Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Lymphocytenvermehrung als Reaktion auf antigen oder mitogene Stimulation ist ein leicht quantifizierbare Phänomen nützlich zum Testen von immunmodulatorischen (dh immunsuppressive oder immunstimulatorischen) chemischen Verbindungen und Biologika. Einer der ersten Schritte bei der Mitogenese ist Zellvergrößerung oder blastogenen Transformation, wobei das Zellvolumen erhöht sich vor der Teilung. Es ist normalerweise nachweisbar in den ersten Stunden der T-Lymphozyten-Stimulation. Hier beschreiben wir ein schnelles Verfahren Blastogenese in T-Lymphozyten von Mäusen die Milzen und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines automatischen Zellzählers isoliert zu quantifizieren. Verschiedene üblicherweise verwendete Proliferationsassays zum größten Teil sind aufwendig und beziehen sich nur die Gesamtpopulation Wirkung anstatt einzelne zelluläre Effekte innerhalb einer Population. Im Gegensatz dazu liefert die präsentierte automatische Zellzähler Assay eine schnelle, direkte und präzise Messungen der Zelldurchmesser, die sein kannzur Bewertung der Wirksamkeit der verschiedenen Mitogenen und immunmodulatorische Arzneimittel in vitro eingesetzt.

T-Lymphozyten sind die primären Zellen verantwortlich für die adaptive Immunität bei Säugetieren. Es ist bekannt, dass sie auf spezifische antigene Peptide präsentiert durch MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen reagieren. Bei Aktivierung eines kognaten T-Zell-Rezeptor (TCR), vergrößert sich die Zelle in einem Prozess blastogenen Transformation bezeichnet, oder Blastogenese. Dieser Prozess ist in der ersten ~ 6 Stunden nachweisbar nach dem Stimulus ¹ angewendet wird. Während blastogenesis erhöhen sich die Volumina der einzelnen T - Zellen 2- bis 4-fach ^2-6. Lymphocyten beginnen, in einem Verfahren zur Proliferation eine klonale Expansion genannt, deren Zweck es ist, so viele Klone der Antigen-spezifischen TCR-tragenden Zellen wie möglich zu erzeugen. Die Nachkommenzellen ausüben dann ihre immunologische Funktion durch Differenzierung in zytotoxische (CD8 ⁺⁾ oder Helfer (CD4 ⁺⁾ Effektor - T - Lymphozyten. Somit sind naive T - Lymphozyten in menschlichem oder Maus Blut in der G ₀ (Ruhe) Phase des ZellZyklus und Unterstützung minimale metabolische Aktivität. Bei Einwirkung von Antigenen oder Mitogenen, erneut eingeben T - Zellen in den Zellzyklus, mit einer gleichzeitigen Stimulation der Transkription und Proteinsynthese ^7-10. Mitogene, wie Phorbol - 12-Myristat - 13-acetat (PMA) und Ionomycin die Lymphozyten durch die Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) und Ca ²⁺ -abhängigen Signalwege ¹ stimulieren. Die Aktivierung von T-Zellen mit PMA / Ionomycin umgeht die TCR Signalisierungsschritte.

In - vitro - Proliferationsassays sind zum Zweck der Bewertung der Lymphozytenfunktion und die Reaktion auf Reize verwendet. Proliferation Ablesungen werden typischerweise ein bis drei Tage nach dem Beginn der T-Zell-Stimulation und reflektieren den kollektiven Zustand von Hunderten oder Tausenden von Zellen aufgenommen. Die Wirksamkeit von verschiedenen Mitogenen und immunmodulatorische Arzneimittel in vitro kann durch einfaches Messen Proliferationsraten in Gegenwart dieser Verbindungen beurteilt werden. Einige dieser assays und ihre Grenzen werden nachstehend erörtert.

Für die direkte Zellzahl Zählen ist das Verfahren zeitaufwendig, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von Bedienungsfehlern.

Für die DNA-Synthese mißt der 3H-Thymidin-Einbau-Assay der DNA-Synthese, aber die Hauptbeschränkung ist die Radiotoxizität. Eine nicht-radioaktive Alternative ist BrdU, aber der Bereich der Linearantwort für das Zellwachstum ist begrenzt, und die Antikörperbehandlung erforderlich, was die Anzahl der Schritte in dem Verfahren ^11,12 erhöht.

Für die Stoffwechselaktivität, Tetrazoliumsalze (MTT, MTS, XTT und WST-1) und Resazurin farbstoffbasierte kolorimetrische Assays berichten die allgemeine Stoffwechselzustand von Zellpopulationen unterteilen. Jedoch ist MTT in dem Kulturmedium nicht löslich ist, zusätzliche Waschschritte erforderlich sind, wodurch Fehler bei der Messung enthält; XTT benötigt zusätzliche Komponenten effizient zu reduzieren; MTS-, WST-1- und Resazurin-basierten Messungen beeinflussened von dem Kulturmedium pH - Wert und seine Komponenten Serum, Albumin oder Phenol - Rot ^13-16. Diese Assays messen nicht die tatsächliche Anzahl von lebensfähigen Zellen, sondern schätzen die kombinierten Enzymaktivitäten. Daher kann nicht der Proliferationsrate genau durch metabolische Assays bestimmt werden , da der nicht-lineare Korrelation zwischen der Zellzahl und Farbstoffreduktion ^12,17.

