تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

نقدم البروتوكولات لدراسة التنمية قلب الماوس باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت على الأجنة الماوس تشريح من البطين محددة حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران. هذا الأسلوب يسمح لنا بتصور كل مرحلة تشكيل البطين خلال الماوس قلب التنمية دون أساليب histochemical كثيفة العمالة مباشرة.

والهدف من هذا البروتوكول وصف طريقة لتشريح الأجنة الماوس والتصور للدوائر البطين الجنينية الماوس أثناء تطوير قلب بطيني مراسل الفلورسنت محددة تدق في الفئران (الفئران حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو) باستخدام. قلب التنمية ينطوي على تشكيل أنبوب قلب خطي وأنبوب القلب حلقات أربعة الدائرة سيبتيشن. الغاية هي حفظت هذه العمليات المعقدة في جميع الفقاريات. قلب الجنينية الماوس تستخدم على نطاق واسع للدراسات الإنمائية القلب. نظراً لحجمها صغير للغاية، تشريح قلوب الجنينية الماوس غير تحديا من الناحية التقنية. وباﻹضافة إلى ذلك، التصور لتشكيل دائرة القلب وكثيراً ما يحتاج في الموقع التهجين، بيتا-جالاكتوسيداسي التلوين باستخدام لاكز مراسل الفئران، أو إيمونوستينينج من قلوب الجنينية مقطعة. هنا، نحن تصف كيفية تشريح قلوب الجنينية الماوس ومباشرة وضع تصور لتشكيل الدائرة البطين من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو الفئران باستخدام الفحص المجهري كله جبل ابيفلوريسسينت. بهذه الطريقة، من الممكن مباشرة دراسة تشكيل أنبوب القلب وحلقات، وتشكيل الدائرة الأربع دون مزيد من التلاعب التجريبية للأجنة الماوس. على الرغم من أن يستخدم السطر الماوس في ضرب مراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو في هذا البروتوكول كمثال، يمكن تطبيق هذا البروتوكول على خطوط الماوس المعدلة وراثيا مراسل الفلورسنت الخاصة بالقلب الأخرى.

تشكيل الدائرة أثناء تطوير القلب عملية معقدة والانتقال عبر عدة مراحل الجنينية شكلياً مميزة^1،2. شكل هلال من خلايا القلب السلف السكان يشكل أنبوب قلب خطي وثم يخضع لاستطالة وحلقات لتشكيل شكل دوامة قلب النامي. بعد عملية سيبتيشن، تتحول قلب النامية القلب أربع غرف. توقف أي من هذه العمليات ينتج عن تشوهات القلب التنموية. وبالتالي، من المهم فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تشكيل الدائرة أثناء تطوير القلب. وعلى الرغم من العديد من الدراسات السابقة في قلب التنمية، فهمنا لهذه العملية المعقدة لا يزال محدودا.

التهجين في الموقع، وإيمونوهيستوتشيميستري، وبيتا-جالاكتوسيداسي تلطيخ لاكز مراسل الفئران باستخدام قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة تشكيل الدائرة خلال الماوس قلب التنمية بوصفها القلب محددة أو الدائرة جينات هيكلية محددة أو البروتينات (مثل Nppa، تفيي الانقلاب، Irx4، 2a حركة تحرير الكونغو وحركة تحرير الكونغو-2v)^{3،4،5،6،،}من^78،9،10. ومع ذلك، تتطلب هذه التجارب باستخدام أجنة الفأر قدرا كبيرا من الوقت والخبرة، نظراً لأن العديد من الخطوات التجريبية المختلفة يجب أن تكون إجراء التسلسل¹¹. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفحص المجهري ابيفلوريسسينت جبل كله بسيطة لتصور البطينين النامية استخدام الأجنة تشريح من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران¹². وميزة هذا الأسلوب مقارنة بالأساليب المستخدمة سابقا هو تجنب الخطوات التجريبية المعقدة التي غالباً ما قد تخلق اختلافات التجريبية. والغرض الرئيسي من هذا البروتوكول لوصف كيفية تشريح الأجنة الماوس وقلوب النامية ودراسة كل مرحلة من مراحل التنمية الدائرة القلب الماوس دون تجارب histochemical مملة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة لتقييم التنمية القلب باستخدام مختلف خطوط الماوس المعدلة وراثيا الأخرى العلامات المبكرة علامات القلب (مثلاً، Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³، Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³،¹⁴من Hcn4H2BGFP، Hcn4Cre: روزا طن متري /mG¹⁴، Nkx2-5Cre: روزا mT/ملغ¹⁴، Hcn4-اجفب¹⁵، Isl1Cre: روزا mT/ملغ¹⁴، Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵، والفئران¹⁶ TgMef2c-أف-التجارة والنقل).

