الكمي السريع لمأرمي يسببها Mitogen في اللمفاويات التائية لتحديد الأدوية المناعية

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

انتشار الخلايا اللمفاوية ردا على الأنتيجين أو التحفيز مولد للتفتل ظاهرة قابلة للقياس بسهولة مفيدة لاختبار المناعية (أي مناعة أو يمونوستيمولاتوري) المركبات الكيميائية والبيولوجية. واحدة من أولى الخطوات خلال mitogenesis هو توسيع الخلية أو التحول مأرمي المنشأ، وعندها يزداد حجم الخلايا قبل التقسيم. وهي عادة ما تكون كشفها في عدة ساعات الأولى من التحفيز الخلايا اللمفاوية التائية. هنا، نحن تصف طريقة سريعة لتحديد مأرمي في الخلايا اللمفية تي المعزولة من الطحال الماوس وهامشية خلايا الدم وحيدات النوى الإنسان (PBMCs) باستخدام عداد الخلية الآلي. مختلف المقايسات انتشار شائعة الاستخدام بالنسبة للجزء الأكبر هي شاقة وتعكس سوى تأثير إجمالي عدد السكان بدلا من الآثار الخلوية الفردية بين السكان. في المقابل، يقدم عرض آلية فحص خلية مكافحة قياسات سريعة ومباشرة، ودقيقة من أقطار الخلية التي يمكن أن تكونتستخدم لتقييم فعالية مختلف mitogens والأدوية المناعية في المختبر.

اللمفاويات التائية هي الخلايا الأولية المسؤولة عن المناعة التكيفية في الثدييات. ومن المعروف أن تستجيب لالببتيدات المستضدات محددة قدمها جزيئات MHC على سطح الخلايا المقدمة للمستضد. على تفعيل مستقبلات الخلايا التائية وما شابه ذلك (TCR)، الخلية يوسع في عملية تسمى التحول مأرمي المنشأ، أو مأرمي. هذه العملية هي التي يمكن اكتشافها في أول ~ 6 ساعات بعد تطبيق التحفيز ^1. خلال مأرمي، وحجم خلايا T الفردية زيادة 2- 4 أضعاف ^2-6. الخلايا الليمفاوية تبدأ في الانتشار في عملية تسمى التوسع نسيلي، والغرض منه هو توليد أكبر عدد ممكن من الحيوانات المستنسخة من TCR الحاملة للخلايا مستضد معين ممكن. الخلايا ذرية ثم تمارس وظيفتها المناعية عن طريق التفريق في السامة للخلايا (CD8 ⁺⁾ أو المساعد (CD4 ⁺⁾ المستجيب الخلايا اللمفية تي. وهكذا، الخلايا اللمفية تي ساذجة في الدم البشري أو الماوس هي في مرحلة G ₀ (يستريح) للخليةدورة والحد الأدنى من الدعم النشاط الأيضي. عند التعرض لمستضدات أو mitogens، وخلايا T إعادة إدخال دورة الخلية، مع ما يصاحب ذلك من التحفيز النسخ وتخليق البروتين ^7-10. Mitogens، مثل phorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وionomycin تحفيز الخلايا الليمفاوية من خلال تفعيل بروتين كيناز C (بي كي سي) والكالسيوم ²⁺ إشارة معتمد على مسارات ^1. تنشيط خلايا T مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin يتجاوز الخطوات يشير TCR.

في انتشار المختبر وتستخدم على نطاق واسع المقايسات لغرض تقييم وظيفة الخلايا اللمفاوية والاستجابة للمؤثرات. تؤخذ قراءات انتشار عادة بعد 1-3 أيام من بدء التحفيز خلايا T وتعكس حالة جماعية لمئات أو آلاف من الخلايا. قوة من مختلف mitogens والأدوية المناعية في المختبر يمكن تقييمها ببساطة عن طريق قياس معدلات انتشار في وجود هذه المركبات. بعض من هذه لوتناقش ssays وحدودها أدناه.

لالمباشر عد عدد الخلايا، وإجراء يستغرق وقتا طويلا، مع احتمال كبير لأخطاء المشغل.

لتخليق الحمض النووي، إدراج فحص-3H الثيميدين يقيس الحمض النووي، ولكن القيد الرئيسي هو الإشعاعية لها. وثمة بديل غير المشعة هو BrdU، ولكن مجموعة من استجابة خطية لنمو الخلايا غير محدود، ومطلوب علاج الأجسام المضادة، مما يزيد من عدد من الخطوات في الإجراء ^11،12.

للالنشاط الأيضي، وأملاح نتروبلو (الإنتقالي العسكري، MTS، XTT، وWST-1) وريسازورين المقايسات اللونية القائمة على صبغ تقرير الدولة الأيض العامة للتقسيم السكان الخلية. ومع ذلك، الإنتقالي العسكري يست قابلة للذوبان في مستنبت، والتي تتطلب خطوات غسل إضافية، وبالتالي دمج الأخطاء في القياس؛ XTT تحتاج مكونات إضافية للحد من كفاءة؛ MTS-، WST-1-، والقياسات ريسازورين هي تؤثرإد من درجة الحموضة مستنبت ومكوناتها مصل، الزلال أو الفينول الأحمر ^13-16. هذه المقايسات لا تقيس العدد الفعلي للخلايا قابلة للحياة، بل تقدير الأنشطة الإنزيمية مجتمعة. ولذلك، فإن معدل الانتشار النووي قد لا يتم تحديدها بدقة عن طريق فحوصات الأيض بسبب علاقة غير خطية بين عدد الخلايا والحد من صبغ ^12،17.