Zur Messung der ATP-Konzentration, T-Zell-Aktivierung induzierte Erhöhungen der ATP korrelieren mit Proliferation. Jedoch Erhöhung der intrazellulären ATP ist einer der ersten Schritte der T-Zell-Aktivierung; viele Schritte hinter die tatsächliche Verbreitung ^17,18.

Für Farbstoffdilution Assay Farbstoff CFSE Fluoreszenzfarbstoffen Zellen durch intrazelluläre Proteine ​​kovalent zu binden. Der Farbstoff zeigt einen Proliferation abhängige Abnahme der Fluoreszenzintensität, welche die Anzahl der Zellteilungen verfolgen können. Aufgrund der kovalenten Proteinmarkierung, die Funktionen dieserProteine ​​können beeinträchtigt werden. Der Farbstoff ist toxisch für die Zellen bei höheren Konzentrationen. Bei niedrigeren Farbstoffkonzentrationen jedoch die anfängliche Fluoreszenzintensität verringert wird, die Anzahl der Zellteilungen abnimmt, die verfolgt werden können. Außerdem nach Markierung mit CFSE, gibt es eine proliferations unabhängige ~ 50% Verlust der anfänglichen Fluoreszenz während der ersten 24 bis 48 Stunden - Zeitraum, der den dynamischen Bereich des Assays ^19,20 begrenzt.

Die meisten dieser Assays spiegeln den kollektiven Zustand einer großen Anzahl von Zellen und erfordern die Behandlung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Nekrotische und apoptotische Zellen dieser Messungen könnte auch dazu beitragen, sofern sie nicht aus der Analyse entfernt werden, indem sie mit Chemikalien oder Antikörpern Anfärbung.

Lymphozytenblastogenese kann durch eine Vielzahl von Verfahren, wie beispielsweise optische Mikroskopie oder Durchflußzytometrie ^4,21,22 ausgewertet werden. Hier haben wir ein schnelles Verfahren zur Messung von T-Zellengrößen beschreiben eine Verwendungn automatisierten Zellzähler, der Echtzeit-Zell Bilder sammelt, die gespeichert und können zu einem späteren Zeitpunkt erneut analysiert werden. Neben Größenmessungen liefert diese Vorrichtung präzise Zellzahlen und den Prozentsatz von lebensfähigen Zellen, bestimmt durch Trypan-Blau-Färbung Ausgrenzung. Das Gerät in diesem Protokoll verwendet wird, ist im Handel erhältlich, und der Hersteller getestet, um die Genauigkeit des Instruments mit drei verschiedenen Instrumenten und mehrere Konzentrations und Lebensfähigkeit Kontrollen. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten einen Variationskoeffizient, der im allgemeinen unter 6% liegt. Wie im Protokoll erwähnt, wird das Gerät mit 6 & mgr; m auf einer regelmäßigen Basis geeicht und 8 um Durchmesser Polystyrolkügelchen. Die Vorteile der Verwendung eines Zellzählers unter Verwendung von ruhenden T-Zellen und T-Lymphoblasten basierend auf Zelldurchmesser zu unterscheiden, ist die einfache Bedienung und das automatische Art der Analyse. Die Software ist in der Lage einen Kreis um jede Zelle Zeichnung und der Zelldurchmesser zu berechnen. Zusätzlich kann die imAlter sind für den Bediener sichtbar, die die Zellen zu identifizieren und richtig Zeichnen eines Kreises um sie herum die Genauigkeit des Geräts überprüfen können. In Bezug auf die Einschränkungen, kann das Gerät nicht per se unterscheiden zwischen Schutt und Zellen; Daher ist es wichtig, daß die Bedienungsperson jedes Bild betrachtet, wie es verarbeitet wird. Es gibt ein Potential für Luftblasen enthält, die die Anzahl von verwendbaren Felder zur Analyse abnimmt; dies ist jedoch selten, wenn die regelmäßige Spülung Wartung durchgeführt wird.

In dieser Studie wurden Gruppen von Milz-T-Lymphozyten wurden mit Ionomycin stimuliert und Konzentrationen von PMA für 12-48 h erhöht. PMA Konzentrationen so niedrig wie 2 ng / ml induziert sowohl eine robuste blastogenen Reaktion und eine signifikante Proliferation. Messungen der Wirkungen mehrerer Drogen, wie beispielsweise die Immunsuppressiva Cyclosporin A (CsA), FK506 (Tacrolimus) und Rapamycin (Sirolimus), sowie Ionenkanalblockern TRAM-34 und FTY720 (fingolimod), auf blastogenesis zeigten eine gute Übereinstimmung mit berichteten Auswirkungen auf die Proliferation. Die blastogenen Reaktion menschlicher PBMCs zu PMA / Ionomycin und murine T-Zell-Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen wurden ebenfalls gemessen.

Der Zellenzähler Assay sowohl Blastogenese und die Proliferationsrate (Zelldichte) gleichzeitig aber separat, im Gegensatz zu den oben genannten Verfahren quantifiziert, die in einer Kombination dieser Effekte aus. Das vorgestellte Protokoll stellt eine schnelle und robuste Technik für die Wirksamkeit von mitogenen und immunmodulatorischer Wirkstoffe zu bewerten.

Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Wright State University Lab Animal Care und Use Committee und Institutional Review Board genehmigt durchgeführt.

HINWEIS: Human PBMCs durch das Verfahren Ficoll - Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert werden ^5.

