荧光RNA适配体 外和细胞 开启动力学的测定

该协议提供了两种确定荧光RNA适配体菠菜2和西兰花动力学的方法。第一种方法描述了如何使用酶标仪 在体外 测量荧光适配体动力学，而第二种方法详细介绍了通过流式细胞术测量细胞中荧光适配体动力学。

荧光RNA适配体已被应用于活细胞中，以标记和可视化RNA，报告基因表达，并激活荧光生物传感器，以检测代谢物和信号分子的水平。为了研究每个系统中的动态变化，需要获得实时测量，但测量的准确性取决于荧光反应的动力学比采样频率快。在这里，我们描述了分别使用配备样品进样器和流式细胞仪的酶标仪来确定荧光RNA适配体的体外和细胞开启动力学的方法。我们表明，Spinach2和西兰花适配体荧光活化的体外动力学可以建模为两相反合反应，并且具有不同的快速相速率常数0.56 s-1和0.35 ^s-1。此外，我们表明，大肠杆菌中Spinach2荧光激活的细胞动力学仍然足够快，可以在分钟时间尺度上实现准确的采样频率。这些分析荧光活化动力学的方法适用于已开发的其他荧光RNA适配体。

荧光反应是产生荧光信号的化学反应。荧光RNA适配体通常通过结合小分子染料来提高其荧光量子产率来执行此功能（图1A）¹。已经开发了不同的荧光RNA适配体系统，由特定的RNA适配体序列和相应的染料配体¹组成。荧光RNA适配体已作为荧光标签附加到RNA转录本中，可实现mRNA和非编码RNA²，^3，4的活细胞成像。它们也被放置在启动子序列之后作为基因表达的荧光报告基因，类似于使用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，只是报告功能在^{RNA水平5，6}。最后，荧光RNA适配体已被掺入基于RNA的荧光生物传感器中，其设计用于响应特定的小分子触发荧光反应。基于RNA的荧光生物传感器已被开发用于各种非荧光代谢物和^{信号分子的}活细胞成像7，⁸，⁹，^10，11。

人们越来越关注荧光RNA适配体的开发，以可视化RNA定位，基因表达和小分子信号的动态变化。对于这些应用中的每一个，都需要获得实时测量，但测量的准确性取决于荧光反应的动力学是否快于采样频率。在这里，我们描述了使用配备样品进样器的酶标仪确定荧光RNA适配体Spinach2 12和Broccoli¹³的体外动力学的方法，并使用流式细胞仪确定在大肠杆菌中表达的Spinach2的细胞开启动力学的方法。之所以选择这两种RNA适配体，是因为它们已被应用于研究RNA定位²，³，^4，它们已被^{用于报告5}，⁶和生物传感器⁷，⁸，⁹，10，11^，并且相应的染料配体（DFHBI或DFHBI-1T）已上市。表1⁴，^13，14给出了文献中确定的它们的体外特性的摘要，这为方案开发提供了信息（例如^，使用的波长和染料浓度）。这些结果表明，受RNA适配体影响的荧光反应是快速的，不应妨碍所需细胞生物学应用的准确测量。

