使用鸡胚胎作为评估发育性心脏病的有力工具

鸡胚胎作为一种经典的发育模型，在我们的实验室中用于评估接触各种环境污染物后的发育性心毒性。本手稿中介绍了暴露方法和建立的形态/功能评估方法。

鸡胚胎是发育研究的经典模型。在鸡胚胎发育过程中，对心脏发育的时间窗口进行了明确的界定，通过多种方法实现精确、及时的暴露相对容易。此外，鸡胚胎中的心脏发育过程与哺乳动物相似，也产生了四室心脏，使其成为评估发育性心毒性的宝贵替代模型。在我们的实验室中，鸡胚胎模型经常用于评估接触各种环境污染物后的发展性心毒性，包括单氟烷基物质和多氟烷基物质（PFAS）、颗粒物（PMs）、柴油排气（DE）和纳米材料。暴露时间可以根据需要自由选择，从发育开始（胚胎日 0，ED0）一直到孵化前一天。主要的暴露方法包括空气细胞注射、直接微注射和空气细胞吸入（最初在我们的实验室中开发），目前可用的终点包括心脏功能（心电图）、形态学（组织学评估）和分子生物学评估（免疫造血化学、qRT-PCR、西式印迹等）。当然，鸡胚胎模型也有其自身的局限性，例如抗体的可用性有限。然而，随着越来越多的实验室开始利用这一模型，它可以用来为发展性心毒性的研究作出重大贡献。

鸡胚胎是一种经典的发育模式，已使用两百多年^。与传统模型相比，鸡胚胎模型具有多种优点。首先，早在70多年前，鸡胚胎的正常发育就已在汉堡-哈密尔顿分期指南²中得到了非常清晰的说明，其中共确定了鸡胚胎发育过程中的46个阶段，具有精确的时间和形态特征，便于检测异常发育。此外，鸡胚胎模型还有其他特点，如成本相对较低，数量多余，暴露剂量控制相对准确，壳内有一个独立的封闭系统，以及容易操作发育中的胚胎，所有这些都保证了其作为强大的毒理学评估模型的潜力。

在心毒性方面，鸡胚胎具有四室心脏，类似于哺乳动物心脏，但壁较厚，更容易进行形态评估。此外，鸡胚胎允许发育吸入暴露，这在哺乳动物模型中是不可能的:在发育的后期阶段，鸡胚胎将从内部呼吸过渡到外部呼吸（通过肺部获得氧气）:后者要求胚胎用嘴穿透空气细胞膜，并开始呼吸空气^3，使空气细胞成为一个小型吸入室。利用这一现象，可以评估气体污染物对心脏（和其他器官）的毒理作用，而无需专门的吸入室仪器。

在这篇手稿中，介绍了几种暴露/终点评估方法，所有这些方法都有助于使鸡胚胎成为评估接触环境污染物后发展性心毒性的有力工具。

所述的所有程序均由青岛大学动物保护与使用委员会（IACUC）批准。在我们的实验室里，卵子被孵育在两个孵化器里。鸡蛋直立在孵化器里，随机放在货架上。卵子的孵化条件如下:孵化温度从37.9°C开始，随着孵化的进行逐渐下降到37.1°C:湿度从 50% 开始，逐渐增加到 70%。

