Gleichzeitige Aufnahme von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen in narkotisierten Ratten

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

Messung der Elektroretinogramm (ERG) und visuell evozierte Potential (VEP) liefern nützliche quantitative Beurteilung der Integrität der Sehbahn. Die ERG misst die elektrischen Antworten der Netzhaut auf Licht Stimulation, während der VEP die entsprechende funktionale Integrität der Sehbahn von der Netzhaut zum primären visuellen Kortex nach dem gleichen Lichtereignis misst. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die Erfassung und Analyse von ERG und VEP-Antworten in einem allgemein verwendeten Labormodell, der Ratte.

Die ERG liefert einen Index der funktionellen Integrität einer Reihe von wichtigen Netzhautzellklassen durch die Netzhaut des elektrischen Brutto Reaktion auf einen Lichtblitz zu quantifizieren. Eine koordinierte Reihe von Ionenflüssen durch Licht initiierte Einsetzen und Offset erzeugen erkennbaren Änderungen in der Spannung, die gemessen werden können, außerhalb des Auges platziert Oberflächenelektroden verwendet. Die sich ergebende Wellenform stellt die Kombination einer seRies von gut definierten Komponenten, in Amplitude, Zeitsteuerung und Frequenz unterscheiden. Eine erhebliche Anzahl von Studien hat gezeigt, dass diese Komponenten sind relativ gut in vielen wirbel Retinae konservierten und dass die Komponenten voneinander getrennt werden können. Durch umsichtig den Reiz (Flash - Stimulus, Hintergrund, Interstimulus Intervall) Auswählen von Bedingungen und spezifischen Merkmale der zusammengesetzten Wellenform der Wahl zu analysieren kann man ein Maß für eine bestimmte Gruppe von Netzhautzellen von der Rückkehr ^1,2 zuversichtlich sein. Diese Eigenschaften unterliegen die Brauchbarkeit und somit die weit verbreitete Anwendungen der ERG als nicht-invasive Messung der Netzhautfunktion. Diese Handschrift konzentriert sich auf die Methodik für die ERG die Messung und Analyse ihrer Funktionen Informationen über einige der wichtigsten Zellklassen in der Netzhaut zurück, nämlich Photorezeptoren (die PIII-Komponente), bipolare Zellen (die PII-Komponente) und retinale Ganglionzellen (die positive scotopic Schwellenreaktion oder pstr).

Das VEP stellt einen Assay der kortikalen Reaktion auf Licht; zuerst von der Netzhaut stamm und danach seriell über den Sehnerv, Sehbahn, Thalamus (Corpus geniculatum laterale, LGN) und optische Strahlung Bereich V1 des Kortex ³ mitgeteilt. Bei Nagetieren, die Mehrheit (90-95%) der Sehnervenfasern von jedem Auge decussate ⁴ und innervate kontralateralen Mittelhirns. Anders als bei der ERG, ist es noch nicht möglich , verschiedene Komponenten der VEP an spezifische Zellklassen zuzuordnen, ⁵ somit überall ändert sich entlang der Sehbahn die VEP - Wellenform beeinflussen könnten. Dennoch ist die VEP eine nützliche nicht-invasive Messung der Sehleistung und Sehbahn Integrität. Die VEP, wenn sie in Verbindung mit dem ERG verwendet wird , kann eine vollständigere Beurteilung der visuellen Systems bereitzustellen (dh Retina / Sehbahn).

ERG und VEP-Aufnahmen können für sich allein oder in Kombination durchgeführt werden, abhängig von der AnwenKation. Die Methodik in diesem Papier beschrieben ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung der Netzhaut und im kortikalen visuell evozierten Elektrophysiologie von beiden Augen und die beiden Hemisphären in narkotisierten Ratten. Dies ist ein nützlicher Weg zu umfassender Netzhautfunktion und die Upstream-Effekte zu bewerten, dass Veränderungen der Netzhautfunktion auf visuell evozierten kortikalen Funktion haben kann.

Alle experimentellen Verfahren wurden für wissenschaftliche Zwecke für die Pflege und Verwendung von Tieren nach dem australischen Code of Practice durchgeführt, die von der National Health and Medical Research Council in Australien aufgeführt. Ethik-Clearance von der University of Melbourne, Fakultät, Tierethikkommission (Zulassungsnummer 0.911.322,1) erhalten.