جميع الإجراءات الحيوان أجريت مع موافقة فاندربيلت جامعة مركز المؤسسية الحيوان الرعاية الطبية واستخدام اللجنة.

1-الماوس جمع الأجنة والتشريح

1. زميله القديم في الأسبوع 8-10 الإناث حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو^+/-- الفئران مع حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو الفئران الأسبوع 8-10 القديمة الذكور^+/-- للحصول على حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو^{+ +}، حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو^--/+ وحركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو^-/- الأجنة.
2. فحص السدود المقابس المهبلية كل صباح. ويعتبر بعد ظهر اليوم للكشف عن التوصيل المهبلية E0.5.
   ملاحظة: ينبغي إجراء الفحص المهبلي للكشف عن المكونات مهبلي في الصباح (في حدود 8-24 ساعة بعد النشاط الجنسي)، حيث يمكن سداده مهبلية فقدان طوال اليوم.
3. Euthanize السدود الحامل في أيام مختلفة وظيفة كويتوم (مثل E8.5 و E10.5 و E12.5) استخدام استنشاق أول أكسيد الكربون₂ متبوعاً بخلع عنق الرحم.
4. يكمن فئران ضعيف ورذاذ الإيثانول 70% في بطن الفئران لتجنب التلوث الشعر الماوس أثناء التشريح.
5. فتح تجويف البطن بشق الجلد وجدار البطن باستخدام مقص الجراحية الحادة وفورسيب على حد سواء.
6. قم بتحديد موقع ابواق الرحم الثنائي في الجزء الظهري تجويف البطن.
7. فصل الرحم كامل بعناية قطع أعلاه أوفيدوكتس على كلا الجانبين باستخدام مقص الجراحية الحادة وفورسيب.
8. وضع الرحم تشريح كامل في 10 سم طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني المثلج وفصل كل كيس السلي على امتداد القرن الرحم باستخدام مقص الجراحية الحادة وفورسيب بعناية.
9. نقل كل الأجنة في الآبار الفردية 6 لوحة جيدا مليئة ببرنامج تلفزيوني المثلج باستخدام ماصة نقل.
10. تحت مجهر تشريح، تفتح كيس السلوى وفضح كل الأجنة بقطع الحبل السري باستخدام مقص الجراحية الحادة وفورسيب في بئر فردية من صفيحة جيدا 6 مع برنامج تلفزيوني المثلج.
11. تقليم من الأنسجة الجنينية خارج قدر الإمكان دون إلحاق الضرر بالجنين باستخدام مقص الجراحية الحادة وفورسيب.
    ملاحظة: يتم تصوير كامل جبل ابيفلوريسسينت للجنين كله الماوس عادة قبل تشريح القلب النامية كما هو موضح أدناه.
12. قطع رأس الجنين باستخدام مقص الجراحية الحادة وفورسيب ونقل إلى أنبوب 1.5 مل مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت A (25 مم يدتا هيدروكسيد الصوديوم و 0.2 مم) للتنميط ترتبط بنتائج التصوير ابيفلوريسسينت.
13. فتح صدره للجنين باستخدام الملقط غرامة وإزالة القلب بعيداً عن الرئتين والمفرج باستخدام مقص الجراحية الحادة والملقط ونقل تشريح القلب الجنينية في بئر من 12 لوحة جيدا مع استخدام ماصة نقل برنامج تلفزيوني. يتم إكمال جميع إجراءات التشريح تحت مجهر تشريح مع إضاءة ألياف بصرية مجهر.
    ملاحظة: من الصعب من الناحية الفنية لتشريح بقلوب الجنينية الماوس في E8.0 أو E8.5، بسبب حجم صغير للغاية والبنية الهشة. يمكن فحص قلوب الجنينية المبكرة (أي E8.0 و E8.5) داخل الجنين جبل كله دون تشريح.

2-كل-جبل ابيفلوريسسينسي التصوير

1. ضع لوحة 12 جيدا مع الماوس قلوب الجنينية تحت ابيفلوريسسينت تشريح مجهر.
2. تحت ابيفلوريسسينت تشريح مجهر استخدام الملقط غرامة، ضع قلب الجنينية مثل البطينين النامية تقع قريبة من الفاحص.
3. ضبط التركيز من الصورة باستخدام أحد الأهداف 0.63 x (تكبير نطاق بين 3.15 x و 18.9 x) في الوضع الميداني مشرق.
4. اتخاذ التعرض الميداني مشرق والتقاط صور متعددة. وعادة ما تم الحصول على الصور بثانية واحدة من التعرض. لكن مرات التعرض قد تختلف تبعاً للإضاءة والكاميرا سبيسيفيكاتيونس وتحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل إعداد.
5. إيقاف تشغيل إضاءة ألياف بصرية مجهر، وتعيين عامل تصفية للأسفار حمراء (Ex545 شمال البحر الأبيض المتوسط/م 605 nm) لتصور التعبير تدتوماتو.
6. إعادة ضبط تركيز الصورة إذا لزم الأمر.
7. ضبط السطوع والتباين، وتأخذ الأحمر نيون التعرض، والتقاط صور متعددة.
   ملاحظة: تم وضع الصورة التالية تستخدم عادة: وقت التعرض s 1، 2 × الكسب، وتشبع 1.0، وتصحيح غاما 1.0. يحتاج الإعداد الأمثل يكون الأمثل لكل تجربة. حالما يتم تحديد الإعدادات المثلى، يحتاج نفس الإعداد التي ستستخدم لتجربة كاملة.