1. Spleen Ernte

1. Haus erwachsene weibliche ICR - Mäuse in Standard - Laborbedingungen mit den Lebensmitteln, Wasser und Bettwäsche spezifische Anforderungen im Hinblick auf die Arten.
   HINWEIS: Die Tiere hatten ein mittleres Alter von 2,9 Monaten und einem Durchschnittsgewicht von 30,4 g zum Zeitpunkt der Euthanasie.
2. Am Tag der Isolierung (DOI), einschläfern die Tiere einzeln ohne andere Artgenossen Tiere vorhanden. Machen Sie alle Anstrengungen minimale Belastung auf die Maus zu gewährleisten. Euthanize unter Verwendung von CO ₂ mit sekundären Zervikaldislokation Tod zu gewährleisten.
   1. Legen Sie das Tier, noch innerhalb der Transfer Käfig, in die CO ₂ Kammer und start, um den Gasstrom bei 5 l / min. Diese Strömungsgeschwindigkeit verdrängt Sauerstoff in der empfohlenen 10-30% pro min.
   2. Nachdem das Tier bewusstlos ist, erhöhen zu 15 l / min , um die CO ₂ Durchfluss. Überprüfen Sie das Tier für die Einstellung der Atmung und verlassen in der Kammer für weitere 2 min.
   3. Die Zugkraft Zervikaldislokation mit Ablenkung Tod zu gewährleisten.
3. Ernten Sie die Milz aus dem Tier unter aseptischen Bedingungen innerhalb von 10 Minuten des Todes.
   1. Sterilisieren zwei Sätze von Scheren und Pinzetten für die Entfernung der Milz in einem Autoklaven Ofen vor der Verwendung. Sterilisieren Sie die Dissektion Oberfläche von 70% Ethanol Anwendung.
   2. Bewerben 70% Ethanol auf die Maus Bauch. Mit einem Satz von Schere und Pinzette, machen Sie einen Schnitt in der Fell und Haut von der linken Seite des Bauches, dann auseinander ziehen und ziehen Sie die Haut wieder das Peritoneum zu offenbaren. Einmal ausgesetzt, gelten 4% Chlorhexidin-Lösung, bevor das Peritoneum geöffnet wird.
   3. Mit dem zweiten Satz von scissors und Pinzetten, eine 2- bis 3-cm Schnitt entlang der zentralen Abdomen machen. Öffnen Sie das Peritoneum und entfernen Sie die Milz durch Wegschneiden viszeralen Anlagen und überschüssiges Fett. Legen Sie die Milz in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS).

2. Herstellung von Roh-Splenozyten

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter einem Laminar-Flow-Biosicherheitsschrank unter aseptischen Bedingungen.

1. Einweichen der geernteten Milzen in 10 ml deionisiertem sterilem H ₂ O für 5 min in einer 10 cm Kulturschale , die Oberflächen Erythrozyten zu lysieren.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann entfallen, wenn die Milz während der Isolierung beschädigt wurde.
2. Zum Lösen der Splenozyten, zerquetschen die Milzen zwischen zwei sterilisierte Glasdias (mattiert Seite der Milz zugewandten) über eine frische 10 cm Kulturschale. Mischen mit 10 ml RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 50 IU / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin (nachstehend bezeichnet as vollständiges RPMI).
3. Filtern Sie die Zellen durch ein steriles 40 & mgr; m Nylon-Zellsieb in eine neue 10 cm-Kulturschale das Bindegewebe und Schmutz zu entfernen.
4. Lysieren die verbleibenden Erythrozyten durch Zugabe von 20 ml RBC - Lyse - Puffer besteht aus 155 mM NH ₄ Cl, 10 mM NaHCO ₃ und 0,1 mM EDTA bei pH 7,4 und ~ 300 mOsm / L.
   HINWEIS: Die Osmolalität wird durch einen Gefrierpunkt oder einem Dampfdruck-Osmometer gemessen.
   1. Übertragen, um die Zellen von der 10-cm-Platte auf eine 50 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 250 xg für 10 min (4 ° C).
   2. Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 20 ml RBC-Lyse-Puffer und erneut zu suspendieren die pelletierten Zellen durch Pipettieren.
   3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min unter leichtem Schütteln im Lysepuffer.
   4. Zentrifuge für 10 min bei 250 xg (4 ° C), um die Zellen zu pelletieren. Gießen Sie den Lysepuffer aus.
   5. Re-suspendieren Zellen in 10 ml vollständigem RPMI und zentrifugieren wieder (250 xg, 10 min, 4 ° C). Scheibeard den Überstand.
5. Re-suspend die Splenozyten in 2 ml komplettem RPMI erwärmt auf 37 ° C für die Übertragung auf die Nylonwolle Fasersäule.