1. Pre-Implantation von chronischen VEP Elektroden

Hinweis: Wenn die gleichzeitige ERG und VEP Signale gesammelt werden sollen Tiere müssen chirurgisch mit VEP-Elektroden mindestens 1 Woche vor der Signalerfassung implantiert werden.

1. Sterilisieren Sie die chirurgische Bank vor dem Experiment, indem sie mit Chlorhexidin (0,5% in 70% Ethanol) gereinigt werden. Autoklav alle chirurgische Geräte vor dem Gebrauch. Decken Sie das Tier mit einem sterilisierten Operationstuch. Sicherstellen, dass alle Experimentatoren tragen chirurgische Masken, Kittel und sterilisierte Handschuhe.
2. Induzieren Anästhesie mit 3-3,5% Isofluran mit O ₂ mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 L / min. pflegen anesthesia bei 1,5% und 2 L / min während des gesamten Operation. Achten Sie auf ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen der Pfote Prise Reflex.
3. Gelten 1% Carboxymethylcellulose-Natrium auf der Hornhaut Trocknen der Augen zu verhindern.
4. Rasur eine 30 mm x 30 mm Fläche, über die Stirn, posterior zu den Augen und ventral der Ohren.
5. Platzieren Tier auf einem Heizkissen (37 ˚C) auf Körpertemperatur zu halten und zu stabilisieren Tiere Kopf mit einem stereotaktischen Rahmen.
6. Desinfizieren Sie die rasierte Fläche mit 10% Povidon-Iod dreimal. Vermeiden Sie den Einsatz von Alkohol-basierte Antiseptika für die Fläche in der Nähe des Auges, wobei im Einklang mit dem Standard der Praxis festgelegt von der Association of Surgical Technologen aus.
7. Machen Sie einen mittigen Sagittal- Schnitt auf den Kopf mit einem Skalpell und von dieser Verbrauch a ~ 20 mm Durchmesser-Kreis von Hautgewebe, um den Schädelknochen aus.
8. Entfernen zugrunde liegenden Periost durch Kratzen und Trocknen mit Gaze der koronalen und sagittalen Schädelnähte zu belichten.
9. Unsing eines dentalen Bohrers zu einem Bohrer befestigt, trepan zwei Löcher (0,7 mm Durchmesser, Tiefe ~ 1 mm) durch den Schädel auf beiden Hemisphären in den stereotaktischen Koordinaten: 7 mm kaudal Bregma, 3 mm lateral Mittellinie.
10. Schrauben in Edelstahl-Schrauben (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm, mit Chlorhexidin sterilisiert) in die beiden vorgefertigten Bohrungen bis in eine Tiefe von ca. 1 mm (2 mm Schrauben ausgesetzt) ​​feste Verankerung zu ermöglichen. Diese Kontakte die Dura ohne die zugrunde liegende Rindengewebe zu schädigen.
11. Bereiten OP-Bereich für Zahnamalgam durch den Schädelknochen mit Gaze Trocknen und Einziehen lose Haut mit zwei 3-0 Nähte bei ~ 4 und 8 Uhr.
12. Verbreiten Sie Zahnamalgam über den freiliegenden Schädel die Schrauben Elektroden (Edelstahlschrauben in Schritt 1.10 beschrieben) in Position zu sichern. Stellen Sie sicher, ~ 1,5 mm der Schrauben für die Aufnahme frei bleiben.
13. Entfernen Sie die Rückzugs Nähten.
14. Injizieren 0,5% Carprofen subcutan (5 mg / kg) für Analgesie und Kochsalzlösung (Natriumchlorid 0,9%, 10,5 ml) subkutan für Flüssigkeitsersatz.
15. Lassen Tier in getrennten Käfigen zu erholen. Lassen Sie keine Tier unbeaufsichtigt, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat.
16. Nicht Tier an die Firma von anderen Tieren zurück, bis sie vollständig von der Operation (mindestens 5 Tage) erholt hat.
17. Weiterhin 0,5% Carprofen subkutan zur Analgesie zu verabreichen (5 mg / kg) einmal täglich für 4 Tage.
18. Die Bilanz ERG und VEP 1 Woche nach der Operation.

