4-eGFP¹⁵, Isl1Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵und TgMef2c-AHF-GFP¹⁶ Mäuse).

Alle tierische Verfahren wurden mit Zustimmung der Vanderbilt University Medical Center institutionelle Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. Maus Embryo Sammlung und Dissektion

1. Paaren sich 8-10 Wochen alten weibliche MLC-2v-TdTomato^{+ /-} Mäusen mit 8-10 Wochen alten männlichen MLC-2v-TdTomato^{+ /-} Mäusen zu MLC-2v-TdTomato^{+ / +}, MLC-2v-TdTomato^{+ /-} und MLC-2v-TdTomato^{- / -} Embryonen.
2. Überprüfen Sie die Dämme für vaginalen Stecker jeden Morgen. Mittags am Tag der vaginal Plug Erkennung gilt als E0.5.
   Hinweis: Vaginale Untersuchung zur Erkennung eines vaginalen Steckers sollten durchgeführt werden, in der früh (innerhalb von 8-24 h nach sexueller Aktivität), da ein vaginal Plug den ganzen Tag verloren gehen kann.
3. Die schwangere Dämme an verschiedenen Tagen Post Coitum (z. B. E8.5, E10.5 und E12.5) einschläfern mit CO₂ Inhalation gefolgt von zervikale Dislokation.
4. Legen Sie die Mäuse Rückenlage und sprühen Sie 70 % igem Ethanol auf dem Bauch der Mäuse, Maus Haare Kontamination während der Präparation zu vermeiden.
5. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch Inzision der Haut und der Bauchwand mit scharfen chirurgische Schere und einer Forcep.
6. Suchen Sie bilaterale uterine Hörner im dorsalen Teil der Bauchhöhle.
7. Trennen Sie die gesamte Gebärmutter durch sorgfältig über die Eileiter auf beiden Seiten mit scharfen chirurgische Schere und einer Forcep schneiden.
8. Legen Sie die gesamte sezierte Gebärmutter in einer 10 cm Petrischale mit eiskaltem PBS und trennen Sie jede Fruchtblase entlang des uterinen Horns mit scharfen chirurgische Schere und einer Forcep sorgfältig zu.
9. Übertragen Sie jedes Embryo in einzelnen Vertiefungen der 6 well-Platte mit eiskaltem PBS mit einer Transferpipette gefüllt.
10. Eröffnen Sie unter dem sezierenden Mikroskop eine Fruchtblase und setzen Sie jedes Embryo durch das Abschneiden der Nabelschnur mit scharfen chirurgische Schere und ein Forcep in einen einzelnen Brunnen von einem 6-well-Platte mit eiskaltem PBS.
11. Trimmen Sie, extraembryonalem Gewebe so weit wie möglich ohne Beschädigung des Embryos mit scharfen chirurgische Schere und einer Forcep.
    Hinweis: Ganze Berg Epifluorescent Bildgebung des gesamten Mausembryos erfolgt in der Regel vor dem sezieren entwickelnden Herzen, wie unten beschrieben.
12. Schneiden Sie den Embryo Kopf mit scharfen chirurgische Schere und einer Forcep und Übertragung auf einen 1,5 mL-Tube mit 100 µL Puffer A (25 mM NaOH und 0,2 mM EDTA) für die Genotypisierung mit den Ergebnissen der Epifluorescent Bildgebung korrelieren.
13. Öffne die Truhe des Embryos mit feinen Pinzette, entfernen Sie das Herz von den Lungen und Gefäßsystem mit scharfen Chirurgische Scheren und Pinzetten und sezierte embryonale Herz in einen Brunnen von einem 12-well-Platte mit PBS mit einer Transferpipette zu übertragen. Alle Dissektion Verfahren werden unter dem sezierenden Mikroskop mit einer Faser optische Mikroskop Beleuchtung ergänzt.
    Hinweis: Es war technisch schwierig, aus embryonalen Mäuseherzen bei E8.0 oder E8.5, wegen ihrer sehr geringen Größe und fragile Struktur zu sezieren. Frühe embryonale Herz (E8.0 und E8.5) können innerhalb der ganze Berg Embryo ohne Dissektion untersucht werden.