3. Reinigung von T-Lymphocyten

1. Waschen Sie die Nylonwolle - Säulen zweimal mit 5 ml komplettem RPMI. Für 1 h in einem 5% CO ₂ Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C inkubieren.
   HINWEIS: Es ist zwingend notwendig, die Nylonwolle wet für die Dauer des Experiments zu halten, und vollständiges RPMI bis 37 ° C für alle Nylonwolle Isolierungsschritte erwärmt zu verwenden.
2. Isolated Splenozyten auf die Säule und Inkubation für 1 h die B - Zellen, Fibroblasten zu ermöglichen und akzessorischen Zellen auf die Nylonwolle anhaftet.
   1. 2 ml RPMI die Splenozyten in die Spalte enthält, und durchlaufen, bis die Spitze des Nylonwolle erreicht ist.
   2. 2 ml komplettem RPMI erwärmt auf 37 ° C an der Oberseite des Nylonwolle und führen Sie das Medium durch die Wollebis der Flüssigkeitspegel erreicht die Oberfläche.
   3. In 3 ml warmem komplettem RPMI auf die Säule vollständig die Nylonwolle abdecken.
   4. Inkubieren Die beladene Säule ungestört in einem 37 ° C, 5% CO ₂ Zellkultur - Inkubator für 1 Stunde.
3. Eluieren die Zellen durch die Säule zweimal mit 5 ml vollständigem RPMI gewaschen. Führen Sie eine zusätzliche Wäsche der eluierten Zellen durch Zentrifugation.
   1. Füllen Sie die Spalte in den oberen 2-mal mit komplettem RPMI und lassen Sie die Lösung in der Säule durch in eine 50 ml sterile konische Röhrchen fließen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie tippen oder die Spalte zu stoßen, die die B-Zellen zu verdrängen können, akzessorischen Zellen und anhaftende Fibroblasten auf die Nylonwolle.
   2. Sammeln der Durchflussfraktion und Schleudern bei 250 xg für 10 min (4 ° C), um die Zellen zu pelletieren. Wasche einmal mit 10 ml vollständigem RPMI. Pelletieren Sie die Zellen nochmals (250 xg, 10 min, 4 ° C) und resuspendieren in 2 ml des vollständigen RPMI.
   3. Messen Sie die c ell Dichte unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt in vollständigem RPMI bis 0,5 x 10 ⁶ Zellen / ml.
   4. Seed 1 oder 2 ml Aliquots von Zellen in jeder Vertiefung einer 24- oder 6-well Zellkulturplatte, jeweils, und die Kultur der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO _2.
      HINWEIS: 1 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT) kann in diesem Stadium zu jeder Vertiefung gegeben werden, um T-Zell-Überleben zu verbessern.
   5. Optional: Bestätigen Sie die Effizienz des Isolierungsprotokolls mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll normalerweise ergibt ~ 80% T ²³ Lymphozyten.
      HINWEIS: Nylonwolle-gereinigten Zellen enthalten ca. 50% CD4 ⁺ und 23% CD8 ⁺ -Zellen. Zur Reinigung können die CD4 + und CD8 + Subpopulationen weiter eine einzelne immunomagnetischen Abreicherungsschritt werden ²⁴ durchgeführt unter Verwendung von acht Antikörper und magnetischen Kügelchen. Alternativ reineren CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T-Zellpopulationen können durch positive oder negative Selektion mit spezifischen Antikörpern isoliert werden.

1. Aktivieren T - Lymphozyten innerhalb von 24 h von der Isolation durch Zugabe von PMA und Ionomycin Calciumsalz oder magnetische Beads , beschichtet mit anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper ^23,25,26. In experimentellen Medikamente (zB Ciclosporin, FK506, Rapamycin, TRAM-34, und FTY720) zum Zeitpunkt der Aktivierung.
   HINWEIS: Hier variiert PMA Konzentrationen von 2 bis 250 ng / ml und die Konzentration Ionomycin wurde bei 250 nM gehalten. Wenn möglich, Verdünnungen sollten ab Lager Aliquots jeder Droge hergestellt werden, so dass das Volumen jeder Vertiefung Zellen gegeben ≥1 ul ist die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Verhältnis 1 bead-to-cell: Die anti-CD3 / anti-CD28-beschichteten magnetischen Kügelchen werden in einem 1 zugegeben. Erhöhung der Anzahl der Kügelchen pro Zelle (dh der Wulst-zu-Zell - Verhältnis) wird die Intensität der Stimulation ^25,26 erhöhen. Die Kügelchen werden gewaschen und in komplettem RPMI vor ihrer Zugabe zu den Zellen resuspendiert. Man beachte, daß Trypanblau färbt die Perlen.
2. Kultur die Zellen für 12-72 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO ₂ , bevor sie mit der automatisierten Zellzähler zu analysieren.