1. 体外 动力学实验

1. 通过PCR制备DNA模板
   1. 设置PCR反应:要制备PCR反应，请将以下试剂合并到薄壁PCR管中:
      33 μL 双蒸水 （ddH₂O）
      10 μL 5x 缓冲液，用于高保真 DNA 聚合酶
      5 μL 脱氧核糖核苷三磷酸 （dNTP） 各 2 mM
      0.5 μL 40 μM 正向引物
      0.5 μL 40 μM 反向引物
      0.5 μL （10-100 ng） DNA 模板（仅适用于菠菜2 PCR;西兰花底漆重叠）
      0.5 μL 高保真 DNA 聚合酶（最后添加）
      注意:合成寡核苷酸通常干运。要制备储备溶液，请加入已知体积（推荐 100 μL）的 ddH₂O，并测量该溶液的 A₂₆₀ ，以根据比尔定律确定浓度，其中消光系数可以通过最近邻规则在线计算。然后，该储备溶液可用于制备适合PCR的稀释液。
   2. 运行热循环仪协议。
      1. 使用以下热循环仪方案扩增全长菠菜2和西兰花DNA模板:
         初始变性:98°C2分钟
         35 个周期:
         变性:98°C变性15秒
         退火:72°C30秒
         延长:72 °C 持续 30 秒
         最终延伸:72°C5分钟。
      2. 反应后，用2%琼脂糖凝胶和低分子量分子量标准（大小范围:25-766个核苷酸）分析少量等分试样，以确认所需DNA产物的存在。
      3. 通过市售凝胶提取或PCR纯化试剂盒纯化产品，并用ddH₂O或制造商提供的缓冲液洗脱。
         注意:选择PCR净化试剂盒时，请确保柱分子量截止值足够低以保留T7-西兰花（81个核苷酸），否则PCR产物将丢失。
         注意:可选的暂停点:将DNA储存在-20°C。
2. 通过 体外 转录（IVT）制备菠菜2和西兰花RNA
   1. 设置转录反应。
      1. 要制备 100 μL 转录反应，请将以下试剂合并到 1.5 mL 微量离心管中:10 μL 10 x 转录缓冲液 + 20 μL 10 mM 核糖核苷三磷酸 （rNTP） + 1-64 μL DNA 模板（共 1 μg）+ 2 μL 无机焦磷酸酶 + ddH 2 O 至 98 μL +₂μL T7 RNA 聚合酶（最后添加）。
      2. 将该反应在37°C孵育4小时。 加入 100 μL 2x 尿素凝胶上样缓冲液 （2x ULB），由 20% 蔗糖、0.1% 十二烷基硫酸钠 （SDS）、1x 三硼酸盐-EDTA （1x TBE） 缓冲液和 ~18 M 尿素组成，淬灭反应。
         注意:可选的暂停点:将淬灭的反应储存在-20°C。
3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化RNA的
   1. 菠菜2和西兰花RNA的PAGE纯化
      注意:非聚合（液体或粉末）丙烯酰胺具有剧毒。如果称出丙烯酰胺粉末，请在通风橱中称量。始终穿戴适当的防护设备，并立即摘下被丙烯酰胺粉末或溶液污染的手套，彻底洗手。如果丙烯酰胺与皮肤直接接触，请用肥皂和水清洗暴露区域至少15分钟。如果丙烯酰胺直接接触眼睛，请用水冲洗15分钟。
      1. 准备PAGE凝胶:要从全长产品中去除不需要的流产转录本和未反应的rNTP，请制备6%尿素聚丙烯酰胺凝胶。通常，28 cm x 16.5 cm x 1.5 mm凝胶可与8孔梳子一起使用。设置凝胶和电泳设备，使用1x TBE缓冲液填充储液槽。
      2. 在PAGE凝胶中上样RNA样品:每泳道进行一次200 μL淬灭反应，上样凝胶。在单独的泳道中，用跟踪染料二甲苯氰和溴酚蓝加载2x ULB，它们在凝胶中分别以106个核苷酸和26个核苷酸迁移，分别为¹⁵。在每个样品之间留出一条空通道，以避免后续步骤中的潜在污染。
      3. 运行PAGE凝胶:要将95-nt菠菜2和49-nt西兰花与其各自的截短产物分离，请在25 W下运行凝胶1.5-2小时，此时溴酚蓝染料将迁移~凝胶长度的~5/6。
      4. 可视化PAGE凝胶中的RNA样品:拆卸凝胶周围的玻璃板，并在两面用保鲜膜覆盖凝胶，在包装上标记泳道。通过在紫外线下将包裹的凝胶放在荧光TLC板上，通过UV阴影在暗室中可视化RNA条带。用记号笔快速勾勒出与产品对应的RNA条带的边缘，并关闭紫外线灯，以尽量减少紫外线照射造成的损害。
      5. 从PAGE凝胶中切除并提取RNA样品:每个样品用新鲜的剃须刀片，切除所需的产物条带，切成~1 mm立方体，然后将凝胶块加入带有500 μL压榨浸泡缓冲液的2 mL微量离心管中，以在室温（RT）下或在4°C下在旋转器上提取RNA2小时或过夜。
         注意:可选的暂停点:样品可以储存在-20°C。
      6. 沉淀核糖核酸
         1. 为了在缓冲液中从提取的RNA中分离凝胶块，将样品在4°C下以13，000× g 离心20分钟，然后使用窄头移液管提取上清液并将其加载到新的2 mL微量离心管中。
         2. 要沉淀RNA，加入1.5 mL冰冷乙醇和1 μL 20 mg/mL糖原，涡旋，并在-20°C或-80°C下储存至少1小时。
            注意:可选的暂停点:RNA可以在-20°C下储存几个月。
      7. RNA沉淀物的收集:通过在4°C下以13，000× g 离心20分钟来沉淀沉淀的RNA。 除去上清液，让剩余的乙醇在露天（~1小时）下蒸发，然后将沉淀重悬于30μL的ddH₂O或1x TE缓冲液中。
         注意:此过程通常导致最终RNA浓度为~10μM。
         注意:可选的暂停点:RNA样品可以在-20°C下储存几个月。
   2. 确定RNA储液浓度。
      1. 准备用于水解反应的RNA等分试样。
         1. 为了进行该测定，首先，使用紫外可见纳米分光光度计测定原液RNA样品的A₂₆₀ ，并将样品稀释的等分试样在ddH₂O中稀释至~10吸光度单位（AU）。
         2. 在 0.5 mL PCR 管中制备以下反应:稀释至 ~10 AU 的 16 μL ddH 2 O + 2 μL 10x Na₂CO₃ 缓冲液 +₂μL RNA 等分试样。将反应在95°C孵育90分钟，然后使其冷却至室温。
      2. 使用核苷酸吸光度测定RNA浓度:用紫外/可见纳米分光光度计测量该样品的A₂₆₀ ，并使用以下公式计算RNA浓度:
         