لقياس تركيز ATP، تي خلية الزيادات الناجمة عن التنشيط في ATP ترتبط مع انتشار. ومع ذلك، والارتفاع للاعبي التنس المحترفين داخل الخلايا هي واحدة من الخطوات الأولى لتفعيل الخلايا التائية. العديد من الخطوات وراء انتشار الفعلي ^17،18.

لصبغ تخفيف الفحص، CFSE صبغة الفلورسنت بقع الخلايا عن طريق ملزمة تساهميا إلى البروتينات داخل الخلايا. يظهر الصبغة انخفاض تعتمد على الانتشار في كثافة الفلورسنت، والتي يمكن تتبع عدد من انقسامات الخلية. ومع ذلك، بسبب التساهمية البروتين وضع العلامات، وظائف هذهالبروتينات يمكن أن يتعرض للخطر. صبغة غير سامة للخلايا في تركيزات أعلى. بتركيزات صبغ أقل، ومع ذلك، يتم تقليل كثافة مضان الأولية، وخفض عدد من الانقسامات الخلوية التي يمكن تتبعها. بالإضافة إلى ذلك، بعد وضع العلامات مع CFSE، هناك خسارة 50٪ الانتشار مستقلة ~ مضان الأولي خلال الفترة الأولى 24-48 ساعة، الأمر الذي يحد من مجموعة ديناميكية من هذا الاختبار ^19،20.

معظم هذه المقايسات تعكس الحالة الجماعية أعداد كبيرة من الخلايا وتتطلب علاج الخلايا مع الأصباغ الفلورية. قد تساهم الخلايا الميتة وأفكارك أيضا إلى هذه القياسات، ما لم تتم إزالتها من التحليل من قبل تلطيخ مع المواد الكيميائية أو الأجسام المضادة.

اللمفاويات مأرمي يمكن تقييمها من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل المجهر الضوئي أو قياس التدفق الخلوي ^4،21،22. هنا، نحن تصف طريقة سريعة لقياس أحجام تي خلية باستخدامن الآلي مكافحة الخلايا، الذي يجمع الصور خلية في الوقت الحقيقي التي يتم تخزينها ويمكن إعادة تحليلها في وقت لاحق. بالإضافة إلى قياسات حجم هذا الجهاز يوفر أعداد الخلايا دقيقة والنسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة، على النحو الذي يحدده التريبان الاستبعاد وصمة عار الأزرق. الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول متاح تجاريا، والشركة المصنعة اختبار دقة الصك استخدام ثلاث أدوات مختلفة والعديد من الضوابط التركيز وقدرتها على البقاء. أظهرت نتائج هذه الدراسات وجود معامل التباين التي كانت عموما أقل من 6٪. كما لوحظ في البروتوكول، يتم معايرة الجهاز على أساس منتظم مع 6 ميكرون و 8 ميكرومتر الخرز البوليسترين قطر. مزايا استخدام عداد خلية للتمييز بين الخلايا التائية يستريح والابيضاض اللمفاوي T على أساس قطر الخلية هي سهولة الاستخدام وطبيعة الآلية لإدارة التحليل. البرنامج قادر على رسم دائرة حول كل خلية وحساب قطر الخلية. بالإضافة إلى ذلك، ايمالأعمار واضحة للمشغل الذي يمكن التحقق من دقة الصك في تحديد الخلايا وبشكل صحيح رسم دائرة من حولهم. من حيث القيود، وأداة يست في حد ذاتها يمكن التفريق بين الحطام والخلايا. وبالتالي، فمن المهم أن المشغل يرى كل صورة كما يتم معالجتها. هناك إمكانية لدمج فقاعات الهواء، والذي سيقلل من عدد من المجالات التي يمكن استخدامها في التحليل؛ ولكن هذا أمر نادر الحدوث إذا أجري الصيانة التنظيف العادية.

في هذه الدراسة، تم تحفيز مجموعات من الخلايا اللمفية تي الطحال مع ionomycin وزيادة تركيزات سلطة النقد الفلسطينية ل12-48 ساعة. تركيزات سلطة النقد الفلسطينية منخفضة تصل إلى 2 نانوغرام / مل يسببها كلا استجابة مأرمي المنشأ قوية وانتشار كبير. قياسات آثار العديد من الأدوية، مثل مثبطات المناعة السيكلوسبورين ألف (CSA)، FK506 (تاكروليماس)، وrapamycin (sirolimus و)، وكذلك حاصرات قناة أيون الترام-34 و FTY720 (fingoliوزارة الدفاع)، ويتجلى في مأرمي اتفاق جيد مع الآثار تقريرا عن انتشار الأسلحة النووية. كما تم قياس استجابة مأرمي المنشأ من PBMCs الإنسان لسلطة النقد الفلسطينية / ionomycin والفئران تحفيز خلايا T مع anti-CD3 ومكافحة CD28 الخرز المغناطيسي المغلفة الأضداد.

فحص خلية مكافحة يقيس كلا مأرمي ومعدل انتشار (كثافة الخلية) في وقت واحد ولكن بشكل منفصل، على عكس الطرق المذكورة أعلاه، والتي تبدو في مزيج من هذه الآثار. وينص بروتوكول المعروضة تقنية سريعة وقوية لتقييم فعالية وكلاء مولد للتفتل والمناعية.

يتم تنفيذ جميع التجارب وفقا للبروتوكولات التي وافق عليها مجلس الجامعة مختبر رعاية الحيوان واستخدام اللجنة والمراجعة المؤسسية رايت الدولة.

ملاحظة: يتم عزل PBMCs الإنسان من قبل Ficoll التدرج الكثافة طريقة الطرد المركزي ^5.