5. Automatische Zellzähler Datenerfassung

1. Bevor die Probe ausgeführt wird , stellen Sie sicher , dass die Zellen mit einer serologischen Pipette vorsichtig gemischt werden Klumpen zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig für aktivierte Lymphozyten aufgrund ihrer erhöhten Klebrigkeit.
   1. Für Kulturen, die mit anti-CD3 / CD28-Perlen, nach dem Pipettieren aktiviert werden, übertragen Sie die Probe in ein 1,5 ml oder 2 ml Zentrifugenröhrchen. Trennen Sie die Perlen durch auf einem Magneten das Rohr zu halten für 1-2 min. Verwenden Sie den Überstand der Zellen für die Analyse enthält.
      HINWEIS: Analysieren sowohl ruhenden und aktivierten Zellen innerhalb 1 Stunde für jede Voraktivierung der ruhenden Zellen von anwesenden Medium in dem Kulturserum zu berücksichtigen. Nach 12 h PMA / Ionomycin - Stimulation, eine kleine Zunahme in der Zellgröße nachweisbar war (Abbildung 2 ). Bei 72 h, keine signifikante Erhöhung der Zellgröße im Vergleich zu 48 Stunden beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt).
2. 1 ml der Zellsuspension in ein Probengefäß und führen Sie es durch die automatisierte Zellzähler gemäß den Anweisungen im Handbuch.
   HINWEIS: Für jeden der Versuche, ein Minimum von 1 ml (maximal 2 ml) der Zellkultur verwendet werden soll. Die automatisierten Zellzähler verwendet eine Spritze Trypanblau mit der Zellsuspension zu mischen und übergibt die zell Trypanblau Mischung über einen Bereich, der abgebildet wird, und von der Software analysiert. Die Software erkennt Trypanblau gefärbten Zellen, zieht einen Kreis um jede Zelle, und bestimmt den Durchmesser. 100 Bilder werden von jeder Probe gesammelt, und die Lebensfähigkeit der Zellen und Größen bestimmt werden. Die Detektionsschwelle der Zählerzelle verwendet hier eine untere Grenze von 5 & mgr; m.
3. Übertragen von Daten von jedem zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm auszuführen.
4. Kalibrieren Sie das Gerät in regelmäßigen Abständen mit einer 1ml Probe von 6 & mgr; m und 8 & mgr; m Durchmesser Polystyrolkügelchen.
   HINWEIS: Die tatsächlichen Perlengrößen vom Hersteller für jede Charge gemessen werden soll, nicht die Nennweite. 6 und 8 & mgr; m Kügelchen sind praktisch , da diese Durchmesser nahe an den erwarteten Durchmesser von ruhenden und aktivierten T - Zellen (siehe Abbildung 1) sind.

6. Daten und statistische Analyse

1. Analysieren Sie die Daten geeignete statistische und grafische Darstellungen Software.
   HINWEIS: Die Tabelle für jeden Lauf enthält die Anzahl der Zellen, die mit jedem Durchmesser (Bereich: 5 & mgr; m bis 70 & mgr; m). Die Zellen über einem 17 um Durchmesser werden aus der Analyse entfernt Staubpartikel und kleine Bläschen auszuschließen, die als lebende Zellen durch das Instrument gelesen werden kann.
2. Führen Hypothese zu testen Welch-t-Test für Datensätze mit ungleichen Varianz; Ergebnisse sind statistisch signifikant, wenn p <0,001 betrachtet. Die Formel verwendet wurde,
   
   
   woher und Probenmittel, und Abweichungen sind Probe und und sind Stichprobengrößen für jeden Datensatz. Die Anzahl der Freiheitsgrade für jeden Vergleich mit dem kleineren der beiden Probengrößen konservativ geschätzt. Balkendiagramme sind als Mittelwert ± SEM dargestellt.

7. Milz-T-Lymphozyten-Proliferations-Assay

1. Messung der T-Zellproliferation eine MTS- oder MTT-basierten kolorimetrischen Plattenleser Proliferationstest verwendet.
   HINWEIS: Der Test ist Basisd auf MTS Tetrazoliumverbindung (Owen-Reagenz) Reduktion auf löslichen Formazanprodukts, wahrscheinlich durch NADPH oder NADH in metabolisch aktiven Zellen durch Dehydrogenaseenzyme produziert.
2. Zählen gereinigt T - Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren sie in vollständigem RPMI-1640 zu einer endgültigen Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen / ml.
   HINWEIS: 1 mM DTT kann an die Zellen in diesem Stadium zugegeben werden.
3. Aktivieren Sie die Zellen mit PMA und Ionomycin mit Test Drogen zusammen, falls erforderlich, und vorsichtig mischen (ähnlich zu Schritt 4).
4. Platte 100 ul der Zellen in jede Vertiefung einer 96-well Zellkulturplatte behandelt und mit 5% CO ₂ für 48 Stunden bei 37 ° C inkubieren. 100 l RPMI-1640-Medium ohne Zellen in einem gut eine Lesung der Hintergrundabsorption zu erhalten.
5. Geben Sie 20 & mgr; l MTS-Reagens in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 4 Stunden.
6. Nehmen Sie Absorptionsmessungen bei 490 nm einen Plattenleser. die absorbance Messungen entsprechen der Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in jeder Vertiefung.
   HINWEIS: Ziehen Sie den Hintergrundwerten, wenn nötig. Die Hintergrundabsorptionswerte sind abhängig von der Art des Kulturmedium, Serum, externe pH und die Dauer der MTS-Reagens Belichtung. MTS-basierte Reagenzien sind lichtempfindlich, und die Belichtung für mehrere Stunden Licht kann in höheren Hintergrund Absorptionswerte zur Folge haben.