         其中c是RNA的浓度，b是路径长度，i是特异性核苷酸（A，C，G，或U），n i是RNA序列中核苷酸i的频率，ε i是核苷酸_i的摩尔消光系数。要确定原始储备RNA浓度，请将c乘以稀释因子。
         注意:可选的暂停点:RNA可以在-20°C下储存几个月。
4. 正在执行 in vitro 酶标仪动力学测定
   1. 设置 RNA 复性程序:通过多次选择创建新程序>添加新阶段>添加新步骤以添加以下每个步骤来创建以下热循环仪实验方案:
      70°C3分钟
      65 °C 持续 45 秒
      60 °C 持续 45 秒
      55 °C 持续 45 秒
      50 °C 持续 45 秒
      45 °C 持续 45 秒
      40 °C 持续 45 秒
      35 °C 持续 45 秒
      30 °C 持续 45 秒
   2. 变性RNA:要使菠菜2和西兰花RNA复性，请在0.5 mL薄壁PCR管中制备2 μM每种RNA的2μM储备液，然后加入等体积的2x复性缓冲液（80 mM HEPES，pH 7.5 [KOH]，250 mM KCl，6 mM MgCl₂）制成1μM RNA溶液。将试管添加到热循环仪中，打开保存的复性程序，然后按运行。
      注意:如果没有热循环仪，可以将RNA在70°C加热块上孵育3分钟，然后在工作台上缓慢冷却至RT。
   3. 制备结合反应缓冲液:要制备用于一种适配体-染料结合反应的缓冲液，请制备含有缓冲液组分（69.5 μL ddH 2 O + 4 μL 1 M HEPES，pH 7.5 [KOH] + 6.2 μL 2 M KCl + 0.3 μL 1 M MgCl₂）的预混液。根据所需的样本和重复数量，将这些值乘以样本数加一。通常，每个RNA样品重复三次是令人满意的。
   4. 准备读板器。
      1. 设置酶标仪进样器程序:在荧光酶标仪上，选择温度并将所需温度设置为37°C，确保 温度 已平衡到该值，然后再开始动力学实验。打开酶标仪软件，选择 设置>采集视图，然后输入以下程序进行动力学测量:
         回路:对于每个孔
         基线设置:60 个基线读数
         智能进样设置:10 μL 进样（将在基线读数后发生）
         荧光（或FL）读数为:
         激发波长:448 nm（带宽:9 nm）
         发射波长:506 纳米（带宽:15 纳米）
         墨盒:单声道 （s/n 3297）
         定时:
         总阅读时间:10分钟
         读取间隔:0.5 s
         光电倍增和光学元件:每次读取 6 次闪光
         循环:下一口井
      2. 准备注射器
         1. 清洗并吸出进样器:要准备酶标器进样器，首先选择在读板器上 注射 ，根据指示向读板器提供废物收集板，然后选择 洗涤，并按照酶标仪上的说明用 1 mL 体积的 ddH₂O、75% 乙醇在 ddH₂O 中清洁进样管， 然后是_{ddH 2}O。接下来，选择 吸出，允许注射器喷射多余的液体。
         2. 注满进样器:退出上一个屏幕后，选择 Prime 以用两个260 μL体积的配体注注进样器，以确保在实验过程中将纯、浓缩的配体添加到样品中 - 在这种情况下，在ddH₂O中用100 μM DFHBI灌注。
   5. 进行 体外 动力学实验:要进行一项动力学实验，首先将 80 μL 先前制备的结合缓冲液预混液加入 96 孔透明底板的一个孔中，然后加入 10 μL 变性 RNA。让该板和进样器中的DFHBI溶液在读板器中平衡至37°C15分钟。
   6. 在读取区域下的酶标仪软件设置中，选择要分析的孔，然后在"主页"选项卡下，选择"运行"以执行前面描述的动力学程序。重复此过程，直到所有实验完成。
      注意:至关重要的是，动力学实验应一次进行一个孔，以确保在重复和样品之间的相同条件下测量RNA动力学。
   7. 清洗进样器:要从进样管中除去剩余的DFHBI溶液，请按照步骤1.4.4.2.1中所述用1mL体积的ddH 2 O，75%乙醇在ddH₂O中洗涤进样管，然后用ddH₂O洗涤。
      注意:可选暂停点。
5. 荧光RNA适配体 外动力学分析 。
   1. 将数据输入分析软件:将实验数据导出为电子表格，以便轻松复制数据进行处理。在分析软件中，创建一个 XY 格式的新数据表。在 X 列中，输入每个读数时间点，其中 t = 0 是 DFHBI 注入的时间。在Y列中，输入从t = 0开始的相应时间点重复之间的平均荧光值。
   2. 归一化和绘制数据图表:要归一化荧光值，请单击 "分析>数据处理">"归一化"，然后单击" 确定"。选择使用数据集的最小值和最大值进行归一化，将结果显示为分数，并绘制 结果图表，然后单击" 确定"。要创建一段时间内归一化平均荧光的图形，请单击 [数据集名称] 的归一化 图标，然后选择 图形族: 仅带点的 XY。
      注意:在绘制少量时间点的情况下，查看误差线可能很有用。如果需要这些，在选择 XY 格式数据表时，选择"Y"下的选项以在并排列中输入复制值。使用选定的默认选项绘制生成的表将生成带有误差线的图形。
   3. 执行曲线拟合以获得动力学参数:要将曲线拟合到动力学数据，请单击分析>分析数据，然后在 XY 分析选项卡下选择非线性回归（曲线拟合）。在"模型"选项卡下，单击"指数>两相关联"，使用以下两相关联方程拟合动力学数据:
      