1. 曝光方法

注:通过多种方式将环境污染物暴露在鸡胚胎中。在本节中，详细描述了三种常规使用的方法。

1. 空气电池注射 （图1）
   注:这是鸡胚胎^4，5，6的经典暴露方法，适合广泛的材料，并可以在一个非常宽的时间窗口进行，从发育开始（胚胎天零，ED0）一路到孵化前一天（ED20）。向日葵油用作车辆。先前的研究表明，未经治疗的胚胎和注射向日葵油⁷的胚胎之间没有观察到死亡率、孵化能力或体重的重大变化。
   1. 准备以下必要的试剂/工具:75%乙醇、纸巾、金属探头（可以用任何锋利的金属针/棒/awl替代）、融化的石蜡、刷子、碘化物溶液、移液器、移液器尖、罐装灯、剂量混合物。准备剂量混合物与葵花籽油（推荐^）4。要使用其他稀释剂，执行车辆控制（与未经处理的胚胎相比）。
   2. 用碘化物溶液（商业上可用的碘化物溶液1:5用去离子水稀释）清洁鸡蛋表面，用纸巾浸干蛋壳，不擦洗。擦洗会打破外壳外层的保护层。
   3. 在黑暗的房间里蜡烛鸡蛋，用铅笔标记空气电池。排除壳上有裂缝的鸡蛋。排除侧面有空气细胞而不是钝尖的卵子，因为这些卵子不太可能正常孵化。
   4. 用75%的乙醇对空气细胞区进行消毒，然后用金属探头在空气细胞区中心钻一个小洞。不要将探针深入空气电池或内膜可能损坏，而只需用探针尖端击碎外壳。如果孔不够大，无法安装在细移液器尖端，请在现有孔附近再次打破外壳，直到孔足够大，允许插入 10 μL 移液器尖端。
   5. 大力调剂混合物，并立即绘制移液器尖端的溶液。建议的注射量为每10克鸡蛋1微升（例如，50克鸡蛋的5微升注射量），因为较大的注射量可能会为发育中的胚胎创造缺氧或缺氧的条件。计算所需毫克/蛋公斤剂量剂量溶液的浓度。
   6. 将移液器尖端插入孔中，尖端接触内膜。慢慢弹出剂量混合物，保持至少十秒钟（让粘性油完全分配），然后取出尖端。
   7. 用刷子和一滴融化的石蜡封住这个洞。小心不要将融化的石蜡滴到内膜上。
   8. 一旦密封，将卵子放在孵化器中，直到它们达到所需的胚胎阶段。对已经发育的胚胎，尽快进行全过程，防止因环境温度低而造成胚胎可能流失。
2. 微投影 （图2）
   注:这是一种更直接的暴露方法，可确定接触感兴趣的物质，尤其适用于行动时间短的化合物（如伦蒂病毒），因为经典的空气细胞注射需要时间让化合物穿透内膜。如果不能通过空气细胞注射达到令人满意的结果，也可以尝试这种方法。这种方法最适合早期胚胎（至ED2），但也可用于较老的胚胎（胚胎丧失风险较高）。
   1. 准备以下必要的试剂/工具:75%乙醇、碘化物溶液、微型喷油器（5 μL）、金属探针（可以用任何锋利的金属针头/棒/awl代替应工作）、细钳、胶带。将剂量混合物与无菌盐水一起准备，这也可作为注射控制，而不会显著影响孵化性。确保盐水的不育性，因为受污染的注射将显著增加死亡率。