2. ERG und VEP-Aufnahme

1. Die Datenerhebung Vorbereitung
   1. Verwenden Sie Computer - Software , um gleichzeitig Stimulus auslösen und zu erwerben Daten ² gemäß den unten angegebenen Einstellungen empfohlen.
      1. Amplify die Signale ³ (ERG: × 1000, VEP: · 10000) mit der Verstärkung intern von einem isolierten Vorverstärker und Verstärker eingestellt und mit beiden Augen für Impedanz abgestimmt.
      2. Eingestellt Abtastrate für die ERG bis 4 kHz über einen 650ms Aufnahmefenster (2.560 Punkte), dies zu tun, klicken Sie auf die Registerkarte "Zeitbasis" in der Datenerfassungssoftware (für Name und Version der Software siehe Tabelle Materials), "2560" für die Proben aus, und "500 ms" für Zeit, die ein 650 ms Aufnahmefenster zurückkehren wird.
         1. Verwenden Sie die gleiche Methode, um die Abtastrate für den VEP bis 10 kHz über einen 250 msec Epoche zu setzen. Lassen Sie eine 10 ms Pre-Stimulus Basis für beide ERG und VEP-Aufnahmen. Um dies zu tun, klicken Sie auf die Registerkarte "Setup"; wählen Sie "Stimulator", um ein neues Dialogfenster bringen; in diesem Fenster wählen Sie "Impuls" aus der Dropdown-Liste für "Mode"; und setzen Sie den Wert für "Verzögerung" bis "10 ms".
      3. Set ERG Bandpassfilterung auf 0,3 - 1,000 Hz (- 3 dB). Dies wird durch Anklicken von "Bio-Verstärker" in der Datenerfassungssoftware. Dann setzen Sie den Wert für "High Pass" auf "0,3 Hz" und den Wert für "low pass" auf "1 kHz".
      4. Unter Verwendung des oben genannten Verfahrens in 2.1.1.3, setzen VEP Bandpass Einstellungen auf 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) , wie von der Internationalen Gesellschaft für Klinische Elektrophysiologie von Vision (ISCEV) empfohlen für den menschlichen VEP Aufnahmen ^6.
2. Elektrodenvorbereitung
   1. Sonderanfertigungen machen die ERG aktiv / inaktiv und VEP aktiv / inaktiv Elektroden durch Silberdraht befestigt oder eine Krokodilklemme an eine Elektrodenleitung bzw. ^2. Im Handel Masseelektrode erhalten.
   2. Für die 4 maßgeschneiderte Elektroden, schneiden Sie den Stecker aus der Elektrodenleitungsverlängerung. Entfernen 1 cm der äußeren Polytetrafluorethylen Isolierbeschichtung mit einer Skalpellklinge den inneren Draht gewährleistet nicht beschädigt wird.
   3. Pre-Mode die ERG inaktive Elektroden, die durch eine 70 mm Länge aus Silberdraht (0,3 mm Dicke) Schneiden und Bilden einer Schleife ~ 8 mm Durchmesser der Ratte Auge zu umschließen. Bereiten Sie einen gleichmäßigen Kreis durch die Schleife auf einer 1 ml Pipettenspitze zu formen.
   4. Pre-Mode VEP inaktive Elektroden, die durch eine 70 mm Länge von Silber Schneiden und eine Ellipse ~ 8 mm in der Länge nach Durchmesser bilden auf Ratten Schneidezähne Haken.
   5. Pre-Mode die ERG aktive Elektroden, die durch eine 30 mm Länge aus Silberdraht Schneiden und eine kleine Schlaufe bildet sanft die Ratte Cornea (~ 1-2 mm Durchmesser) zu kontaktieren
   6. Sicher befestigen Elektroden (2 ERG aktiv, 2 ERG inaktiv, 1 VEP inaktiv) an die Elektrodenleitung durch das Silber mit dem freigelegten inneren Draht entwining.
   7. Isolierarbeiten Überschuss freiliegenden Metall mit Klebeband zu Photovoltaik-Artefakte zu reduzieren.
   8. Auf die ERG inaktive Elektroden ein kleines Stück Haken und Ösen Verschluss (~ 5 mm × 20 mm) mit dem Abdeckband zu ermöglichen stabile Befestigung an dem Nagetier Umhängeband kleben.