1. الطحال الحصاد

1. بيت الكبار الفئران النواب الإناث في ظروف المختبر القياسية مع الغذاء والماء ومتطلبات محددة الفراش لهذه الأنواع.
   كانت الحيوانات ومتوسط ​​أعمارهم 2.9 أشهر ويبلغ وزنه المتوسط ​​من 30.4 غرام في وقت القتل الرحيم: ملاحظة.
2. في تاريخ العزلة (دوى)، الموت ببطء الحيوانات بشكل فردي دون الحيوانات مناوع الأخرى الموجودة. بذل كل الجهود لضمان الحد الأدنى من الضغط على الماوس. الموت ببطء باستخدام ثاني أكسيد الكربون ₂ مع خلع عنق الرحم الثانوي لضمان الموت.
   1. وضع الحيوان، لا يزال داخل قفص نقل، في غرفة CO ₂ وستاRT تدفق الغاز بمعدل 5 لتر / دقيقة. هذا معدل التدفق على الأوكسجين في الموصى بها 10-30٪ لكل دقيقة.
   2. بعد هذا الحيوان هو فاقد الوعي، وزيادة معدل تدفق CO _2-15 لتر / دقيقة. تحقق الحيوان لوقف التنفس وترك في الغرفة لمدة 2 دقيقة إضافية.
   3. تطبيق خلع عنق الرحم مع قوة الهاء لضمان الموت.
3. حصاد الطحال من الحيوانات باستخدام تقنية العقيم في غضون 10 دقيقة من الموت.
   1. تعقيم مجموعتين من مقص وملقط لإزالة الطحال في الأوتوكلاف مسبق فرن للاستخدام. تعقيم سطح تشريح عن طريق تطبيق 70٪ من الإيثانول.
   2. تطبيق 70٪ من الإيثانول في البطن الماوس. باستخدام مجموعة واحدة من مقص وملقط، اجراء خفض في الفراء والجلد من الجانب الأيسر من البطن، ثم مزق وقشر العودة الجلد للكشف عن الصفاق. تعرض مرة واحدة، وتطبيق 4٪ محلول الكلورهيكسيدين قبل فتح الغشاء البريتوني.
   3. باستخدام مجموعة ثانية من الخيال العلميssors وملقط، وجعل قطع 2- 3 سم على طول البطن المركزي. فتح الغشاء البريتوني وإزالة الطحال عن طريق خفض بعيدا إرفاق ملفات الحشوية والدهون الزائدة. وضع الطحال في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS).

2. إعداد Splenocytes الخام

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات في إطار مجلس الوزراء رقائقي تدفق السلامة الأحيائية باستخدام تقنية العقيم.

1. نقع الطحال تحصد في 10 مل من منزوع الأيونات H العقيمة O ₂ لمدة 5 دقائق في طبق ثقافة 10 سم إلى ليز كريات الدم الحمراء السطح.
   ملاحظة: هذه الخطوة يمكن حذفها اذا تعرض لاضرار الطحال أثناء العزلة.
2. الإفراج عن splenocytes، سحق الطحال بين شريحتين من الزجاج المعقم (الجانب متجمد التي تواجه الطحال) على طبق ثقافة 10 سم جديدة. خلط مع 10 مل من RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مم L-الجلوتامين، 50 وحدة دولية / مل البنسلين، و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (أقل من أشار إلىالصورة استكمال RPMI).
3. تصفية الخلايا من خلال العقيمة 40 ميكرون خلية النايلون مصفاة في طبق جديد ثقافة 10 سم لإزالة الأنسجة الضامة والحطام.
4. ليز كريات الدم الحمراء المتبقية بإضافة 20 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء تتكون من 155 ملي NH ₄ CL، 10 ملم NaHCO _3، و 0.1 ملي EDTA في درجة الحموضة 7.4 و ~ 300 ملي أوزمول / L.
   يتم قياس الأسمولية من نقطة التجمد أو مقياس التناضح ضغط البخار: ملاحظة.
   1. نقل الخلايا من لوحة 10 سم إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 250 x ج لمدة 10 دقيقة (4 درجة مئوية).
   2. إزالة طاف، إضافة 20 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء، وإعادة تعليق الخلايا مكعبات من قبل pipetting.
   3. يحضن في درجة حرارة الغرفة في تحلل العازلة لمدة 10 دقيقة مع هزاز لطيف.
   4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 250 x ج (4 درجة مئوية) لتكوير الخلايا. تخلصي من تحلل العازلة.
   5. اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من كامل RPMI وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى (250 x ج، 10 دقيقة، 4 درجات مئوية). القرصايه ار دى طاف.
5. إعادة تعليق splenocytes في 2 مل من كامل RPMI تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة نقل إلى العمود النايلون ألياف الصوف.