Wir haben diesen Test Lymphozyten Explosion Bildung während der Stimulation mit PMA, einem Phorbolester und Ionomycin, einem Calciumionophor zu vergleichen. Figur 1A zeigt die Häufigkeitsverteilung von Durchmessern von Rast- und pharmakologisch aktivierten Milz - T - Zellen. Die Behandlung von Zellen mit PMA / Ionomycin für ~ 2 Tage führte zu einer deutlichen Verschiebung der Median der Verteilung zu größeren Durchmessern (siehe zum Beispiel Referenz ^4). Die Anzahl von Zellen mit kleineren Durchmessern wurde entsprechend reduziert. Um festzustellen , dass unser Gerät die richtigen Durchmesser berichtet, führten wir zwei Kalibrierungen mit Polystyrolkügelchen von 6 & mgr; m und 8 & mgr; m Durchmesser (siehe Materialien Tabelle). 1B und 1C zeigen Messungen von aktivierten T - Zellen überlagert mit einem 8 & mgr; m - Standard und ruht mit einem 6 & mgr; m - Standard überlagert T - Zellen. Zahl1D zeigt die Größen Kontrollbead vom Hersteller angegeben , gegen die mittlere Durchmesser aufgetragen mit unseren automatisierten Zellzähler gemessen. Es zeigte sich, daß die 6 & mgr; m Grße leicht in unseren Messungen überschätzt wurde, wahrscheinlich aufgrund der Messschwelle des Instrumentes mit einer unteren Grenze von 5 um. Allerdings war die Standardabweichung der Wulstdurchmessern von den Zellenzähler Messungen berechnet in Übereinstimmung mit der Standardabweichung vom Hersteller angegeben. Wir schließen aus diesen Experimenten, daß diese Vorrichtung zuverlässig Rast- und Mitogen-stimulierten Maus-T-Zellgrößen zu vergleichen, verwendet werden kann und dass die Vorrichtung die tatsächliche Zelldurchmesser genau messen kann.

Wir gingen dann auf PMA-Konzentration, die die Abhängigkeit des mittleren Durchmesserzunahme zu testen und festgestellt, dass bei einer festen Ionomycin Konzentration von 250 nM wurde die PMA-Effekt nicht signifikant durch Erhöhen der Konzentration f geändertROM 2 bis 250 ng / ml (Abbildung 2A). Mit dem MTS-basierten Assays, gemessen wir T-Zell - Proliferation bei 50 und 250 ng / ml PMA und fand keinen nennenswerten Unterschied (2C), in Übereinstimmung mit unseren Zelldurchmesser Daten. Die Calcineurin - Inhibitor Arzneimittel Cyclosporin A (300 nm) und FK506 (1 nM) unterdrückt sowohl Blastogenese (2B) und die Proliferation (Figur 2C). Die Hemmung wurde nicht komplett in beiden Fällen jedoch. Messungen durchgeführt 12 h nach der PMA / Ionomycin Zugabe einer 7,2% und 6,8% Zunahme des Durchmessers für 50 ng / ml und 250 ng / ml PMA zeigte, bzw. (2D). Größe erhöht sich bei diesen beiden Konzentrationen waren nicht signifikant unterschiedlich, wie es der Fall für 48 Stunden Stimulation war (vergleiche 2A).

Die Zelldurchmesser von Daten aus ruhenden und aktivierten T-Zellen nach 48 Stunden von PMA / Ionomycin Stimulation gesammelt werden zusammengefasst in Tabelle 1. Die mittlere Oberfläche und Volumen von ruhenden ICR - Maus Milz - T - Zellen wurden 151,4 & mgr; m ² und 1,9 x 10 ^-4 nl, respectively. Die mittlere Oberfläche und Volumen von aktivierten T - Zellen wurden 300,6 & mgr; m ² und 5,9 x 10 ^-4 nl, respectively. Die durchschnittliche Gesamtdurchmesserzunahme für alle aktivierten Zellen war 40,92% (Tabelle 1).

Wir testeten auch andere chemische Verbindungen berichtet immunsuppressiv sein: CsA, FK506, Rapamycin, FTY720 und TRAM-34. In 3 wird in ruhenden und aktivierten T - Zellen in Abwesenheit und Gegenwart dieser Medikamente Zellgrößenmessungen gezeigt werden erhalten. CsA und FK506, die die Calcineurin-abhängigen Kernfaktor von aktivierten T - Zellen (NFAT) ^27,28 Target, waren die wirksamsten, die blastogenen Antwort um nahezu 72% (3A und 3B) verhindert wird . Interessanterweise miterhöht PMA Konzentrationen, sank die Wirksamkeit von CsA und FK506 leicht, obwohl es keine zusätzlichen Zelldurchmesserzunahme in der Abwesenheit dieser Medikamente (2A und 2B) war. Rapamycin, ein Immunsuppressivum , das ^29,30 mammalian target of rapamycin (mTOR) hemmt, hatte eine moderate , aber statistisch signifikante Wirkung (3A, 3B und 3C). FTY720 ist ein Sphingosin - 1-Phosphat - Rezeptor - Agonist, der ³¹ - Lymphozyten - Austritt in den Verkehr hemmt und wurde vor kurzem in T - Lymphozyten ³² zu hemmen TRPM7, einen Kationenkanal stark exprimiert gefunden. Sowohl FTY720 und Rapamycin hatte eine vergleichbare Wirkung auf die Blastogenese, es aus dem Durchschnitt einer 52% Zunahme des Durchmessers auf ungefähr 34% zu reduzieren (3A und 3B). TRAM-34 ist ein Blocker des Kalzium-aktivierten Kaliumkanal KCa3.1 ^33. Getestet bei 700 nM, TRAM-34 war in Maus-T-Zellen unwirksam, in gemäß einer aktuellen menschlichen T-Zellproliferationsstudie; seine Wirksamkeit kann von der Art und Stärke der mitogenen Stimulation ³⁴ (3A und 3B) abhängen. 700 nM TRAM-34 wirksam war in KCa3.1 Kanäle in unserer Patch-Clamp-Elektro Experimente blockiert (Daten nicht gezeigt). Dieser Vergleich wurde zwischen Ruhe- und Drogen-exponierten Zellen in mehreren Studien im selben Experiment bei 48 Stunden hergestellt. Wenn Rapamycin und CsA zusammen verwendet wurden, war Blastogenese vollständig inhibiert (Abbildung 3C).