   9. Krokodilklemme an den inneren Draht der Elektrode Befestigen führt die VEP aktiven Elektroden zu machen.
   10. Vor der Aufnahmen, galvanisieren die freiliegenden Oberflächen der Silberdrähte (dh den inaktiven Ring und aktive Spitze) mit Chlorid eine 9-V-Gleichstromquelle für 20 Sekunden unter Verwendung von Signalübertragung zu verbessern.
       1. Dazu tauchen die silberne Spitze der ERG Elektrodendraht (als Anode einer Primärzelle wirkt) in normaler Kochsalzlösung; das andere Ende dieser Elektrodendraht an den Pluspol einer 9 V Batterie anschließen.
       2. Schließen Sie einen anderen Draht (die Kathode) an den Minuspol der Batterie, und tauchen Sie das andere Ende in Kochsalzlösung als auch. Ziehen Sie nach 20 Sekunden und beobachten Sie die Bandspitze der ERG Elektrodendraht werden gleichmäßig in der weißen Farbe beschichtet.
          Hinweis: Bereiten Sie neue ERG Elektroden für jede experimentelle Sitzung (~ bis zu 8 h) Durchgängigkeit der Chlorid Beschichtung zu gewährleisten.
3. Tiervorbereitung
   1. Dark-Anpassung über Nacht die Tiere (≥ 8 Stunden) vor der Aufnahmen in einem lichtdichten Raum. Stellen Sie sicher, maximale Dunkeladaptation von Raumbeleuchtung ausgeschaltet, Schließen Sie alle Türen und Jalousien. Minimieren Lichtverlust, indem lichtundurchlässigen Materialien umKreuzungen von Türen / Fenster und Platzierung Computerbildschirmen außerhalb dicken schwarzen Vorhängen.
   2. Führen Sie Tiervorbereitung in einem dunklen Raum mit Hilfe von dim rotes Licht emittierende Diode (LED; 17,4 cd.m ^-2, λ _max = 600 nm) Stab Empfindlichkeit zu erhalten.
   3. Anästhesieren Ratte von Ketamin / Xylazin Injektion (60: 5 mg / kg) intramuskulär. Bestätigen ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen eines paw pinch Reflex.
   4. Zur Aufrechterhaltung der Sedierung, verwalten eine weitere Dosis der Narkose (50% der Anfangsdosis) nach 50 min, falls erforderlich.
   5. Für zusätzliche Lokalanästhesie für jedes Auge ein Tropfen von 0,5% Proxymetacain gelten, und überschüssige Flüssigkeit blinken ab.
   6. Für Pupillenerweiterung ein Tropfen von 0,5% Tropicamid für jedes Auge anwenden, dann überschüssige Flüssigkeit trocknen.
4. ERG und VEP Elektrodenpositionierung
   1. Platzieren Tier auf der ERG-Plattform vor dem Ganzfeld Schüssel in dem Käfig Faraday entfernt. Vermeiden Sie eine elektrische Heizkissen verwenden, wie es ceine Einführung elektrisches Rauschen in den elektrophysiologischen Ableitungen. Hinweis: Die Plattform auf eine zirkuliert erhitzte Wasserplattform befestigt ist, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
   2. Sichere Tier-Plattform mit einem Streifen aus Haken-und-Schlaufen-Befestigungs fest platziert, aber nicht eng um den Nacken.
   3. Hängen Sie die inaktive VEP Elektrode um unteren Schneidezähne von betäubten Ratten.
   4. Positionieren Sie die ERG inaktive Elektroden durch Umfassen des Skleralring nicht-invasiv um den Äquator des Auges. Stabilisieren dies durch Elektroden mit dem Haken und Schlaufenbefestigungsstreifen um den Nacken zu befestigen. Wiederholen Sie dies für das andere Auge.
   5. Befestigen Sie VEP aktiven Elektroden durch Krokodilklemmen an Edelstahlbefestigungsschrauben auf dem Schädel vorge implantiert.