3. تنقية الخلايا اللمفاوية T

1. غسل الأعمدة الصوف النايلون مرتين مع 5 مل من كامل RPMI. احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ خلية حاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة.
   ملاحظة: من الضروري للحفاظ على الصوف النايلون الرطب لمدة التجربة واستخدام كامل RPMI تحسنت إلى 37 درجة مئوية لجميع الخطوات عزل الصوف النايلون.
2. إضافة splenocytes معزولة إلى العمود واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح للخلايا B، الخلايا الليفية، وخلايا ملحق التمسك الصوف النايلون.
   1. إضافة 2 مل من RPMI تحتوي على splenocytes في العمود ويمر عبر حتى يتم الوصول إلى أعلى من الصوف النايلون.
   2. إضافة 2 مل من كامل RPMI تحسنت إلى 37 درجة مئوية على الجزء العلوي من الصوف والنايلون وتمرير المتوسطة من خلال الصوفحتى يصل إلى مستوى السائل على السطح العلوي.
   3. إضافة 3 مل من RPMI الكامل الحار العمود لتغطية كامل الصوف النايلون.
   4. احتضان العمود تحميل دون عائق في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ خلية حاضنة الثقافة لمدة 1 ساعة.
3. أزل الخلايا عن طريق غسل العمود مرتين مع 5 مل من كامل RPMI. إجراء غسل إضافية للخلايا مزال بواسطة الطرد المركزي.
   1. ملء العمود إلى الأعلى 2 مرات مع كامل RPMI والسماح الحل في العمود إلى تتدفق من خلال إلى 50 مل أنبوب مخروطي العقيمة.
      ملاحظة: تجنب التنصت أو الاهتزاز العمود، والتي يمكن إزاحة الخلايا البائية والخلايا الإكسسوارات، والخلايا الليفية والتمسك الصوف النايلون.
   2. جمع جزء التدفق من خلال وتدور في 250 x ج لمدة 10 دقيقة (4 درجة مئوية) لخلايا بيليه. يغسل مرة واحدة مع 10 مل من كامل RPMI. بيليه الخلايا مرة أخرى (250 x ج، 10 دقيقة، 4 درجات مئوية) وإعادة تعليق في 2 مل من كامل RPMI.
   3. قياس ج الذراع الكثافة باستخدام عدادة الكريات وتمييع في كامل RPMI إلى 0.5 × 10 ⁶ خلية / مل.
   4. البذور 1 أو 2 مل aliquots من الخلايا في كل بئر من لوحة الثقافة خلية 24- أو 6 جيدا، على التوالي، والثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
      ملاحظة: 1 ملم 1،4-dithiothreitol (DTT) ويمكن أن يضاف إلى كل بئر في هذه المرحلة لتحسين بقاء خلايا تي.
   5. اختياري: تأكيد كفاءة بروتوكول العزلة التي التدفق الخلوي. هذا البروتوكول ينتج عادة ~ 80٪ الخلايا اللمفية تي ^23.
      ملاحظة: نايلون الخلايا تنقيته من الصوف تحتوي على ما يقرب من 50٪ CD4 ⁺ و 23٪ CD8 ⁺ الخلايا. لتنقية CD4 + و CD8 + القطعان أبعد من ذلك، خطوة نضوب immunomagnetic واحدة لا يمكن أن يؤديها باستخدام ثمانية الأجسام المضادة وحبات مغناطيسية ^24. بدلا من ذلك، أنقى CD4 ⁺ و CD8 ⁺ السكان تي خلية يمكن أن تكون معزولة عن طريق الانتقاء إيجابية أو سلبية مع الاجسام المضادة المحددة.

1. تنشيط الخلايا اللمفية تي في غضون 24 ساعة من العزلة من خلال إضافة سلطة النقد الفلسطينية وionomycin ملح الكالسيوم أو حبات مغناطيسية المغلفة مع مكافحة CD3 وCD28 مكافحة الأجسام المضادة ^23،25،26. إضافة الأدوية التجريبية (على سبيل المثال، وكالة الفضاء الكندية، FK506، rapamycin، الترام-34، وFTY720) في وقت التنشيط.
   ملاحظة: هنا، تراوحت تركيزات سلطة النقد الفلسطينية 2-250 نانوغرام / مل، وأبقى تركيز ionomycin في 250 نانومتر. إذا كان ذلك ممكنا، ينبغي إعداد التخفيفات من قسامات الأسهم من كل دواء ذلك أن حجم تضاف إلى كل بئر من الخلايا ≥1 ميكرولتر لضمان التكاثر. تضاف حبات مغناطيسية لمكافحة CD3 / المغلفة مكافحة CD28-في نسبة 1: 1 حبة الى خلية. وزيادة عدد حبات لكل خلية (أي نسبة حبة الى خلية) زيادة كثافة التحفيز ^25،26. تغسل حبات وإعادة علقت في كامل RPMI قبل بالإضافة لخلايا. لاحظ أن التريبانالأزرق البقع الخرز.
2. ثقافة الخلايا لمدة 12-72 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ قبل تحليل مع العداد خلية الآلي.

5. الآلي خلية جمع البيانات عداد

1. قبل تشغيل العينة، تأكد من أن الخلايا يتم خلط بلطف مع ماصة المصلية لتجنب كتل. هذا مهم بشكل خاص لالخلايا اللمفية تفعيلها بسبب زيادة الإلتصاق بهم.
   1. للثقافات التي يتم تفعيلها مع حبات مكافحة CD3 / CD28، بعد pipetting ل، ونقل العينة إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل أو 2 مل. فصل حبات عن طريق الحفاظ على أنبوب على المغناطيس لمدة 1-2 دقيقة. استخدام طاف تحتوي الخلايا لتحليلها.
      ملاحظة: تحليل كل من الخلايا يستريح وتفعيلها داخل 1 ساعة لحساب أي قبل تفعيل الخلايا يستريح من المصل الحالي في مستنبت. بعد 12 ساعة من سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin التحفيز، وكانت زيادة طفيفة في حجم الخلية اكتشافها (الشكل 2 ). في 72 ساعة، أي زيادة كبيرة حجم الخلية مقارنة وحظ 48 ساعة (لا تظهر البيانات).
2. نقل 1 مل من تعليق خلية في فنجان العينة وتشغيله من خلال مكافحة خلية الآلي وفقا للتعليمات الواردة في الدليل.
   ملاحظة: للحصول على كل من المحاكمات، يجب استخدام ما لا يقل عن 1 مل (بحد أقصى 2 مل) من زراعة الخلايا. تستخدم العداد خلية الآلي حقنة لخلط الأزرق التريبان مع تعليق الخلية ويمر الخليط الأزرق خلايا التريبان على الحقل الذي يتم تصويره وتحليلها من قبل البرنامج. البرنامج بالكشف عن الخلايا الملون الأزرق التريبان، يرسم دائرة حول كل خلية، ويحدد قطر. يتم جمع 100 صورة من كل عينة، وبقاء الخلية ويتم تحديد الأحجام. عتبة الكشف عن مكافحة الخلايا المستخدمة هنا لديه الحد الأدنى من 5 ميكرون.
3. نقل البيانات من كل تشغيل للجدول لمزيد من التحليل.
4. معايرة الجهاز على أساس منتظم باستخدام 1عينة مل من 6 ميكرون و 8 ميكرومتر الخرز البوليسترين قطر.
   ملاحظة: أحجام حبة الفعلية قياسها من قبل الشركة المصنعة لكل دفعة ينبغي أن تستخدم، وليس حجم الاسمي. 6 و 8 ميكرون الخرز أكثر ملاءمة لهذه الأقطار قريبة من أقطار المتوقع من الراحة وتنشيط خلايا تي (انظر الشكل 1).