3-التنميط

1. يغلي العينات من الخطوة 1.12 ح 1 في 100 درجة مئوية.
2. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 11,360 س ز، نقل 20 ميليلتر من المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة مع 20 ميليلتر من المخزن المؤقت ب (40 مم تريس HCl، الأس الهيدروجيني 5.5) ومزجها.
3. تأخذ ميليلتر 4.5 من المادة طافية مختلطة من الخطوة 3.2 كقالب الحمض النووي، ودمجها مع 0.5 ميليلتر من كل من الأمام محددة وعكس الإشعال (10 ميكرومتر)، 10 ميليلتر من قبل مختلطة بوليميريز ورد فعل المخزن المؤقت (2x) (انظر الجدول للمواد)، ثم قم بإضافة الماء إلى مجموع الخامس علم التمهيدي تسلسلات ميليلتر. 20 أدناه.
   F1: 5 '-تاكككاكجاجاجاجاجاكت-3'
   R1: 5 '-تجاكتكتجاكتجاكتكتجت-3'
   F2: 5 '-أكجكاكجكتجاتكتاكاغت-3'
   R2: 5 '-تتجكجكاكاجكككتججات-3'
4. تشغيل البلمرة المتسلسل (PCR) مع البرنامج بكر التالية (الجدول 1 و الجدول 2).
5. تشغيل PCR استخدام العينات وسلم الحمض النووي في 1% [اغروس] هلام في 140 الخامس في المخزن x TAE (تريس-خلات-يدتا) 1 (40 تريس-خلات و 1 ملم يدتا) عن 25 دقيقة سلم الحمض النووي bp 100 لتقدير حجم العصابات PCR.
6. ضع الجل الحمض النووي في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية لتحديد نطاقات الحمض النووي وتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

أثناء تطوير القلب، تعتبر حركة تحرير الكونغو-2v علامة أقرب للدائرة البطين مواصفات¹⁷. كما هو مبين في الشكل 1، نحن تشريح الأجنة كله الماوس وقلوب الجنينية من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران ودراسة حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو المراسل التعبير أثناء تطوير القلب. في حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران، هو تصور التعبير تدتوماتو التأسيسي في قلب النامي عن طريق تصوير جبل كله ابيفلوريسسينسي أقرب E8.0¹² (الشكل 2). التعبير ضعيفة نسبيا من تدتوماتو في قلب خطي الأنابيب في E8.0 يصبح أقوى في E8.5. في E10.5، أظهرت حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو المراسل التعبير في جزء بطيني القلب يحلق تشريح من جنينا ماوس كاملة، بينما لم تبين في المسالك تدفق أو المسالك إلى الخارج أو اتريا مستقبلا. في E12.5-E13.5، أظهر تصوير كامل جبل ابيفلوريسسينت من تشريح قلب الجنين الماوس في ضرب مراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو أعرب المراسل تدتوماتو هو حصرا في البطينين القلب أربع غرف. مماثلة تبين نمط التعبير محددة البطين مراسل وحركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو في الماوس تشريح الجنين في E16.5. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن يمكن بسهولة تعقب تشكيل الدائرة البطين خلال الماوس قلب التنمية.

بعد تصوير كامل جبل ابيفلوريسسينت الأجنة الماوس أو تشريح قلوب النامي، أكدنا أثر رجعي النمط الوراثي للجنين رئيس الأجنة الماوس باستخدام. استخدام مجموعتين من الإشعال كما هو موضح في الشكل 3 ألف، أجرينا الوراثي PCR. وأظهرت الأجنة تحمل اليل البرية نوع منتج PCR bp 383 استخدام مجموعة التمهيدي F1 و R1. تعيين الأجنة تحمل تدتوماتو تدق في اليل أظهر المنتج بكر 497 بي بي باستخدام الدليل التمهيدي F2 و R2 (الشكل 3B). حددت الأجنة متخالف بإظهار كلا 383 bp وعصابات bp 487، في حين يتحدد نوع البرية أو وراثي متماثل مما يدل 383 واحد bp أو 497 bp الفرقة، على التوالي.