   6. Setzen Sie einen kleinen Tropfen von 1% Natriumcarboxymethylcellulose auf der Hornhaut vor der Platzierung der ERG aktiven Elektrodensignalqualität zu verbessern. Hinweis: Die Viskose Flüssigkeit hilft auch Hornhaut Feuchtigkeit im gesamten Experimente mini haltenmieren die Bildung von Austrocknungs-Typ Katarakt bei Nagern ^7.
   7. Setzen Sie einen kleinen Tropfen von 1% Natriumcarboxymethylcellulose auf die unteren Schneidezähne Kontakt des VEP inaktive Elektrode zu verbessern und damit die Qualität signalisieren.
   8. Positionieren Sie die ERG aktiven Elektroden leicht auf die zentrale Hornhautoberfläche mit einem Mikromanipulator berühren an einem speziell angefertigten stereotaktischen Arm.
   9. Fügen Sie 2 bis 5 mm der Bodennadelelektrode (Edelstahl) subkutan in den Schwanz.
   10. Bei Bedarf trocknen überschüssige Flüssigkeit aus dem unteren Augenlid vor der Aufzeichnung der Signalqualität zu verbessern.
   11. Slide-Plattform näher an die Ganzfeld Schüssel gewährleistet die Augen des Tieres mit der Öffnung der Schüssel ausrichten gleichmäßige Ausleuchtung der beiden Netzhäuten zu ermöglichen (siehe Schritt 2.4.1).
   12. Schließen der Faraday-Käfig Fremdgeräusche zu reduzieren.
5. Datensammlung
   1. Verwenden Sie einen schwachen Test-Blitz (- 0,52 log cd.sm ^-2) , ob Elektrode Placem zu beurteilenent ist zufriedenstellend ^2. Unter Kontrollbedingungen führen würde dies in einer ERG Amplitude von ~ 800 & mgr; V und einer inter Auge Variabilität von nicht mehr als 10%. Bei Bedarf neu zu positionieren Elektroden.
   2. Nach dem Test-Blitz zulassen, dass Tiere, die für 10 Minuten in völliger Dunkelheit, um die Aufnahme vor dunkel anzupassen.
   3. Anwesend Blitze Lichtreize eine Ganzfeld Schüssel mit, während das Sammeln ERG und VEP-Signale gleichzeitig über eine ~ 500 ms Zeitfenster. Die Fortschritte von Dimmer Lichtpegel, um einen helleren ausreichend dunkel-Anpassung für bestimmte Wellenformen zu erhalten.
   4. Sammeln Sie Signale über einen Bereich von Lichtenergien STR zu entlocken, b-Welle und a / b-Welle Wellenformen der ERG. Durchschnittlich mehr Signale an den Dimmer Lichtpegel (20 Wiederholungen) und weniger bei den helleren Lichtenergien (1 Wiederholung). Allmählich verlängern die Inter-Stimulus-Intervall von 1 bis 180 sec von dimmest zum hellsten Lichtpegel. Siehe Tabelle 1 für ein Beispiel - Protokoll.
   5. ISOEnde der ERG Stäbchen und Zapfen Antworten, verwenden Sie ein gekoppeltes-Flash - Paradigma ^8. Initiieren vier Blitze bei 1,52 log cd.sm ^-2 mit einem 500 ms Inter-Stimulus - Intervall ² in-between. Digital subtrahieren Sie die Kegel Wellenform ^(3. oder ^4. Blitz) aus der gemischten Wellenform ^(1. Blitz) die mutmaßliche Stange Antwort abzuleiten.
   6. Zur Aufzeichnung VEP Signale, durchschnittlich 20 Wiederholungen bei den helleren Lichtenergien (dh - 0,52-1,52 log cd.sm ^-2, 5 sec Inter-Stimulus - Intervall). die herkömmliche dunkeladaptierten liefert ERG Antwort Beachten Sie, dass der erste Blitz in dieser Reihenfolge.
   7. Zulassen von 1 bis 3 min für die Wiederanpassung nach (20) VEP streicht, bevor der nächste heller ERG Schritt in Abhängigkeit von der Lichtenergie.
   8. Nach Abschluss der Datenerhebung, einschläfern die narkotisierten Tier mit Intrakardial von Pentobarbital-Natrium (325 mg / ml, 3 ml).