Aktivierung von Maus - T - Zellen mit anti-CD3 / anti-CD28-beschichteten magnetischen Kügelchen für 72 Stunden erzeugte eine 27% Erhöhung des durchschnittlichen Durchmessers, der bis zu 5% in Gegenwart von CsA (Abbildung 3D) reduziert wurde. Menschliche mononukleäre Zellen auf PMA / Ionomycin-Aktivierung für 48 Stunden erhöht im Durchmesser um 33%, und die Aktivierung in Gegenwart von CsA verringert, um die Reaktion auf 23% ( 4).

Abbildung 1: Häufigkeitsverteilungen von murinen Milz - T-Zellen - Durchmesser. (A) Schwarz Spalten zeigen Ruhe- und roten Säulen zeigen PMA / Ionomycin-aktivierten (48 h) Zellen. (B) Verteilungen von aktivierten T - Zellen der Milz überlagert auf einer 8 & mgr; m Partikelgröße Kalibrierungsstandard. (C) Ausschüttungen eines 6 um Kalibrierungsstandard überlagert ruhenden T - Zellen. Die Zahl der Zellen und Kügelchen verwendet werden in Boxen angezeigt. (D) Mediandurchmesser durch den Zellenzähler gemessen aufgetragen gegen den Wulstdurchmesser vom Hersteller angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Abhängigkeit der murine T-Zell - Aktivierung auf PMA - Konzentration. (A) mittleren Durchmessern von T - Zellen entweder unbehandelt oder behandelt mit 2, 50 und 250 ng / ml PMA zu einem festen Ionomycin Konzentration (250 nM). (B) Zellzähler Messungen von ruhenden und aktivierten (2, 50, 250 ng / ml PMA) T - Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von 300 nM CsA oder 1 nM FK506. (C) MTS - Proliferationstest bei 50 und 250 ng / ml PMA mit 250 nM Ionomycin in Abwesenheit und Gegenwart von 300 nM CsA. Signifikante Unterschiede (p <0,001) werden mit einem Sternchen gekennzeichnet. n ist die Gesamtzahl der Prüfungen. Daten sind aus Zellen isoliert aus 3 Mäusen. (D) Zelldurchmesser von ruhenden und aktivierten T - Zellen (250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin) 12 Stunden nach der Aktivierung in der Abwesenheit und Anwesenheit von 300 nM CsA. pload / 55212 / 55212fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Wirkungen von CsA, FK506, FTY720, Rapamycin und TRAM-34 auf die Zellgröße. (A und C) mittlere Durchmesser von Rast- und PMA / Ionomycin-aktivierten murinen T - Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von Drogen. Die Konzentrationen werden in der Box gezeigt. (B) Daten von A ausgedrückt als die prozentuale Steigerung gegenüber dem ruhenden T-Zellen - Durchmesser. Lymphozyten-Aktivierung wurde mit 250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin durchgeführt, und die Messungen wurden nach 48 Stunden entnommen. (D) Zellzähler Messungen der Rast- und anti-CD3 / CD28-aktivierten T - Zellen, 72 Stunden nach der Aktivierung in der Abwesenheit und Anwesenheit von 300 nM CsA.rge.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Blastogenese in humanen PBMCs auf Mitogenstimulation. (A) Schwarz Spalten zeigen Ruhe- und roten Säulen zeigen aktivierte PBMCs. (B) mittlere Durchmesser von ruhenden und aktivierten PBMCs in Abwesenheit und Gegenwart von 300 nM CsA. Zellen wurden mit 250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin aktiviert, und die Messungen wurden nach 48 Stunden der Aktivierung genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1: Zusammenfassung der mittleren Zelldurchmesser und der relativen Zunahme der Oberfläche. Die Messungen wurden mit 250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin 48 Stunden nach der Aktivierung durchgeführt.

Hier beschreiben wir eine Technik zum schnellen Nachweis und zur Quantifizierung von T-Zell-blastogenen Transformation eines automatisierten Zellzähler verwendet wird. Unter unseren Bedingungen (250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin-Stimulation) wurde die Zellfläche zweifach und das Volumen dreifache nach 48 Stunden der Aktivierung erhöht. Der Test ist ausreichend sensitiv Strahlen während der ersten 12 Stunden der Aktivierung zu erkennen, wo das Zellenvolumen 1,25-fache im Vergleich zu ruhenden (2D) nur erhöht. Eine physiologisch relevanten Mechanismus der T-Zell - Aktivierung mit Anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen eine signifikante blastogenen Reaktion mit durchschnittlich 2,3-fachen Anstieg im Volumen (72 h nach der Aktivierung, Figur 3D). Menschliche mononukleäre Zellen zeigten eine 2,6-fache Volumenänderung auf PMA / Ionomycin - Stimulation für 48 Stunden (Abbildung 4). Die ICR-Maus Milz-T-Zellen mittleren Durchmesser und Volumen bestimmt werden6,9 & mgr; m und 1,9 x 10 ^-4 nl, respectively. Menschlichen PBMCs (von einem gesunden Spender) hatten einen mittleren Durchmesser von 7,7 um und ein durchschnittliches Volumen von 2,7 x 10 ^-4 nl. Unter Verwendung dieses Protokolls, testeten wir auch Konzentrationen von PMA auf ihre Fähigkeit hin zunehmende T-Zellen zu aktivieren. Diese Single-Cell-Ergebnisse waren konsistent mit Proliferationsassays bei ähnlichen PMA-Konzentrationen durchgeführt.