      其中Y是时间X处的荧光，Y 0是t = ₀时的荧光，K快和K慢分别是快速率和慢速常数，SpanFast和SpanSlow分别是由_快速率和_慢速率引起的荧光开启范围（参见代表性结果，图1）。单击"Nonlin 拟合"选项卡以查看速率常量、t_1/2 值和快速百分比值。
      注意:为了获得所有这些值的标准偏差，可以采用与上述相同的方式处理单个酶标仪实验重复。

2. 细胞动力学实验

1. 大肠杆菌菌株的制备
   1. 按照制造商的方案，用 ~100 ng 的 pET31b tRNA-Spinach2 构建体转化 BL21 星 （DE3） 大肠杆菌 细胞。
      注意:质粒构建体是市售的（质粒#79783）。
   2. 将细胞接种在含有羧苄青霉素（碳水化合物:50mg / mL）平板的LB琼脂上，并在37°C下孵育12-16小时。含有质粒的细胞将在平板上以菌落的形式生长。
      注意:可选的暂停点:板上转化的BL21星形细胞可以在4°C下用封口膜包裹1周。
2. 生长细胞并诱导荧光RNA适配体的表达
   1. 用转化的 BL21 Star 细胞的单个菌落接种含有羧苄青霉素（碳水化合物:50 mg/mL）的非诱导培养基 （NI） 的 2 mL 培养物。重复此操作至少三个生物学重复。将培养物在37°C的培养箱/摇床中以250rpm孵育22-24小时。
      注意:可选的暂停点:在NI培养基中生长的细胞保留质粒，可以在4°C下储存1周。
   2. 在NI培养基中生长后，将培养物稀释100倍到含有羧苄青霉素（碳水化合物:50 mg/mL）的新鲜3 mL ZYP-5052自动诱导培养基（AI）中。在37°C的培养箱/振荡器中以250rpm培养细胞16-18小时以诱导表达。
      注意:培养物的典型OD₆₀₀ 在生长18小时后的范围为2.0-3.3。最佳细胞密度范围在2.5-3.0之间。
3. 进行细胞动力学实验
   1. 设置流式细胞仪。
      1. 打开流式细胞仪和连接到仪器的计算机。登录流式细胞仪软件后，在" 仪器 "选项卡下，单击 "启动 "图标。按照软件屏幕上指示的步骤操作，以确保正确初始化仪器。
         注意:某些流式细胞仪将仪器启动序列称为 启动。确保遵循制造商关于将用于实验的流式细胞仪的方案。
      2. 运行性能测试（如果适用）。在 主菜单 选项卡下，单击 性能测试。在培养管中，将三滴制造商的性能跟踪珠加入 3 mL 聚焦液中。
      3. 将培养管放入样品管升降器中并抬起升降管。在单击"运行性能测试"之前，请确保跟踪微珠管的批次#与"性能测试设置"屏幕上指示的内容相同。单击"性能测试"以运行测试。
      4. 使用以下单细胞荧光采集参数为本实验设置流式细胞仪软件:
         激发激光:488 nm
         发射通道:GFP（也称为FITC）
         采集体积:40 μL（总抽吸体积为 90 μL）
         流速:200 μL/分钟
         每次测量的细胞计数:30，000
         仪器设置:
         电压:
         FSC: 480 V
         固态继电器: 400 V
         BL1: 540 V
         BL2: 392 V
         BL3: 422 V
   2. 设置实验文件。
      1. 在"实验资源管理器"选项卡中，通过右键单击流式细胞仪用户名创建新的实验文件。在下拉窗口中选择"新建实验"。当计算机屏幕上弹出一个新窗口时，选择"确定"。
      2. 在新实验文件中，右键单击"组"文件夹，然后选择 添加新样品管。标记每个特定时间点的样品管，并通过右键单击 样品 并在下拉菜单中选择 重命名 进行复制。对研究预期时间过程的重复总数和时间点重复此步骤。
   3. 制备稀释的细胞溶液:在新培养管中，加入 1.5 mL 的 1x PBS 溶液。接下来，将 AI 培养基中的 3 μL 诱导细胞添加到 1x PBS 溶液中，制成稀释的细胞溶液。对不同培养管中的每个生物重复重复此步骤。
   4. 测量细胞的背景荧光:在添加染料之前，读取每个生物复制培养管，其中包含1x PBS溶液中的细胞。这是为了测量细胞的荧光背景，以观察添加染料后折叠随时间推移而打开。
      1. 要读取读数，请将培养管放入样品管升降器中，然后用手将提升器抬高到样品注射针上。在 "收集面板 "选项卡中选择正确的示例文件，然后单击" 记录"。
      2. 运行完成后，用手用培养管降低样品管升降器。这将启动一个冲洗步骤，该步骤将 冲洗 流体系统并最大限度地减少每个生物重复样品之间的残留。运行完成后，数据将自动保存到计算机中。
      3. 重复2.3.4中的步骤以测量至少三次生物学重复的细胞荧光背景。要移动到下一个样本文件，请单击 "记录 "图标下方样品管名称附近的右箭头图标来选择下一个样本文件。
   5. 用染料在时间点测量细胞的荧光。
      1. 将 1.4 μL 浓缩染料储备液（DMSO 中的 50 mM DFHBI-1T 溶液）加入 1x PBS 溶液中，得到 50 μM DFBHI-1T 的终浓度。接下来，盖上培养管盖，然后将培养管倒置3x-5x以在获取第一个时间点读数之前均匀混合溶液。
         注意: 大肠杆菌 培养管中DMSO的总百分比不应超过10%，因为这会影响细胞活力¹⁶。
      2. 取下盖子并将培养管放入样品管提升器中。用手将支架举到样品进样针上，然后在正确的样品文件下，单击 "记录" 图标。此外，通过按"开始"进行实验来 开始 计时器。