   2. 按照 1.1.2 中描述的清洁鸡蛋。
   3. 蜡烛鸡蛋，如1.1.3所述。
   4. 用75%的乙醇对空气细胞区进行消毒，然后用金属探头在空气细胞区中心钻一个小洞。不要将探针深入空气电池或内膜可能损坏，而只需用探针尖端击碎外壳。然后使用细钳小心地放大孔，直到直径约为2毫米，从而对内膜进行视觉确认。
   5. 将溶液加载到微喷射器中（最大注射量:0.5 μL/10 g 鸡蛋）（例如，2.5 μL 表示 50 克鸡蛋），并小心地将针头穿过孔插入内膜约 2-3 mm。轻轻地分配溶液并取下针头。保持针头尽可能垂直于膜。
   6. 用一小块胶带封住这个洞。完全覆盖孔，以防止胚胎脱水和死亡在随后的孵化。然而，避免磁带片太大，以防止缺氧。
   7. 一旦密封，将卵子放在孵化器中，直到它们达到所需的胚胎阶段。对已经发育的胚胎，尽快进行全过程，防止因环境温度低而造成胚胎可能流失。
3. 空气细胞吸入 （图3）
   注:这是一种利用空气细胞的新型吸入方法，晚期鸡胚胎将从中开始呼吸空气。它适用于气体或气溶胶暴露，并可能实现非常早的吸入暴露，并在肺部填充目标气体/气溶胶时，他们第一次打开在生活中。
   1. 准备以下必要的试剂/工具:取样袋（PVF袋，用于暴露前储存气体/气溶胶样品）、导管针、注射器、金属探头（可以用任何锋利的金属针/棒/awl代替应工作）、胶带、烟气罩。
   2. 清洁1.1.2中描述的卵子，并在1.1.3中用蜡烛（在孵化前无需标记空气细胞），然后在ED17之前未经处理孵卵。
   3. 在ED17蜡烛鸡蛋，以标记空气细胞区。
   4. 在ED18，从孵化器中取出一个卵子，用75%的乙醇消毒空气细胞区域，然后小心地在空气细胞的两侧钻两个小孔。一个是气体/气溶胶的注入，另一个是排出空气。小心地控制孔的大小，使注射孔的大小足以插入导管针，而排出孔的直径稍大一些（约 1 毫米）。
   5. 用连接到导管针头的注射器轻轻注射 10 mL 的目标气体/气溶胶。为吸入控制组注入空气，该组与负控制组⁸没有显著差异。对导管针施加压力（弹性针可以按在外壳上施加适当压力），以尽量减少注射孔的泄漏。之后立即用胶带密封两个孔，并将卵子返回孵化器。
      注:此程序应在烟气罩中执行，以防止操作员吸入气体/气溶胶。
   6. 一小时后重复上述程序，进一步确保整个空气单元充满目标气体/气溶胶（可选）。
   7. 在 ED19 再次重复上述程序（可选）。重复曝光有助于确保在孵化前保持一致的暴露。记录舱口时间，大致估计暴露持续时间。
   8. 一旦进行所需的暴露并密封，将卵子放在孵化器中孵化。尽量减少卵子在孵化器外的时间，以防止因环境温度低而死亡。