Mehrere Verbindungen wurden zu beeinflussen Zellproliferation berichtet getestet: FTY720 ^31,32; die Immunsuppressiva Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin ^27,28; und TRAM-34, ein Blocker des Kalzium-aktivierten KCa3.1 Kanäle ^33,35. Wir fanden heraus, dass bei den getesteten Konzentrationen, die potentesten Inhibitoren der Blastogenese waren CsA und FK506. Rapamycin hatte eine kleinere, aber statistisch signifikante unterdrückende Wirkung auf blastogenesis. TRAM-34, auf der anderen Seite, hatte keinen Einfluss auf blastogenesis.

CsA unterdrückt sowohl blastogenesis und proliferation, aber nicht vollständig (2B und 2C), dass die automatisierte Zellzähler Messung demonstriert ist eine gute Korrelat der Arzneimitteleffizienz in T-Zell - Proliferation. In Gegenwart von Rapamycin mit CsA wurde Blastogenese vollständig gehemmt, was darauf hindeutet , dass NFAT- und mTOR-vermittelte Wege in Kombination vollständig für die Erweiterung T-Zelle auf mitogene Stimulation mit PMA / Ionomycin (3C) erklären kann.

Der Dynamikbereich von einigen Proliferationsassays ist begrenzt (siehe Abbildung 2). Proliferationsassays, wie das, was wir (2C) verwendet haben, berichten von einem Signal , das Beiträge von apoptotischen und nekrotischen Zellen enthält. Automatisierte Durchmesser Änderungsmessungen haben nicht diese Beschränkung, da die Messungen an lebenden Zellen beziehen sich nur. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch den Ausschluss von Trypanblau-Färbung von gesunden, lebenden Zellen untersucht. In Größenmessungen, mit nach vornLichtstreuung in der Durchflusszytometrie Diskriminierung Dublette Zelle kann ²² problematisch sein. Bei der automatisierten Zellzähler Messungen wurde keine Dublette Population gefunden (Abbildung 1). Außerdem war die Messung hinreichend genau zwischen den Wirkungen von 100 und 200 nM Cyclosporin (Tabelle 1) und zur Erkennung Blastogenese innerhalb von 12 h von mitogener Stimulation (2D) zu unterscheiden.

Dieser neue Test ist besonders nützlich für eine kleine Anzahl von Proben. Bis zu 15 Proben in 1 Stunde gemessen werden. Jedoch hat der Test seine Grenzen, von denen die meisten gemildert werden kann. Auch wenn es effektiv klein (<1 & mgr; m) Unterschied in der Zelldurchmesser lösen können, wir das Maschinenmodell verwendet wird, hat eine untere Nachweisgrenze von 5 um. Diese Grenze kann die Überschätzung von sehr kleinen Zellgrößen verursachen, da es effektiv alle Zellen mit kleinerem Durchmesser ausschließt. Doch neuere Modelle der Zellzähler haben Erkennung dreschenolds von ~ 2 um, die dieses Problem lindern soll. Wenn es in der Probe zu viel Schmutz ist, behandelt das Instrument sie als lebensfähige Zellen. Darüber hinaus können Luftblasen erhalten gelegentlich in die Flußzelle und verursachen eine Verzerrung der Zellbildern von der Maschine erfasst. Die Verzerrung scheint nicht die Lebensfähigkeit zu beeinflussen, aber es kann die gemessenen Durchmesser beeinflussen. Daher wird empfohlen, dass alle Bilder vom Experimentator für Luftblasen überprüft werden, bevor die Daten aus jeder Studie zur Analyse angenommen. Da nur die Software Kreise um die Zellen zieht, Durchmesser von nicht kugelförmigen Zellen können in Richtung der Längsachse versetzt sein, so dass der Test weniger geeignet für nicht-sphärische Zellen.

Dieser Test ist schnell, ca. 4 min pro Probe nehmen, im Vergleich zu Proliferationsassays, die ein paar Stunden benötigen. Die Datenerfassung ist auch ziemlich einfach, die Software mit dem Gerät enthalten werden. Die Software kann Messdaten zu einem sp exportierenreadsheet für die Analyse. Schließlich ist es eine Einzelzelle, als eine Population, die Messung gegenüberliegt; sowohl Blastogenese und Proliferation gemessen werden; und es unterscheidet zwischen lebensfähigen und toten Zellen gleichzeitig. Es kann eine Immunantwort zu verwendet werden, um verschiedene Mausstämme für ihre Fähigkeit zu bewerten. Der Assay kann auch erfolgreich für die Messung der Blastogenese in T - Zellen aus menschlichen Spendern (Abbildung 4), und es kann auch in anderen Zelltypen verwendet werden , verwendet werden.

Zellvolumen erhöht sich bekannt sind für die Regulierung des Metabolismus beitragen: Zellschwellung stimuliert die Synthese und Lipogenese in ^36,37 Hepatozyten Glutamin-induzierte Glykogen. Neutrophile zeigen Migration assoziierte Volumensteigerungen von 35 bis 60%, während die chemotaktische Mittel 10-15% Schwellung ^38-40 induzieren. Der aktuelle Assay kann möglicherweise diese Prozesse zu untersuchen verwendet werden.

The authors have no competing financial interests.

We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.