      3. 运行完成后用手放下管升降机，重复步骤2.3.5.1-2.3.5.2。（计时器运行）通过加入 1.4 μL 浓缩的 DFHBI-1T，倒置培养管，并读取所有剩余的生物学重复。这些第一次记录将是所有生物学重复在0分钟获得的读数。对于每个生物重复，一次做一个。
         注意:记下按下记录流式细胞术采集的时间。在实验过程中坚持这个时间错开时间点。
      4. 通过将样品管提升器中的培养管升高到样品进样针，选择适当的样品文件 ，单击记录，并在每次运行完成后手动降低提升器来继续读取读数。对正在测试的所有其他时间点和生物学重复执行此操作。重复这些步骤，直到实验完成。
         注意:用铝箔覆盖样品，使样品远离光线，以避免DFHBI-1T在溶液中光漂白。
   6. 在时间点测量没有染料的细胞的荧光（对照）。
      1. 在按照制造商的方案再次使用阴性对照重复实验之前，为流式细胞仪运行适当的清洁方案。这样做是为了尽量减少从先前实验到对照时间点分析实验的任何残留。以下是两次实验之间流式细胞仪的步骤:
         1. 用手将空培养管放入试管升降器中，抬起试管支架，然后单击仪器选项卡中的疏通图标。这将在流体系统中运行反冲洗以清理任何粘性样品。用手降低管架，并在疏通序列完成后取出管子。
         2. 使用新的培养管，加入3 mL的10%漂白剂溶液，将培养管放入管架中，然后用手将支架抬高到样品注射针上。此外，如果适用于流式细胞仪，将干净的 96 孔板放入自动进样器中。
         3. 单击消毒 SIP/消毒自动进样器 SIP 图标，在整个流体系统中运行含有 10% 漂白剂的清洁序列。降低管架以完成清洁顺序。
      2. 按照步骤 2.3.3 中的说明设置控制时间点分析运行的示例文件。
      3. 在新的培养管中，在 1.5 mL 的 1x PBS 溶液中制备稀释的细胞溶液。将 AI 培养基中的 3 μL 诱导细胞添加到 1x PBS 溶液中，制成稀释的细胞溶液。对每个生物重复重复此步骤。
      4. 将 1.4 μL DMSO 逐个加入培养管中，加入一个到带细胞的 1x PBS 溶液中，并测试相同的时间点。盖上培养管盖，然后在获取第一个时间点读数之前将培养管倒置3x-5x以均匀混合溶液。对于每个生物重复，一次做一个。
      5. 使用步骤2.3.5.2-2.3.5.4，遵循与染料细胞相同的方案分析对照细胞。
   7. 关闭流式细胞仪:按照制造商的协议正确关闭仪器。对于流式细胞仪，仪器准备通过以下方式关闭:
      1. 按照步骤2.3.6.1.1-2.3.6.1.3执行流式细胞仪的初始清洁方案。
      2. 用装有 3 mL 聚焦液的培养管用 10% 漂白剂溶液替换培养管。用手提起试管支架，然后在 关闭 图标下，单击下拉菜单并选择 彻底。
         注意:可选暂停点。
4. 流式细胞术数据分析
   1. 导出所有 FCS 文件进行分析。使用流式细胞术分析软件打开FCS文件。
   2. 使用仅单元 FCS 文件之一，从前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 点图（FSC-面积/SSC-区域）生成门，使用两个对数轴从碎片中排除任何信号。要创建此门，请单击流式细胞术分析软件上的 自动 门图标并将其命名 为门 1。将此门应用于数据处理工作区中 "所有 样本"选项卡下测试的所有样本。这将导致正在处理的所有 FCS 文件下方的 门 1 。
   3. 双击步骤 2.4.2 中使用的仅单元格 FCS 文件创建新的子集文件。将轴设置更改为 FSC 面积/FSC 高度，两者都使用对数轴。单击流式细胞术分析软件上的自动门图标以生成椭圆形 门 ，并将其命名 为Gate 2。将此门作为步骤 2.4.2 中门集下方的子集应用于所有测试样品。这将导致所有样本的 门 1 >门 2 与每个 FCS 文件相关联。
   4. 通过双击 门 2，创建另一个子集文件，其中在步骤 2.4.2 和步骤 2.4.3 中设置了两个门。将轴设置更改为 FSC 面积/直方图。将此直方图门作为子集应用于所有测试的样本，从而使所有样本都具有与每个FCS文件关联的 门1>门2>门2 。
      注意:直方图可以从 门 2 重命名为直方图，以帮助将 直方图 移动到布局窗口中，以及通过数据处理创建更多组织。
   5. 要分析平均荧光强度 （MFI） 值，请打开布局窗口。单击每个时间点的直方图门并将其拖动到布局窗口中。
   6. 对每个测试样本执行"∑平均值:BL1-A"（GFP）的统计分析，以在布局窗口中显示MFI结果。
   7. 计算至少三个独立生物学重复的每个时间点分析的MFI值的标准偏差。
   8. 通过将布局窗口导出为 PDF 文件来保存每个时间点的直方图和 MFI 值。
      注意:可选暂停点。
5. 流式细胞术数据图表
   1. 打开包含每个时间点的直方图和 MFI 值的 PDF 文件。MFI值将被复制到数据分析软件中。在数据绘图软件中，创建一个 XY 格式的新数据表。
      1. 选择此选项可创建已选择以下内容的 XY 表:
         数据表:在新表中输入或导入数据
         选项:
         X:已用时间
         Y:在并排子列中输入（三到四个）复制值
      2. 在 X 轴上标记实验和对照运行的所有时间点。
      3. 在A组中，将所有生物重复的MFI值输入到每个时间点，以便对添加染料的细胞进行荧光分析。
      4. 在B组中，将所有生物重复的MFI值输入到每个时间点，以分析未添加染料（DMSO）的细胞。
      5. 要观察结果，请单击图表选项卡下的 [插入数据集名称]。这将把数据点显示为平均值，误差线表示每个时间点的标准偏差（s.d.）。X 轴表示经过的时间，Y 轴表示 MFI 值。