رقم 1. الخطوط العريضة للإجراءات التجريبية التدرجي لتصوير كامل جبل ابيفلوريسسينت الجنينية قلوب الماوس مراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2. صور الممثل ابيفلوريسسينت الأجنة كلها وقلوب النامية تشريح من حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو مراسل تدق في الفئران. تصوير ابيفلوريسسينت قلوب تشريح وجبل كله الأجنة في مراحل مختلفة من مراحل الجنينية يوضح تعبيراً محدداً من تدتوماتو في البطينين النامية القلوب.  الجنين كله (A) في E8.0، الجنين (ب) كلها في E8.5، الجنين كله (ج) في E9.0، الجنين (د) أسرة في E10.5، الجنين كله (ه) في E13.5، والجنين كله (F) في E16.5، (غ) قلب الجنين في E9.0، (ح ) قلب الجنين في E10.5 والقلب (أنا) Embryonic في E13.5، وقلب الجنين (ي) في E16.5.  أ، اتريوم؛ الخامس، بطين؛ ايفت، تدفق المسالك؛ الغفور، المسالك إلى الخارج. مقياس بار (A\u2012F) = 1 مم؛ مقياس بار (ز-ي) = 500 ميكرومتر.  لقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع #12 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. الوراثي لمراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو تدق في الأجنة- (أ) رسم توضيحي للتصميم التمهيدي التنميط. التنميط الممثل (ب) النتائج باستخدام F1 و R1 الإشعال (يسار) والإشعال F2 و R2 (يمين). + +: متماثل، +/--: متخالف،-/-: نوع البرية. إكسون: قطعة من الجين الذي يحتوي على المعلومات المطلوبة تخليق البروتين؛ آيريس: موقع دخول الريبوسوم الداخلية؛ معاهدة سجل الأفلام: فلبس ريكومبيناسي-جزئ المستهدفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: بكر البرنامج باستخدام كبسولة تفجير F1 و R1

الجدول 2: بكر البرنامج باستخدام كبسولة تفجير F2 و R2

الأسلوب الموصوفة هنا بسيط نسبيا لدراسة تطوير الدائرة البطين، دون إجراء تجارب ذات العمالة الكثيفة لتسمية الجينات الهيكلية البطين أو الخاصة بالقلب أو البروتينات. ومن ثم، يقلل هذا الأسلوب التقلبات التقنية التي تم العثور عليها غالباً في أقسام القلب إيمونوستينيد.

هناك اثنين من الخطوات الحاسمة لنجاح تنفيذ هذا الأسلوب بما في ذلك تقدير دقيق لسن الجنينية للفئران وتشريح من قلوب الأجنة. ونحن عمليا تقدير سن الجنينية للفئران بتحديد المهبلية المقابس في الفئران الإناث. ومع ذلك، وجود المكونات المهبل لا تشير بالضرورة إلى الحمل. أنه يشير فقط إلى أن حدث الجماع خلال فترة تقريبية 8 إلى 24 ح. حتى إذا تم العثور على المقابس المهبلية، غالباً ما يصعب تحديد ما إذا كانت الفئران الحوامل الواقع أو لا حتى أيام 10-11 وظيفة كويتوم بفحص البطن للفئران الإناث. تربية عدة أزواج من الفئران الذكور والإناث استراتيجية تربية آمنة للحصول على العمر المتوقع للماوس الأجنة. عزل النامية قلوب الماوس دون أضرار كبيرة لهياكلها أمر حاسم لدقة دراسة تطوير دائرة القلب أثناء embryogenesis الماوس كما هو مبين في الشكل 1. تشريح دقيق تحت مجهر تشريح وفهم تشريح القلب التنموية في كل مرحلة جنينية قبل تشريح ضرورية لنجاح تنفيذ هذا البروتوكول.

منذ أول مرة يلاحظ التعبير مراسل حركة تحرير الكونغو-2v-تدتوماتو في E8.0، من غير الممكن لدراسة سابقة قلب الجنينية أنبوب أو القلب مرحلة الهلال¹². خطوط الماوس مراسل مختلف العلامات علامات قلبية سابقة (مثلاً Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³، Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³،¹⁴من Hcn4H2BGFP، Hcn4Cre: روزا mT/ملغ¹⁴، Nkx2-5Cre: روزا mT/ملغ¹⁴، Hcn4-اجفب¹⁵ ، Isl1Cre: روزا mT/ملغ¹⁴، و Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵، TgMef2c-أف-التجارة والنقل¹⁶ الفئران) يمكن استخدامها للنظر في المراحل المبكرة لتطوير الدائرة باستخدام الطريقة الموضحة في هذه المقالة.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أيد هذا العمل HL140264 R03 المعاهد الوطنية للصحة (ي. ج. N) وجيليد العلوم بحوث علماء البرنامج (ي. ج. N).