6. البيانات والتحليل الإحصائي

1. تحليل البيانات باستخدام البرامج الإحصائية والرسوم البيانية المناسب.
   ملاحظة: جدول لكل شوط يحتوي على عدد من الخلايا مع بعضها قطر (المدى: 5 ميكرون إلى 70 ميكرون). تتم إزالة الخلايا فوق قطرها 17 ميكرومتر من تحليل لاستبعاد جزيئات الغبار وفقاعات صغيرة، والتي يمكن قراءتها خلايا قابلة للحياة كما في الصك.
2. أداء فرضية اختبار باستخدام اختبار (ت) ولش لمجموعات البيانات مع تباين غير المتكافئ. وتعتبر النتائج ذات دلالة إحصائية إذا ع <0.001. وكانت الصيغة المستخدمة،
   
   
   أين و هي وسائل العينة، و هي الفروق عينة، و و أحجام عينة لكل مجموعة البيانات. ويقدر عدد درجات الحرية متحفظ باستخدام أصغر من اثنين من أحجام العينات لكل المقارنة. يتم عرض الرسوم البيانية كما يعني ± SEM.

7. الطحال الخلايا اللمفاوية التائية انتشار الفحص

1. قياس انتشار الخلايا التائية باستخدام MTS- أو القائم على الإنتقالي العسكري لوحة اللونية القارئ انتشار الفحص.
   ملاحظة: إن الاختبار هو قاعدةد على MTS مجمع نتروبلو (كاشف أوين) تخفيض على منتج formazan القابلة للذوبان، الأرجح عن طريق NADPH أو NADH إنتاجها في خلايا نشطة عملية الأيض عن طريق الانزيمات نازعة.
2. عد الخلايا T المنقى مع عدادة الكريات وإعادة تعليق عليها في كامل RPMI-1640 في مناطق ذات كثافة النهائية من 1 × 10 ⁶ خلية / مل.
   ملاحظة: 1 ملم DTT يمكن أن تضاف إلى الخلايا في هذه المرحلة.
3. تنشيط الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية وionomycin جنبا إلى جنب مع العقاقير اختبار، إذا لزم الأمر، وتخلط بلطف (على غرار الخطوة 4).
4. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من 96-جيدا ثقافة خلية لوحة المعالجة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام RPMI-1640 دون الخلايا في بئر واحدة للحصول على قراءة الامتصاصية الخلفية.
5. إضافة 20 ميكرولتر من كاشف أساس MTS-إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 4 ساعة.
6. أخذ قياسات الامتصاصية في 490 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. ولقياسات bsorbance تتوافق مع عدد الخلايا النشطة في عملية الأيض في كل بئر.
   ملاحظة: طرح مستويات الخلفية إذا لزم الأمر. تعتمد القيم الامتصاصية الخلفية على نوع من مستنبت، المصل، ودرجة الحموضة الخارجية، ومدة التعرض كاشف MTS للضوء. الكواشف أساس MTS-هي حساسة للضوء، والتعرض للضوء لعدة ساعات قد يؤدي إلى ارتفاع قيم الامتصاصية الخلفية.

استخدمنا هذا الاختبار لمقارنة تشكيل انفجار الخلايا اللمفاوية خلال التحفيز مع سلطة النقد الفلسطينية، استر phorbol، وionomycin، وهو حامل الأيون الكالسيوم. ويبين الشكل 1A توزيع تردد من أقطار من الراحة وتنشيط خلايا الطحال دواء تي. أسفرت علاج الخلايا مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin ل~ 2 أيام في تحول كبير في متوسط توزيع نحو بأقطار أكبر (انظر، على سبيل المثال المرجع ^4). وتبعا لذلك انخفض عدد الخلايا مع أقطار أصغر. من أجل التأكد من أن الجهاز لدينا أفاد أقطار الصحيحة، أجرينا اثنين المعايرة مع الخرز البوليسترين من 6 ميكرون و 8 ميكرون بأقطار (انظر المواد الجدول). الأرقام 1B والقراءات تظهر 1C من تنشيط خلايا تي فرضه مع 8 ميكرون خلايا T القياسية ويستريح فرضه مع مستوى 6 ميكرون. الشكليظهر 1D أحجام السيطرة حبة ذكرت من قبل الشركة المصنعة تآمر ضد أقطار متوسط قياس مع شركائنا في مكافحة خلية الآلي. ويبدو أن حجم 6 ميكرون وقد بالغت قليلا في قياساتنا، وربما يرجع ذلك إلى عتبة قياس الصك وجود الحد الأدنى من 5 ميكرون. ومع ذلك، كان الانحراف المعياري للأقطار حبة المحسوبة من القياسات خلية مكافحة بالاتفاق مع الانحراف المعياري ذكرت من قبل الشركة المصنعة. نستنتج من هذه التجارب أن هذا الجهاز يمكن أن تستخدم بشكل موثوق لمقارنة يستريح والفأر الأحجام تي خلية حفز mitogen وأن الجهاز يمكن قياس بدقة أقطار الخلية الفعلية.