Tabelle 1. ERG und VEP Aufnahmeprotokoll mit einer Reihe von Reizenergie. Stimulus - Präsentationen Fortschritt von dim (oben) bis hell (unten) blinkt, mit ausreichender Inter-Stimulus - Intervall dunkel Anpassung zu gewährleisten. Am Ende des Protokolls, die Wiederholung von vier Blitze mit kurzen Intervall dargestellt, um den Kegel vermittelte Reaktion hervorzurufen.

3. Analyse der ERG Kurven

Hinweis: ERG und VEP - Analyse wurde bereits ausführlich beschrieben worden ^3,9,10 Die.folgenden Abschnitte geben einen kurzen Überblick.

1. Export-Signale in digitale Spannungszeitformat in ein Tabellenkalkulations-Software für die Datenanalyse.
2. Rod photoreceptoral Funktion
   1. Modell , um die Vorderkante der a-Welle PIII mit einer verzögerten Gaussian (Gleichung 1) ^11.
      PIII (i, t) = Rm _PIII ∙ [1 - exp (- i ∙ S (t - t _d) ^2)] für t> t _d (Gleichung 1)
   2. Optimieren Sie den Sitz über ein Ensemble von zwei hellsten leuchtenden Energien ^12,13 (dh, 1,22 und 1,52 log cd.sm ^-2).
   3. Modell bis zu 90% der a-Wellenamplitude zu vermeiden post-receptoral Intrusionen ^14.
      Hinweis: Das Modell gibt die gesättigten Amplitude (Rm _PIII, uV), Empfindlichkeit (S, m ² .s ^-1 .cd ^-3) und der Verzögerung (t _d, ms) der photoreceptoral Antwort.
3. Rod Bipolarzelle FunktIon
   1. Digital subtrahieren das PIII-Modell (siehe oben) aus den gemischten Wellenformen des gemischten PII mit darüber liegenden Schwingungspotentiale zurückzukehren.
   2. Um die Stange PII aus dem gemischten PII extrahieren, subtrahieren digital den Kegel Antwort ^(3. oder ^4. Blitz bei 1,52 log cd.sm ^-2) aus dem gemischten PII (1 ^st Blitz bei 1,52 log cd.sm ^-2).
   3. Dann wenden ein Tiefpassfilter auf die Wellenform (46.9 Hz, -3 dB, Blackman-Fenster) oszillierenden Potentiale zu entfernen. Die verbleibende Wellenform ist der Stab PII Antwort ^10.
   4. Extrahieren Sie die Stange PII Spitzenamplitude und zeichnen Sie es gegen alle Reizstärken (unter -2 log cd.sm ^-2 und stab isoliert PII bei 1,52 log cd.sm ^{-2) 10.}
   5. Modellieren diese Daten eine hyperbolische Funktion (Gleichung 2) verwendet, die ein Maß der inneren Netzhautzellintegrität bietet.
      V _(i) = V _max (i ⁿ / ⁽ⁿ i+ K ⁿ⁾⁾ (Gleichung 2)
      Hinweis: Diese Gleichung liefert maximale PII Antwort (V _max, & mgr ; V), 1 / Empfindlichkeit (k, log cd.sm-2) und die Steigung der Funktion (n) ^15.
4. Cone bipolaren Zellfunktion
   Hinweis: Da der Kegel Antwort bei einer einzigen Intensität genommen wird (1,52 log cd.sm ^-2) die Amplitude und Timing werden in diesem Lichtpegel erneut abgestimmt.
   1. Auszug maximale Kegel PII Antwort ^2,16.
   2. Auszug implizite Zeit , auf die diese maximale Reaktion ^2,16 entspricht.
5. Ganglion Zellfunktion
   1. Da der STR ein kleines Signal, ein Tiefpassfilter mit 50 Hz notch gelten für die Wellenform hoher Frequenz und Leitungsrauschen (46.9 Hz, -3 dB, Blackman-Fenster) zu beseitigen.
   2. Auszug maximale pstr Antwort ^3,17.
   3. Auszug implizite Zeit , auf die diese maximale Reaktion ^3,17 entspricht.

4. AnaLyse von VEP Kurven

1. Extrahieren maximalen und minimalen Komponenten der VEP (P1, N1 und P2). Siehe Detail Referenzen ^3,6.
2. Express Amplituden als trog zu-Spitze - Amplituden von ihrem vorhergehenden Spitze oder Mulde (P1N1 und N1P2) ^3,6.
3. Auszug implizite Zeit _(es) , auf die diese maximale Reaktion entspricht (P1 _es, N1 _es, P2 _it) ^3,6.

Die ERG a-Welle (> -1,38 log cd.sm ^-2), b-Wellen (> - 4,99 log cd.sm ^-2) STRs (<- 4,99 log cd.sm ^-2) und die VEP (> - 0.52 log cd.sm ^-2) wurden gleichzeitig aufgezeichnet (Abbildung 1 und 3). Bei sehr dim Wallungen, eine positive STR ​​(pstr) bei etwa 110 msec nach dem Blitz zu sehen ist , und eine negative STR ​​(nSTR) bei etwa 220 msec (1 und 2). Eine ERG mit einem großen b-Welle, Spitzen zwischen 50 bis 100 ms nach dem Beginn eines moderaten Blitz , die für ihre PII Reaktion analysiert werden können (Abbildungen 1 und 2). An dieser Reizenergie, die negative a-Welle vor dem Gipfel ist vernachlässigbar. Bei helleren Lichtenergien die negative Auslenkung a-Welle wird mehr im Vordergrund , die mit dem PIII - Antwort (2) quantifiziert werden kann. Die scotopic VEP Wellenform zeigt eine negative Antwort (P1N1; 15-70 msec Fenster), gefolgt von eine positive Auslenkung (N1P2; 30-100 msec) (3 und 4).