2. gesamte-Mount Epifluoreszenz Bildgebung

1. Legen Sie die 12-well-Platte mit embryonalen Mäuseherzen unter ein Epifluorescent Mikroskop sezieren.
2. Positionieren Sie unter einer Epifluorescent sezieren Mikroskop mit feinen Pinzette das embryonale Herz so, dass dritten Ventrikel in unmittelbarer Nähe der Prüfer sind.
3. Anpassen des Bildes ein 0.63 X Ziel konzentrieren (Zoombereich zwischen 3,15 x und 18,9 X) im Hellfeld-Modus.
4. Hellfeld Forderungen und mehrere Bilder zu erfassen. Die Bilder wurden in der Regel durch eine zweite Belichtung erhalten. Belichtungszeiten können allerdings variieren je nach Beleuchtung und Kamera Specificationss und für jedes Setup optimiert werden müssen.
5. Eine Faser optische Mikroskop Beleuchtung schalten Sie aus, und setzen Sie den Filter für rote Fluoreszenz (Ex545 nm/Em 605 nm), TdTomato Ausdruck zu visualisieren.
6. Nachjustieren Sie Fokussierung des Bildes, wenn nötig.
7. Passen Sie Helligkeit und Kontrast, rote fluoreszierende Forderungen und mehrere Bilder zu erfassen.
   Hinweis: Die folgenden Bildeinstellung diente in der Regel: 1 s Belichtungszeit, 2 x Gain, 1,0 Sättigung und 1,0 Gamma-Korrektur. Die optimale Einstellung muss für jedes Experiment optimiert werden. Sobald die optimale Einstellung festgelegt ist, muss die gleiche Einstellung für eine gesamte Experiment verwendet werden.

(3) Genotypisierung

1. Kochen Sie die Proben aus Schritt 1.12 für 1 h bei 100 ° C.
2. Zentrifuge für 2 min bei 11.360 X g, Transfer 20 µL Überstand in ein neues 1,5 mL Röhrchen mit 20 µL Puffer B (40 mM Tris HCl, pH 5,5) und mischen sie.
3. Nehmen Sie 4,5 µL der gemischten Überstand aus Schritt 3.2 als DNA-Vorlage, kombinieren Sie es mit 0,5 µL der einzelnen spezifischen vorwärts und reverse Primer (10 µM), 10 µL vorgemischten Polymerase und Reaktion-Puffer (2 X) (siehe Tabelle der Materialien), und dann Wasser hinzufügen, um eine totale v Olume von 20 µL. Primer-Sequenzen sind wie folgt.
   FORMEL 1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3 "
   R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3 "
   F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3 "
   R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3 "
4. Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit dem folgenden PCR-Programm (Tabelle 1 und Tabelle 2).
5. Ausführen PCR verwenden Proben und DNA-Leiter auf einem 1 % Agarose-Gel bei 140 V in 1 X TAE (Tris-Acetat-EDTA)-Puffer (40 mM Tris-Acetat und 1 mM EDTA) für 25 min. eine 100 bp DNA-Leiter, um die Größe der PCR-Bands zu schätzen.
6. Legen Sie die DNA-Gel auf einem UV-Transilluminator identifizieren die DNA-Bänder und schalten Sie das UV Licht.

Während der Entwicklung von Herz MLC-2v zählt zu den frühesten Marker für ventrikuläre Kammer Spezifikation¹⁷. Wie in Abbildung 1dargestellt, wir ganze Maus-Embryonen und embryonalen Herzen von MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen seziert und MLC-2v-TdTomato Reporter Ausdruck während der Herzen Entwicklung untersucht. Bei MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen, konstitutiven TdTomato Ausdruck im entwickelnden Herzen mittels Epifluoreszenz ganze Berg Imaging visualisiert ist bereits in der E8.0¹² (Abbildung 2). Relativ schwachen Ausdruck des TdTomato im linearen Herz Rohr am E8.0 wird stärker auf E8.5. Bei E10.5 MLC-2v-TdTomato Reporter Ausdruck zeigte sich im ventrikulären Portion seziert geschlungene Herzen aus eine ganze Mausembryos, während es in den Zufluss Trakt, der Ausflusstrakt oder die zukünftige Vorhöfe nicht gezeigt wurde. E12.5-E13.5 zeigte ganze Berg Epifluorescent Bildgebung des Herzens von MLC-2v-TdTomato Knock-in-Reporter Mausembryos seziert, dass die TdTomato-Reporter in die Ventrikel des Herzens vier Kammern ausschließlich zum Ausdruck kommt. Die ähnliche ventrikuläre spezielle Expressionsmuster von MLC-2v-TdTomato Reporter zeigte sich in der seziert Maus-Embryo im E16.5. Mit dieser Methode können wir leicht die ventrikuläre Kammer Bildung während der Maus Herz Entwicklung aufzuspüren.

Nach dem ganzen Berg Epifluorescent Imaging von Mäuseembryonen oder seziert entwickelnden Herzen, haben wir das Erbgut des Embryos mit dem Kopf von Mäuseembryonen rückwirkend bestätigt. Mit zwei Sätzen von Grundierungen wie in Abbildung 3A, führten wir durch PCR Genotypisierung. Die Embryonen das Wildtyp-Allel tragen zeigte ein 383 bp-PCR-Produkt mit der F1 und R1 Grundierung. Die Embryonen, die Durchführung der TdTomato Knock-in Allels zeigte das 497 bp-PCR-Produkt mit der F2 und R2 Primer eingestellt (Abb. 3 b). Heterozygote Embryonen wurden definiert, durch den Nachweis sowohl die 383 bp und die 487 bp-Bands, während die Wildtyp oder homozygoten Genotyp bestimmt war, durch den Nachweis einer einzigen 383 bp oder 497 bp Band bzw..