体外 动力学
作为合成寡核苷酸购买的DNA模板和引物的序列如 表2所示， 试剂配方如 补充文件1所示。PCR扩增用于扩大带有T7启动子的DNA模板的量，这是随后的 体外 转录（IVT）反应所必需的。此外，PCR扩增可用于同一反应中的两个目的:通过引物延伸生成全长西兰花DNA模板，以及放大DNA模板。

在IVT反应合成RNA后，PAGE纯化将从全长RNA产物中去除任何不需要的截短转录本，降解产物和未反应的rNTP。这种类型的纯化是优选的，因为截短或降解的RNA会导致RNA浓度的不准确测定。由于核苷酸碱基吸收紫外线，凝胶上的RNA条带和rNTP可以在紫外下可视化为荧光TLC板的阴影。因此，可以选择性地提取对应于正确产品尺寸的条带。

最近邻方法高估了消光系数，因此高估了结构化RNA的浓度，因为它没有考虑由于碱基配对引起的低色素性¹⁷。因此，为了确定准确的RNA浓度，进行了中性pH热水解测定，将RNA水解为单个^NMP18。准确的消光系数计算为RNA序列中NMP的消光系数之和。

DFHBI与菠菜2和西兰花结合的动力学是使用酶标仪测定的。RNA首先被重新变性，以确保它处于正确的构象以进行染料结合。酶标仪动力学测定的反应条件包括40 mM HEPES，pH 7.5 （KOH），125 mM KCl，3 mM MgCl₂，100 nM变性RNA和10 μM DFHBI，并在37 °C下测定反应。 选择MgCl 2的温度和浓度来模拟生理条件¹⁹，尽管28°C和10mM MgCl₂的条件也可用于改善适配体折叠。

荧光适配体Spinach2和西兰花均显示出与DFHBI染料结合的两相缔合动力学（图2）。两种核酸适配体的两相缔合动力学数据拟合比单相缔合更好（补充图1）。快速和慢速关联的速率常数和t_1/2 值由最佳拟合曲线确定（表3）。还确定了PercentFast，它描述了更快的DFHBI结合RNA群体所占的荧光开启幅度的百分比。

处于结合能力状态的菠菜2显示出比西兰花更快的开启速度（t 1/2 = 1.2 s vs._2.0 s）。两种核酸适体的第二相动力学相似（t_1/ 2 = 180 s），并且可能对应于样品亚群的常见限速步骤（菠菜2和西兰花的PercentFast = 68%和60%）。总体而言，这些结果表明，折叠良好的菠菜2和西兰花适配体表现出非常快的开启动力学，在添加染料后1-2秒内初始半最大开启。