Abbildung 1. Gruppe Durchschnitt ERG Kurven. Die ERG verändert mit Reizintensität zu erhöhen. Zahlen auf der linken Seite der Wellenform zeigen die Lichtexposition verwendet, um die Wellenform hervorzurufen. Beachten Sie die unterschiedlichen Amplituden und Zeitskalen für jede Platte. Bei Dimmer Leucht Energien die positiven und negativen Komponenten des skotopischen Schwellenreaktion kann ausgelöst werden (pstr, nSTR). Als Stimulus Energien heller zu bekommen, können die a und b-Wellenantwort untersucht werden, und ein gekoppeltes-Flash - Paradigma ermöglicht die Kegel Reaktion gemessen werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. ERG - Analyse. (A) Rod Photorezeptorfunktion kann durch die Verwendung eines PIII getestet werden , um die a-Welle modellieren. A-Wellen bei 1,22 und 1,52 log cd.sm ^-2 (ungefüllte Kreise, ○) sind fit als Ensemble mit einem PIII (graue Linien, Gleichung 1) auf 90% des Mindestlohns , die Rm _PIII (gesättigte Amplitude, & mgr ; V) liefert S (Empfindlichkeit, m ² .s ^-1 .cd ^-3) und td (Zeitverzögerung msec) Parameter. (B) Rod bipolaren Zellfunktion (Mittelwert ± SEM) kann durch Modellieren der Intensität Antwortserie des Stabes PII untersucht werden (leere Kreise ○) mit einer Naka-Rushton-Funktion (graue Linie). Dies gibt V _max (gesättigte Amplitude, & mgr ; V), k (1 / Empfindlichkeit, log cd sm ^-2) und n (Steigung). (C) Retinal Ganglion Zellfunktion bei schwachem Licht Energien untersucht und durch pstr Spitzenamplitude (pstr quantifiziert _amp) und Timing (pstr _es ). (D) Cone bipolaren Zellfunktion für ein gekoppeltes-Flash - Paradigma quantifiziert durch Kegel PII Spitzenamplitude (Kegel PII _amp) und Timing (Kegel PII _it) ausgelöst wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Gruppe Durchschnitt VEP Kurven. Die Form der VEP - Wellenform ändert sich mit Reizenergie zu erhöhen. Zahlen auf der linken Seite der Wellenform zeigen die Lichtexposition verwendet , um die Wellenform zu entlocken. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 4. VEP Analyse und Intensität Antwortfunktion. (A) Amplitudenanalyse des VEP als Spitze genommen Trog (P1N1) und Trog zu Peak (N1P2) Amplituden. Die impliziten Zeiten _(es) dieser Antworten wird auch zurückgegeben (P1 _es, N1 _es, P2 _it). (B) Die VEP P1N1 Amplitude (Mittelwert ± SEM) steigt mit Reizenergie zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

Die ERG und VEP sind objektive Maßnahmen der visuellen Funktion von der Retina und Cortex sind. Der Vorteil der gleichzeitigen Aufnahme ist, dass eine umfassendere Sicht auf den gesamten Sehbahn wird gewährt. Im Konkreten könnte die komplementäre Informationen aus ihrer gleichzeitigen Beurteilung eine klarere Abgrenzung der Stelle der Verletzung in der Sehbahn bereitzustellen (beispielsweise zur Behandlung von Störungen mit überlappenden ERG noch deutliche VEP Manifestationen ^18, wenn optische Neuropathie mit primären zerebrale Atrophie koexistieren kann ^{19, 20,} oder wenn VEP Verlust kann durch Manifestation von Verletzungen an mehreren Standorten in Sehbahn ^21,22) verwechselt werden. Durch die Messung gleichzeitig die ERG und VEP, ein Index der Verstärkung zwischen Retinal und kortikalen Reaktion kann auch abgeleitet werden. Dies kann ein nützliches Werkzeug zur Verfügung stellen subtile pathologischen Veränderungen zu erkennen. Das aktuelle Protokoll ermöglicht für ERG und VEP-Messung in Labor-Ratten häufig verwendet, kann aber ohne weiteres ad sein^23-25 ​​Apted auf andere Säugetierarten. ERG und VEP Wellenformen von Nagetieren eine hinreichend sichere präklinische Surrogat für Reaktionen in menschlichen Augen beobachtet ^26-28.