ثم انتقلنا بعد ذلك لاختبار الاعتماد للزيادة قطرها يعني على تركيز سلطة النقد الفلسطينية، ووجدت أنه في ionomycin الثابتة تركيز 250 نيوتن متر، وتأثير سلطة النقد الفلسطينية لم يتغير بشكل كبير قبل رفع لها تركيز ومدمج 2-250 نانوغرام / مل (الشكل 2A). باستخدام الفحص القائمة على النظام التجاري المتعدد الأطراف، قمنا بقياس انتشار خلايا T في 50 و 250 نانوغرام مل سلطة النقد الفلسطينية / ويوجد فرق ملموس (الشكل 2C)، بالاتفاق مع البيانات قطر خلية لدينا. الأدوية الكالسينيورين المانع السيكلوسبورين ألف (300 نيوتن متر) وFK506 (1 نانومتر) قمعت كل من مأرمي (الشكل 2B) وانتشار (الشكل 2C). لم يكمل تثبيط في كلتا الحالتين، ولكن. أداء قياسات 12 ساعة بعد أن أظهرت سلطة النقد الفلسطينية / إضافة ionomycin زيادة 7.2٪ و 6.8٪ في قطر لمدة 50 نانوغرام / مل و 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية، على التوالي (الشكل 2D). وكانت زيادة حجم في هذه التركيزات اثنين لا تختلف كثيرا، كما كان الحال لمدة 48 ساعة التحفيز (مقارنة الشكل 2A).

ويلخص البيانات قطر الخلية التي تم جمعها من الراحة وتنشيط خلايا تي بعد 48 ساعة من سلطة النقد الفلسطينية / التحفيز ionomycin في الجدول 1. كانت مساحة المتوسط وحجم يستريح النواب الماوس خلايا تي الطحال 151.4 ميكرون ² و 1.9 × 10 ^-4 نيكولا لانغ، على التوالي. كانت مساحة المتوسط وحجم تنشيط خلايا تي 300.6 ميكرون ² و 5.9 × 10 ^-4 نيكولا لانغ، على التوالي. كان معدل الزيادة في قطر الشاملة لجميع خلايا تنشيط 40.92٪ (الجدول 1).

اختبرنا أيضا مركبات كيميائية أخرى تشير التقارير إلى أن مناعة: وكالة الفضاء الكندية، FK506، rapamycin، FTY720، والترام-34. في الشكل (3)، وقياسات حجم الخلية التي تم الحصول عليها في الراحة وتنشيط خلايا T في غياب وأظهرت وجود هذه الأدوية. وكالة الفضاء الكندية وFK506، التي تستهدف العامل النووي التي تعتمد على الكالسينيورين من تنشيط خلايا تي (NFAT) ^27،28، كانت الأكثر فعالية، مما يعوق استجابة مأرمي المنشأ قبل ما يقرب من 72٪ (الشكل 3A و 3B). ومن المثير للاهتمام، معانخفضت زيادة تركيز سلطة النقد الفلسطينية، وقوة من وكالة الفضاء الكندية وFK506 قليلا، حتى ولو كان هناك أي زيادة إضافية قطر خلية في حالة عدم وجود هذه الأدوية (الشكل 2A و 2B). كان Rapamycin، للمناعة التي تمنع الهدف الثدييات من rapamycin (mTOR س) ^29،30، ولها تأثير معتدل ولكن ذات دلالة إحصائية (الشكل 3A، 3B و 3C). FTY720 هي سفينغوزين 1-فوسفات مستقبلات ناهض الذي يمنع الخلايا اللمفاوية الخروج للتداول ³¹ وعثر مؤخرا على منع TRPM7، قناة الموجبة أعرب للغاية في الخلايا اللمفية تي ^32. وكان كل من FTY720 وrapamycin تأثير مماثل على مأرمي، تخفيضه من متوسط زيادة 52٪ في قطر إلى ما يقرب من 34٪ (الشكل 3A و 3B). الترام-34 هو مانع من قناة البوتاسيوم تنشيط الكالسيوم KCa3.1 ^33. اختبار في 700 نانومتر، وكان الترام-34 غير فعال في الخلايا T الفئران، طن فقا لدراسة انتشار الإنسان خلايا T الأخيرة؛ قد تعتمد فعاليته على طبيعة وقوة التحفيز مولد للتفتل ³⁴ (الشكل 3A و 3B). كان 700 نانومتر الترام-34 فعالية في منع القنوات KCa3.1 في تجاربنا الكهربية المشبك التصحيح (لا تظهر البيانات). وقدم هذه المقارنة بين الراحة والخلايا المعرضة المخدرات في تجارب متعددة داخل نفس التجربة في 48 ساعة. عندما rapamycin واستخدمت وكالة الفضاء الكندية معا، وكانت مأرمي تحول دون تماما (الشكل 3C).

تنشيط خلايا T الفئران مع anti-CD3 / حبات مغلفة مكافحة CD28 المغناطيسي لمدة 72 ساعة تنتج عن زيادة 27٪ في متوسط القطر، والتي تم تخفيضها إلى 5٪ في وجود من وكالة الفضاء الكندية (الشكل 3D). زادت الخلايا وحيدة النواة الإنسان على سلطة النقد الفلسطينية / تفعيل ionomycin لمدة 48 ساعة في قطر بنسبة 33٪، والتنشيط في وجود وكالة الفضاء الكندية انخفض استجابة إلى 23٪ ( ز> الشكل 4).