2. 终点评估方法

注:在接触发育中的胚胎的污染物后，可以评估几个毒性参数，包括心毒性。在此节中，详细描述了两种常用的特定方法。

1. 心电图 （图4）
   注意:由于羽毛的存在，在孵化鸡中不可能进行非侵入性心电图。因此，皮下植入电极是必不可少的，需要麻醉。实验室使用的剂量是33毫克/千克五巴比妥通过腹内注射（一些鸡可能需要高达50%的剂量增加）。这种方法将使90%以上的动物进行稳定的心电图检查，从而能够分析心率。
   1. 准备以下必要的试剂/工具:盐水、注射器、电平衡、加热器（如有必要）中的 1%（10 毫克/兆升）五巴比妥溶液，配以双通道金属针电极的心电图仪（如 BL-420E+）。
   2. 用平衡称鸡，计算必要的五巴比妥溶液量，并注射鸡。对于一只重达30克的鸡，需要0.1mL的五巴比妥溶液。确保注射是在腹部的侧面完成的，因为蛋黄位于中间，注射可能无效。
   3. 等到注射的鸡麻醉（把鸡握在手里，如果颈部没有张力，头部可以自由摆动，麻醉就足够了）。将鸡放在手术台上（如果室温低于 20 °C，则需要加热器）。
   4. 从腹部两侧插入两个针电极，皮下。通过抬起皮肤并从那里插入针头，确保针头不会进入腹腔。插入后，小心地将针头向前推，直到针头到达胸腔的一侧。确保针头不会深入身体或从皮肤伸出来。
   5. 用心电图仪进行测量。其他类似的仪器，能够心电图可以使用。
   6. 如果鸡要牺牲，在心电图后进行安乐死，因为它们已经处于麻醉状态。如果鸡要生存，把它们放回笼子里加热直到醒来。将它们返回到孵化器是另一种选择。
2. 组织形态测量 （图5）
   注:开发一种特定的方法来评估心脏横向部分的右心室壁厚度。由于右心室形状不规则，通过声心电图对右心室尺寸的形态评估不是100%准确，这种方法可以作为右心室形态评估的一个很好的补充。
   1. 准备以下必要的试剂/工具:4%磷酸盐缓冲甲醛，锋利的叶片，磷酸盐缓冲盐水，纸巾，电平衡，小剪刀，一般组织处理剂（分级乙醇，二甲苯，石蜡）。
   2. 一旦动物被牺牲，用水来弄湿羽毛。这是为了尽量减少潜在的污染，由于飞行的羽毛，而打开胸部。
   3. 小心地打开胸腔，不损害心脏。用小剪刀切开血管，轻轻地将心脏从胸腔中取出。将一小块（约1-2毫米）的血管附着在心脏上，因为这样可以方便后续处理心脏而不损害心脏。
   4. 取出后，用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗心脏，以去除血液并放松肌肉。然后将心脏浸干纸巾上，然后称量以获得准确的体重读数。在室温下将心脏放入 10 倍体积固定剂（4% 磷酸盐缓冲甲醛）中 24 小时。固定组织随后可能被加工成石蜡块，或在 4 °C 下储存多年（如果计划进行免疫造血，不建议）。
   5. 嵌入前，从顶点（图5A）切开大约60%长度的心脏组织，以便于后续处理。建议使用微原子刀片进行快速垂直的清洁切割。对于超过一天的鸡，在距离顶点约25-30%的长度进行另一次切口，以方便石蜡渗透，并允许组织适合组织盒。
   6. 处理组织与以下条件（根据需要调整）:70%乙醇为1h，80%乙醇为1h，95%乙醇为1 h x2，100%乙醇为30分钟x2，二甲苯为5分钟x2， 石蜡（熔点 52-54 °C） 1.5 h，石蜡（熔点 62-64 °C）1 小时，然后将组织嵌入石蜡（熔点 62-64 °C）和石蜡（熔点 52-54 °C）的 3:1 混合物中。
   7. 将组织分割成 6 μm 厚度。通过确认右心室中解剖地标（隔膜气管）的存在和大小，小心地保持横截面的相同相对位置。确认每个部分长度适中的地标（图 5B，箭头）。
   8. 用 Logo 程序员制作两个电子标尺:标尺 1 是一条直线，中间点连接有 7 个半径测量线，两个相邻测量线之间有 22.5°。标尺2只是T形的两条垂直线（图5B）。
   9. 用两个软件程序测量:Adobe 照片商店和 ImageJ。
      1. 在 Photoshop 中，调整标尺 1（不重塑）大小，将尺子的两端放置在自由右心室壁的两端，以便标尺 1 上的七条测量线分别与右心室内壁相接。然后使用尺子2进行从内侧到外部心室壁的垂直测量（图5B）。
      2. 使用 ImageJ 对每颗心脏进行七次测量。
   10. 根据具体需要，分析一个代表性右心室壁厚度的七个测量值或平均值。针对特定心室壁厚度变化，使整个心脏重量正常化。

曝光结果
空气电池注射
空气细胞注射可以有效地将发育中的鸡胚胎暴露在各种制剂中，随后可以在胚胎/孵化鸡的采集样本（血清、组织等）中检测到这些样本。下面是一个例子，其中全氟辛烷磺酸 （PFOA） 被注入空气细胞，然后用超性能液相色谱质量光谱法确定血清全氟辛烷磺酸浓度。血清浓度与注射剂量相对应，表明此程序的有效性（图6）。

注射
微注射可能使发育中的胚胎暴露在可能无法有效穿透内膜的试剂中，或在行动时间短时（如伦蒂病毒）中暴露。下面是一个例子，其中伦蒂病毒在胚胎第二天用这种方法注射，然后在胚胎第15天胚胎的心脏观察到明显的绿色荧光，表明伦蒂病毒转染的有效性（图7）。