Abbildung 1: Gliederung der schrittweisen Versuchsdurchführung für ganze Berg Epifluorescent Aufnahmen von der embryonalen Reporter Mäuseherzen MLC-2v-TdTomato. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Vertreter Epifluorescent Bilder von ganzen Embryonen und entwickelnden Herzen von MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Mäusen seziert. Epifluorescent Darstellung der ganze Berg Embryonen und seziert Herzen in verschiedenen embryonalen Stadien zeigt Konkretisierung der TdTomato in den Herzen zu entwickeln.  (A) ganze Embryo im E8.0, (B) gesamte Embryo im E8.5, (C) gesamte Embryo im E9.0, (D) ganze Embryo im E10.5, (E) ganze Embryo im E13.5 (F) ganze Embryo im E16.5, (G) embryonale Herz am E9.0, (H ) Embryonale Herz E10.5, (ich) embryonale Herz am E13.5 und embryonale Herz (J) bei E16.5.  A, Atrium; V, Ventrikel; IFT, Zufluss-Darm-Trakt; OFT, Ausflusstrakt. Skala bar (A\u2012F) = 1 mm; Skala bar (G-J) = 500 µm.  Diese Zahl wurde von Referenz #12 mit Erlaubnis verändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Genotypisierung von MLC-2v-TdTomato Reporter Knock-in Embryonen. (A) Abbildung der Genotypisierung besser gekleideteres Design. (B) repräsentative Genotypisierung führt mit F1 und R1 Primern (links) und F2 und R2 Primern (rechts). + / +: homozygot, + /-: heterozygot,- / -: Wildtyp. Exon: ein Segment eines Gens, das für die Proteinsynthese benötigten Informationen enthält; IRES: Interne Ribosom Eintrag Website; FRT: Flippase Rekombinase -Rekombination Ziel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: PCR-Programm mit F1 und R1 Primern

Tabelle 2: PCR-Programm mit F2 und R2 Primern

Die hier beschriebene Methode ist relativ einfach, ventrikuläre Kammer Entwicklung zu untersuchen, ohne arbeitsintensive experimentieren um ventrikuläre oder Herz-Kreislauf-spezifische strukturelle Gene oder Proteine zu beschriften. Diese Methode minimiert so, technische Variabilitäten, die oft in Immunostained Herzen Abschnitten gefunden wurden.

Es gibt zwei wichtige Schritte zum erfolgreich durchführen dieses Verfahrens einschließlich genaue Schätzung der embryonalen Alter von Mäusen und Dissektion der embryonalen Herzen. Wir schätzen praktisch, dass weibliche Mäuse embryonale Alter von den Mäusen durch die Identifizierung vaginalen Stecker. Allerdings bedeutet das Vorhandensein von einem vaginalen Stecker Schwangerschaft nicht notwendigerweise. Es zeigt nur, dass Geschlechtsverkehr innerhalb von ca. 8 bis 24 Uhr ereignete. Auch wenn vaginale Stecker zu finden sind, ist es oft schwierig zu bestimmen, ob Mäuse tatsächlich schwanger sind oder nicht bis 10-11 Tage Coitum Post durch den Bauch des weiblichen Mäusen untersuchen. Mehrere Brutpaare von männlichen und weiblichen Mäusen ist eine sichere Zuchtstrategie erwarteten Lebensjahr der Maus Embryonen zu erhalten. Isolieren von Mäuseherzen ohne erhebliche Schäden an ihren Strukturen zu entwickeln ist wichtig, genau zu prüfen, kardiale Kammer Entwicklung in der Embryogenese der Maus wie in Abbildung 1dargestellt. Sorgfältige Dissektion unter einem Mikroskop sezieren und Verständnis Entwicklungsstörungen kardiale Anatomie in jedem embryonalen Stadium vor der Präparation sind notwendig für dieses Protokoll erfolgreich durchführen.

Da MLC-2v-TdTomato Reporter Ausdruck zuerst bei E8.0 zu beobachten ist, ist es nicht möglich, den früheren embryonale Herz Rohr oder Herzstillstand Halbmond Etappe¹²zu untersuchen. Die verschiedenen Reporter Mauslinien früheren kardialen Marker beschriften (z. B. Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³, Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³, Hcn4H2BGFP¹⁴, Hcn4Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Hcn4-eGFP¹⁵ Isl1Cre: Rosa mT/mG¹⁴und Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵, TgMef2c-AHF-GFP¹⁶ Mäuse) kann verwendet werden, um die frühere Entwicklungsstadien Kammer mit der in diesem Artikel beschriebenen Methode zu prüfen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R03 HL140264 (Y.-J. (N) und Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. (N).