细胞动力学
克隆到pET31b质粒中的DNA构建体序列如 表2所示，试剂配方如 补充文件1所示。荧光RNA适配体的DNA构建体通常包含在用于细胞实验的tRNA支架内。BL21 Star （DE3） 大肠杆菌 菌株是一种表达菌株，其 RNase E 突变可增加 RNA 稳定性。

前45分钟每5分钟记录一次荧光时间点测量，然后在1小时，1.5小时和2小时记录读数，总共12个时间点加上仅细胞读数。最短时间间隔为5分钟，允许在每个时间点测量多个生物学重复，重复测量之间的规则间隔为30秒至1分钟。用于时程实验的1x PBS溶液稀释的细胞总体积为1.5mL。

在确定单细胞群的平均荧光强度（MFI）之前对细胞进行门控。门控在散点图上选择一个区域以确定要分析的细胞群。此过程可防止分析中包含任何碎片或多重读数。对于所示的流式细胞术分析，记录了30，000个事件，从而在设门后分析了10，000-20，000个事件。

细胞荧光动力学是染料扩散到 大肠杆菌 和染料结合动力学与细胞环境中RNA适配体的函数（图1B）。对于表达Spinach2-tRNA的细胞，观察到平均荧光强度（MFI）在"0"时间点立即增加，这是由于染料添加和样品分析之间的短时间滞后（以秒为单位）（图3A）。此外，细胞荧光在5分钟的第一个时间点已经达到其最大平衡MFI值（40，441±990）。相比之下，对照细胞显示低背景荧光（416），并且添加DMSO后MFI值没有变化（图3B）。有染料的细胞和没有染料的细胞之间的比较表明，细胞中的荧光活化是细胞中荧光活化±2的98倍。总体而言，这些结果表明， 在大肠杆菌 细胞中表达的Spinach2-tRNA表现出快速开启动力学，在添加染料后不到5分钟内具有最大开启动力学。

图1:荧光激活示意图。荧光活化发生在RNA适配体与体外染料分子（A）和细胞（B）结合时。请点击此处查看此图的大图。

图2:荧光适配体的体外动力学。通过两相缔合建模的荧光适配体（A，B）菠菜2或（C，D）西兰花的代表性体外动力学，t = 0 s是DFHBI添加的时间点（最终DFHBI浓度:10μM）。实验一式三份进行。所有误差线都表示与平均值的标准偏差。通过拟合，快速和慢缔合反应组分的t_1/2值均得到。请点击此处查看此图的大图。

图 3:tRNA 支架中菠菜 2 的代表性细胞动力学。 （A）tRNA-Spinach2染料在2小时内摄取的时间点分析。在添加DFHIB-1T或DMSO之前，仅采集细胞基线。前45分钟每5分钟取一次时间点，然后在1小时、1.5小时和2小时读取时间点读数。箭头表示何时将DFHBI-1T或DMSO添加到具有BL21星形细胞的1x PBS溶液中。用于分析的DFHBI-1T的最终浓度为50μM。对于DMSO对照，DMSO的添加量为用于DFHBI-1T染料添加的相同体积（1.4μL）。（B）用BL21星大肠杆菌细胞进行DMSO控制时间点分析的特写。平均荧光强度（MFI）表示使用染料或DMSO的BL21星形细胞的整体荧光读数。数据代表三个生物学重复的平均±标准差。请点击此处查看此图的大图。

表1:先前发表的菠菜2-DFHBI⁴，菠菜2-DFHBI-1T 13^，14和西兰花-DFHBI-1T¹³的光物理和生化特性。

表2:包含用于体外和细胞动力学研究的DNA序列和引物的DNA序列表。粗体= T7启动子;下划线 = tRNA 支架;帽子=菠菜2;小写 = 西兰花;粗斜体 = T7 终止符。

表 3:根据拟合数据得出的 Spinach2 和西兰花适配体的 体外 动力学值。 数据报告为三次重复的平均值±标准差。

补充图1:荧光适配体的代表性体外动力学。荧光适配体（A，C）菠菜2或（B，D）西兰花的代表性体外动力学，在（A，B）600秒或（C，D）20秒测量时间内通过单相缔合建模，箭头表示DFHBI添加的时间点（最终DFHBI浓度:10μM）。实验一式三份进行。总体而言，当监测荧光信号的时间较长时，单相关联模型与两相关联模型的拟合度较低。请点击此处下载此文件。

补充文件1:体外动力学实验的配方。请点击此处下载此文件。

对于体外动力学实验，可以修改相同的通用方案以测量含有配体结合域和荧光团结合结构域^的基于RNA的荧光生物传感器的体外动力学8。在这种情况下，RNA应在注射配体后进行测量之前与荧光团一起孵育，以获得配体反应动力学。如果在重复之间观察到高变异性，则可以通过在测量前检查每个样品是否允许在96孔板中平衡相同的时间来排除故障。每个样品或重复样品应在孔中单独制备，并在15分钟平衡步骤后立即测量，而不是一次制备所有样品。