空气电池输液
空气细胞输液是一种新方法，在外部呼吸的开始阶段，对少量气体/气溶胶吸入暴露可能非常有效。下面是一个例子，其中柴油排气在胚胎日18日和19日注入空气细胞，导致心脏和肺组织发生重大纤维化变化（图8）。

终点评估结果
心电图结果
由于两个电极的限制，只能显示3个心电图通道。但是它们足以区分r波，因此它们可用于功能评估。在现实生活中的例子中，暴露于柴油废气中的鸡的心电图显示R-R间隔显著缩短，指示功能变化（图9）。

组织病理学结果
我们右心室壁厚度评估的方法在^{5、7、8、9、10、11、12}等几项研究中成功应用。在我们之前的一项研究中，柴油排气暴露导致右心室壁变厚（图10）。

图1:空气细胞注射的演示。 图片中显示了未发育的肥沃卵子，但不同阶段的胚胎都可能用这种方法暴露。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:微投射的演示。 早期胚胎显示在图片中，这是此方法的首选暴露时间点，但其他时间点也可以尝试。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:空气细胞输液的演示。 图中显示了进行内部切入的晚期胚胎，这是此方法的首选暴露时间点。显示了操作的四个阶段。1: 胚胎。2:已经打了两个洞。3: 正在进行输液。PVF 取样袋也显示在左下角。4:输液完成，用胶带密封孔。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:心电图演示。 左上角面板显示了孵化鸡是如何麻醉和进行心电图测量的。右上角面板显示连接电极的心电图仪器。底部面板显示从鸡中获取的具有代表性的心电图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:右心室壁厚度（血氧林和青霉素染色）组织病理学评估演示。 （A） 在嵌入前证明鸡心的切割位置。（B） 右心室壁厚度测量的演示。秤条代表 1000 μm。蓝色圆圈显示右心室内壁上的七个测量点。红圈显示右外心室壁上的测量点。箭头演示了适当的横截面位置的解剖地标。这个数字已经从江等人 的毒理学修改。 293 （1-3）， 97-106 （2012）⁷. 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:孵化前用0、0.5、1或2mg/蛋公斤全氟同醇酸注射后孵化鸡的全氟丁酸血清浓度。 由此产生的血清浓度与注射剂量相对应，指示空气细胞注射的有效性。这个数字已经从江等人 的毒理学修改。 293 （1-3）， 97-106 （2012）⁷. 请单击此处查看此图的较大版本。

图7:微注射暴露后伦蒂病毒转染功效的证明（低温剖腹产后直接观察）。 左面板显示光场图像，而右面板显示相同组织部分的绿色荧光。胚胎日两个鸡胚胎被注射伦蒂病毒或控制，然后孵育，直到胚胎第15天。心脏在荧光显微镜下被冷冻分割并直接可视化。（A） 控制组，小绿色荧光存在。（B） 伦蒂病毒暴露组，观察到显著的绿色荧光，表明微注射后伦蒂病毒转染的有效性。秤条代表 125 μm。这个数字已经从赵等人 的环境毒理学和药理学修改。 56， 136-144 （2017）¹¹. 请单击此处查看此图的较大版本。

图8:空气细胞输液效果的演示。 鸡胚胎在胚胎18日和19日被注入柴油排气，然后孵化的鸡被保存0，1或2周，然后牺牲。心脏组织被评估与马森三色染色纤维病变。箭头显示纤维病变（蓝色染色）。*: 与控制在统计学上不同（P<0.05 与差异分析和最不显著的差异测试）。秤条代表 150 μm。这个数字已经从江等人 的环境污染修改。264， 114718 （2020）⁸. 请单击此处查看此图的较大版本。