الشكل 1: توزيعات التردد من أقطار تي خلية الطحال الفئران. (A) الأعمدة السوداء تشير إلى الراحة والأعمدة الحمراء تشير إلى سلطة النقد الفلسطينية / تنشيط ionomycin (48 ساعة) الخلايا. (ب) توزيع خلايا تي الطحال تنشيط فرضه على 8 ميكرون حجم الجسيمات المعايرة القياسية. (C) توزيعات يستريح خلايا تي فرضه على المعايرة القياسية 6 ميكرون. يشار إلى أن أعداد الخلايا والخرز المستخدمة في صناديق. (د) الوسيط قطر يقاس العداد خلية تآمر ضد قطر حبة ذكرت من قبل الشركة المصنعة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ضمن الصفحات = "1">
الشكل 2: الاعتماد من الفئران تي خلية التنشيط على تركيز سلطة النقد الفلسطينية. (A) بأقطار متوسط الخلايا التائية إما غير المعالجة أو المعالجة مع 2، 50، و 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية في ثابت ionomycin تركيز (250 نيوتن متر). القياسات (ب) مكافحة خلية من الراحة وتفعيلها (2، 50، 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية) خلايا T في غياب وجود 300 نانومتر وكالة الفضاء الكندية أو 1 نانومتر FK506. (C) MTS انتشار فحص في 50 و 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية مع 250 نيوتن متر ionomycin في غياب وجود 300 نانومتر وكالة الفضاء الكندية. يشار إلى فروق ذات دلالة إحصائية (ع <0.001) مع النجمة. ن هو العدد الإجمالي للمحاكمات. البيانات من خلايا معزولة من 3 الفئران. (D) بأقطار خلية من الراحة وتنشيط خلايا T (250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية و 250 نانومتر ionomycin) 12 ساعة بعد التنشيط في غياب وجود 300 نانومتر وكالة الفضاء الكندية. pload / 55212 / 55212fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: آثار الإساءة الجنسية للطفل، FK506، FTY720، rapamycin، والترام-34 على حجم الخلية. (A و C) متوسط بأقطار من الراحة وسلطة النقد الفلسطينية / تنشيط ionomycin خلايا الفئران تي في غياب وجود مخدرات. وتظهر التركيزات في مربع. (ب) البيانات من الألف كما أعرب عن الزيادة في المئة على مدى قطر يستريح الخلايا التائية. تم إجراء تنشيط الخلايا اللمفاوية مع 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية و 250 نانومتر ionomycin، وأخذ القياسات بعد 48 ساعة. (D) القياسات مكافحة خلية من الراحة ومكافحة CD3 / خلايا T-تنشيط CD28، 72 ساعة بعد التنشيط في غياب وجود 300 نانومتر وكالة الفضاء الكندية.rge.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مأرمي في PBMCs الإنسان على التحفيز mitogen. (A) الأعمدة السوداء تشير إلى الراحة والأعمدة الحمراء تشير PBMCs تفعيلها. (ب) بأقطار متوسط من الراحة وPBMCs تفعيلها في غياب وجود 300 نانومتر وكالة الفضاء الكندية. تم تنشيط الخلايا مع 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية و 250 نانومتر ionomycin، وأخذ القياسات بعد 48 ساعة من التنشيط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: ملخص لمتوسط قطر خلية والزيادات النسبية في مساحة السطح. أجريت قياسات 48 ساعة بعد التنشيط مع 250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية و 250 نانومتر ionomycin.

هنا، نحن تصف تقنية للكشف السريع النوعي والكمي لخلايا T التحول مأرمي المنشأ باستخدام عداد الخلية الآلي. في ظل ظروف لدينا (250 نانوغرام / مل سلطة النقد الفلسطينية و 250 نانومتر ionomycin التحفيز)، تمت زيادة مساحة سطح الخلية شقين وحجم ثلاثة أضعاف بعد 48 ساعة من التنشيط. الفحص حساس بما فيه الكفاية للكشف عن التفجير خلال ساعة الأولى 12 من التنشيط، حيث زاد حجم الخلية فقط 1.25 أضعاف مقارنة يستريح (الشكل 2D). آلية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لتنشيط خلايا T استخدام الألغام المضادة للCD3 ومكافحة CD28 الخرز المغناطيسي المغلفة الأجسام المضادة تنتج استجابة مأرمي المنشأ كبيرة، بمتوسط زيادة 2.3 أضعاف في حجم (72 ساعة بعد التنشيط، الشكل 3D). وأظهرت الخلايا وحيدة النواة الإنسان تغييرا 2.6 أضعاف في حجم على سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin التحفيز لمدة 48 ساعة (الشكل 4). تم تحديد متوسط ​​قطرها مجلس النواب الماوس الطحال الخلايا التائية وحجم لتكون6.9 ميكرون و 1.9 × 10 ^-4 نيكولا لانغ، على التوالي. PBMCs الإنسان (من متبرع سليم واحد) وكان متوسط قطرها 7.7 ميكرون ومتوسط حجم 2.7 × 10 ^-4 نيكولا لانغ. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن اختبار أيضا زيادة تركيزات سلطة النقد الفلسطينية لقدرتها على تنشيط خلايا تي. وكانت هذه النتائج خلية واحدة متسقة مع المقايسات انتشار أجريت في تركيزات سلطة النقد الفلسطينية مماثلة.