对于细胞动力学实验，可以修改方案以缩短或延长时间过程，但计划生物学重复次数并调整所需的细胞溶液体积至关重要。建议将每个生物重复读数间隔在30秒至1分钟之间，以便有足够的时间仔细执行这些步骤。另一种修改是测试一种不同的荧光染料，该染料不结合RNA适配体作为替代阴性对照，其不应在背景上显示荧光活化。如果观察到不一致的结果，可以通过检查流式细胞仪是否按照制造商的方案在不同实验运行之间进行正确清洁来进行故障排除，以防止细胞或染料从上一次运行到下一次运行的任何渗漏。

虽然所介绍的 体外 方法可用于比较荧光适配体或基于RNA的荧光生物传感器之间的动力学，但获得的动力学值可能会根据温度、镁浓度或所使用的其他缓冲液组分而变化。此外，虽然该方法提供了以前用于表征不同荧光RNA系统的明确定义的条件，但由于其他生物大分子的存在，细胞内环境无法完美表示。

虽然配备可编程进样器的荧光酶标仪没有用于数据采集的死区时间，但由于可观察到的死区时间，流式细胞仪仪器的时间精度有限。单击"记录"按钮和开始数据采集之间存在~5 s的延迟。仪器测量 30，000 个事件时会出现额外的 ~5 s 滞后;该样品采集时间会略有不同，具体取决于细胞在 1x PBS 中的稀释程度。

细胞实验的另一个潜在限制是1x PBS中的细胞活力。对于延长的时间点分析，可以使用碘化丙啶对死细胞进行染色²⁰来检查细胞活力。染料聚集也会限制流式细胞仪荧光测量的准确性。在水溶液中溶解度非常有限的染料可以聚集并显示为足够大的颗粒，可以在流式细胞仪上计数为细胞。因此，重要的是运行纯染料实验对照以检查门控区域中的聚集体。

先前，研究表明，西兰花在体外1 mM Mg²⁺时具有与菠菜2相当的亮度，但与菠菜2-tRNA¹³相比，西兰花-tRNA在活大肠杆菌中的荧光强度高~两倍。据我们所知，Spinach2和西兰花荧光适配体的染料结合动力学以前没有被比较过，也没有通过两相关联进行建模。两种RNA适配体的初始快速速率常数都支持染料结合口袋是预先折叠的，染料结合不需要结构变化，这与X射线晶体学和紫外熔融实验一致^21，22。具有较慢速率常数的第二阶段以前没有报道过，因为其他实验（例如停止流动和荧光寿命测量）分析了菠菜适配体的较短持续时间（20 s和300 s）^23，24。当分析数据600秒时，慢得多的第二阶段导致观察到的荧光双指数增加。这个缓慢的步骤可归因于从结合不适应型到结合能力RNA状态的限速复性步骤，或从结合染料的反式到顺式形式的限速光转换步骤。后一种机制先前被建模为给出双指数荧光谱²⁴，并且最近对相关适配体小菠菜²⁵的吸收和激发光谱之间的差异的分析支持。 

体外发现的总体意义在于，它们表明染料与荧光RNA适配 体 的关联并不限制实时RNA定位和基因表达研究。对于采用Spinach2的基于RNA的荧光生物传感器，测量的开启动力学与此处测量的第二相动力学相似¹⁰ ，因为生物传感器需要重新折叠步骤，因此应该足够快以实现近乎实时的信号传导研究。

预计细胞动力学将与观察到的菠菜2体 外 动力学不同。一个关键的区别是染料扩散到 大肠杆菌 细胞中还有一个额外的步骤，涉及穿过外膜和内膜。此外，细胞环境在分子拥挤、离子组成和浓度以及 RNA 和染料浓度方面为染料-适配体结合提供了不同的条件。

结果的总体意义在于细胞荧光在不到5分钟的时间内达到最大信号并保持稳定至少2小时，这使得在该时间范围内能够进行实时RNA定位和基因表达研究。对于采用Spinach2的基于RNA的生物传感器，我们之前表明，在配体添加后4-5分钟内可以观察到显着的荧光反应，但达到最大信号需要更长的时间（15-30分钟）⁸。综上所述，这些发现表明染料扩散到细胞中并不是使用基于RNA的生物传感器进行 体内 实验的实际限速步骤。最后，该实验方案可用于分析细胞中的其他荧光RNA系统。

这里介绍的实验方案可用于分析其他荧光RNA系统。除了本研究中分析的两种适配体Spinach2和Broccoli之外，还开发了其他荧光RNA系统，可提供不同的发射曲线，改善的光稳定性，更紧密的结合亲和力以及改变荧光团的能力（^{最近审查1}）。除了荧光特性外，对这些系统的体 外 和细胞开启动力学进行基准测试对于评估其对不同细胞生物学应用的适用性非常重要。结果还可以支持适配体的结构预折叠或重排。如前所述，经过一些修改，这些协议也已应用于分析基于RNA的生物传感器⁸。

作者声明不存在利益冲突。

这项工作得到了MCH的以下资助:NSF-BSF 1815508和NIH R01 GM124589。MRM得到了NIH T32 GM122740培训资助的部分支持。