图9:心电图有效性的演示。鸡胚胎在胚胎18日和19日注入柴油排气，然后孵化鸡被保存0，1或2周，然后进行心电图检查。通过空气电池输液暴露于柴油废气的鸡的R-R间隔显著缩短，表明该方法的有效性。*: 与控制在统计学上不同（P<0.05 与差异分析和最不显著的差异测试）。这个数字已经从江等人的环境污染修改。264， 114718 （2020^8.请单击此处查看此图的较大版本。

图10:右心室壁厚度测量效果（血氧林和青霉素染色）。 鸡胚胎在胚胎18日和19日注入柴油排气，然后孵化鸡只保存1周，然后进行右心室壁厚度的组理评估。答:代表图片的心脏横截面。请注意，所有正确的心室中都存在解剖标记（在较老的鸡中，标记在所需的位置往往稍长一点，这不会影响测量的准确性）。B: 将右心室壁厚度量化，首先用标准滑梯转换为实际长度，然后以整个心脏重量正常化，从而以 um/ug 的形式表示。蓝色箭头:自由右心室壁的两端。红箭头:右心室壁的中间点。黑色箭头:解剖标记。*: 与控制在统计学上不同（P<0.05 与差异分析和最不显著的差异测试）。秤条代表 1000 μm。这个数字已经从江等人 的环境污染修改。264， 114718 （2020）⁸. 请单击此处查看此图的较大版本。

鸡胚胎在发育研究中一直是200^{多年的经典}模型。本手稿中介绍的方法已用于评估多个环境污染物，包括全氟异丙酸、颗粒物和柴油废气，成功^{5、7、8、9、10、11、12。}通过这些方法，发展性心毒性得到了经济高效和清晰的指示。此外，不难将鸡胚胎与其他感兴趣的化合物暴露在一起，并评估潜在的发育性心毒性。

气细胞注射法是以前许多研究^中采用的经典方法^，方便有效。与其他发育暴露方法（如啮齿动物模型16、17、18）相比，它具有直接暴露在封闭系统中的特点，从而大大降低了母体效应和各种排泄物造成的变异性。微注射是空气细胞注射方法的增强，确保在早期胚胎发育上或附近明确暴露，其效果可能与啮齿动物^{模型19、20}中的子宫注射效果相似。与子宫注射相比，我们的方法允许通过相对简单的操作步骤对注射进行视觉确认，并且通过控制卵子重量很容易获得准确的注射，这在子宫注射中是不可能的，因为胚胎的实际数量和重量不容易获得。输液方法主要用于评估肺系统吸入剂，但心毒性和肺毒性经常共发生。这种方法利用空气电池，其中少量气体或气溶胶注入，允许连续吸入气体/气溶胶，而无需特定的吸入室。对应啮齿动物模型需要使用相对大量的气体/气溶胶和大型，昂贵的吸入仪器^21，22。

我们实验室中两个常规测试的终点，心电图和对右心室壁厚度的组织形态测量评估，分别表示毒物暴露后的功能和形态变化。右心室壁厚度的评估在全面了解右心室壁方面具有特殊优势，因为传统的基于超声心动图的右心室评估通常具有挑战性，而且不太准确，因为右心室²³的不对称和复杂的新月形状。我们的方法可能有助于克服这种不准确之处，在具有代表性的位置补充有关右心室壁厚度的额外信息。目前全部是手工操作，今后可自动进行测量，测量点数量可大幅增加，进一步提高该方法的准确性。

鸡胚胎发育模型在毒理学研究中有几个优点，例如能够提供相对准确的暴露剂量、壳内的独立暴露系统以及容易操作发育中的胚胎。在心毒性方面，鸡有相对较大的心脏和厚厚的心室壁，便于组织形态评估。有一些缺点，如抗体/引物的可用性和额外的笼位要求相比，啮齿动物如果在孵化后饲养鸡。然而，鸡胚胎仍然是一个很好的替代毒理学模型，用于潜在的发展性心毒性评估。

作者声明没有利益冲突。

这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会的支持（91643203号，91543208，81502835）。