تم اختبار عدة مركبات ذكرت أن تؤثر على تكاثر الخلايا: FTY720 ^31،32. ومناعة السيكلوسبورين A، FK506، وrapamycin ^27،28. والترام، 34 عاما، وهو مانع من القنوات KCa3.1 تنشيط الكالسيوم ^33،35. لقد وجدنا أنه في تركيزات اختبار، كانت مثبطات أقوى من مأرمي وكالة الفضاء الكندية وFK506. كان Rapamycin تأثير أصغر ولكن ذات دلالة إحصائية القمعية على مأرمي. الترام-34، من ناحية أخرى، لم يؤثر مأرمي.

قمعت وكالة الفضاء الكندية على حد سواء مأرمي وصroliferation، ولكن ليس تماما (الشكل 2B و2C)، مما يدل على أن آلية قياس خلية مكافحة ينتمي إلى المترابطة جيد من الكفاءة المخدرات في انتشار الخلايا التائية. في ظل وجود rapamycin جنبا إلى جنب مع وكالة الفضاء الكندية، وكانت مأرمي تحول دون تماما، مما يشير إلى أن مسارات NFAT- وmTOR س بوساطة في تركيبة يمكن تحميلها مسؤولية توسيع الخلايا التائية على التحفيز مولد للتفتل مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin (الشكل 3C).

مجموعة ديناميكية من بعض المقايسات انتشار محدودة (انظر الشكل 2). المقايسات انتشار الأسلحة النووية، مثل واحد ونحن قد استخدمت (الشكل 2C)، تقريرا إشارة إلى أن يتضمن مساهمات من الخلايا أفكارك والميتة. آلية قياس التغيير قطر لا تملك هذا الحد، كما تتعلق القياسات إلى خلايا قابلة للحياة فقط. ويتم تقييم الجدوى الخلية عن طريق استبعاد وصمة عار الزرقاء التريبان من الخلايا السليمة، قابلة للحياة. في قياسات حجم، وذلك باستخدام الأمامالضوء المبعثر في التدفق الخلوي التمييز خلية صدرة يمكن أن يكون مشكلة ^22. في القياسات الآلي خلية مضادة، لم يتم العثور على السكان صدرة (الشكل 1). أيضا، كان القياس دقيقا بما فيه الكفاية للتمييز بين الآثار 100 و 200 نانومتر السيكلوسبورين (الجدول 1) وللكشف عن مأرمي غضون 12 ساعة من التحفيز مولد للتفتل (الشكل 2D).

هذا الاختبار الجديد هو مفيدة بشكل خاص لأعداد صغيرة من العينات. ما يصل الى 15 عينات يمكن قياسها في 1 ساعة. ومع ذلك، فإن فحص له حدوده، ومعظمها يمكن تخفيفها. على الرغم من أنه يمكن حل فعال صغير الفرق (<1 ميكرون) في قطر الخلية، ونموذج الجهاز كنا له عتبة الكشف أقل من 5 ميكرون. هذا الحد يمكن أن يسبب المبالغة في تقدير الأحجام زنزانة صغيرة جدا، لأنها تستبعد بشكل فعال جميع الخلايا ذات أقطار صغيرة. ومع ذلك، النماذج الجديدة من العداد المحمولة لديها الكشف درس الحنطةالذين تتراوح أعمارهم بين من ~ 2 ميكرون، والتي ينبغي تخفيف من حدة هذه المشكلة. إذا كان هناك الكثير من الحطام في العينة، وأداة يعامل بها خلايا قابلة للحياة كما. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على فقاعات الهواء من حين لآخر في الخلية التدفق وتسبب تشويه الصور الخلية التي تم التقاطها بواسطة آلة. لا يظهر تشويه للتأثير على تقرير جدوى، ولكنه يمكن أن يؤثر على بأقطار قياسها. ولذلك، فمن المستحسن أن يتم فحص جميع الصور من قبل المجرب لفقاعات الهواء قبل أن يتم قبولها البيانات من كل محاكمة لتحليلها. منذ البرمجيات توجه فقط دوائر حول الخلايا، قد يكون بأقطار من الخلايا غير كروية ينحرف تجاه المحور الطويل، مما يجعل فحص أقل ملاءمة للخلايا غير كروية.

هذا الاختبار هو سريع، مع ما يقرب من 4 دقائق لكل عينة، بالمقارنة مع المقايسات انتشار الأسلحة النووية، التي تتطلب بضع ساعات. جمع البيانات أيضا بسيطة وليس باستخدام البرنامج المرفق مع الجهاز. البرنامج يمكن تصدير بيانات القياس ليرة سوريةreadsheet للتحليل. وأخيرا، فإنه هو وحيد الخلية، بدلا من عدد السكان، القياس؛ يتم قياس كل من مأرمي وانتشار. ويميز بين خلايا قابلة للحياة والميتة في وقت واحد. ويمكن استخدامه لتقييم سلالات الماوس المختلفة لقدرتها على شن استجابة مناعية. يمكن أيضا فحص استخدامها بنجاح لقياس مأرمي في الخلايا التائية من الجهات المانحة الإنسان (الشكل 4)، ويمكن أن تستخدم أيضا في أنواع أخرى من الخلايا.

ومن المعروف أن زيادة حجم الخلية للمساهمة في تنظيم عملية التمثيل الغذائي: خلية تورم يحفز الناجم عن الجلوتامين توليف الجليكوجين وتكون الدهون في خلايا الكبد ^36،37. العدلات عرض زيادة حجم الهجرة المرتبطة من 35-60٪، في حين أن وكلاء الكيميائي لحث على 10-15٪ تورم ^38-40. من المحتمل أن الفحص الحالي أن تستخدم لدراسة هذه العمليات.

The authors have no competing financial interests.

We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.