Durch einen bestimmten Stimulus - Protokoll Gestaltung, sowohl ERG und VEP Reaktion kann während einer einzigen Aufzeichnungssitzung erhalten werden. Tabelle 1 zeigt eine Progression der Lichtstärke mit entsprechender Berücksichtigung der Erholungszeit zwischen den aufeinanderfolgenden blinkt. Dieses Protokoll bietet ein ausgewogenes Verhältnis zwischen der Notwendigkeit, Signal-zu-Rauscheigenschaften zu maximieren und die Aufnahmezeit im Anästhetikum Fenster durch eine einmalige Gabe von Ketamin zur Verfügung gestellt zu begrenzen: Xylazin. Daher kann diese Technik für eine objektive quantitative Maß der Sehfunktion zur Erforschung grundlegende Physiologie und Krankheiten nützlich sein.

Eine umfassende Beurteilung des visuellen Systems kann durch gleichzeitige Beurteilung der bilateralen retinalen Antworten und visuell evozierten kortikalen Antworten erreicht werden. Jedoch kann jede Technik auch in Isolierung und monokular statt binokular durchgeführt werden, um das Verfahren zu vereinfachen. Das aktuelle Protokoll beschreibt scotopic ERG und VEP Signale gewählt, um den stab Weg gegeben, zu isolieren, dass Ratten, die eine Stange dominierten Netzhaut haben. Wenn das Licht angepasst Antworten von mehr Interesse für die Studie sind, ist es auch möglich, photopic ERG und VEP Signale, die von Pre-Anpassung an ein Hintergrundlicht zu leiten.

Eine wesentliche Einschränkung dieser Technik ist die Notwendigkeit, das Verfahren unter narkotisiert Bedingungen durchzuführen stabile Platzierung der Elektroden zu ermöglichen. Dennoch bietet dieser Ansatz robustes Signal-zu-Rauscheigenschaften ermöglicht Erkennung von subtilen Behandlung ändert.

Aufgrund der geringen Amplitude der STR und ihre Lichtempfindlichkeit Anpassung, müssen mehrere Schritte genau beobachtet werden erfolgreiche Aufnahme dieser Reaktion zu gewährleisten. Erstens muss eine ausreichende Dunkeladaptation umgesetzt werden, die beinhaltetüber Nacht Dunkeladaptation (≥ 8 h), Elektrodenplatzierung bei schwacher roter Beleuchtung (17,4 cd.m ^-2, λ _max = 600 nm) und erneut Dunkeladaptation nach einem dim Test-Flash (10 min für - 0,52 log cd. sm ^-2). Weiterhin kann das Signal-zu-Rausch - Charakteristika des STR durch Mittelung über mehrere Signale verbessert werden (dh 20 - Signale) mit kurzen Inter-Stimulus - Intervallen gesammelt (dh 2 sec). Einer der Vorteile dieser umfassenden Bewertung beider Augen und cortices ³ Vergleich zur kontralateralen Aufnahme zu ermöglichen. Als solche sollten besondere Sorgfalt (dh gleiche Größe und förmigen Elektroden) in der Elektrodenherstellung genommen werden, um minimal inter Auge und inter kortikalen Variabilität zu gewährleisten.

Angesichts der umfangreichen Nutzung beider ERG und VEP Techniken in vivo Maßnahmen der Sehbahn und seiner krankheitsbedingten Prozesse zur Verfügung zu stellen, wäre es sinnvoll sein , andere Weg spezifische p zusammenzutragenrotocols (beispielsweise EIN / AUS oder kegelUnterTyp - spezifische) und gleichzeitige Aufnahmen ERG / VEP zuführen mit unterschiedlichen Reizmodalitäten (beispielsweise Flimmern, Muster, Sägezahn) , um die Anwendung dieser Technik in klinischen Diagnosen zu erweitern. Ein weiterer logischer Schritt dieser Anwendung in der Zukunft wäre auch die ERG und VEP aufzeichnen gleichzeitig von bewussten ^29, Tiere frei bewegten Anästhetikum Einflüsse ³⁰ auf neuronale Physiologie zu vermeiden.

The authors have no disclosures relevant to this work.

Funding for this project was provided by the National Health and Medical Research Council (NHMRC) 1046203 (BVB, AJV) and Melbourne Neuroscience Institute Fellowship (CTN).