压力过载诱导中度重塑和收缩功能障碍的大鼠模型，而不是过度收缩性心力衰竭

我们描述了压力过载诱导中度重塑和早期收缩功能障碍的大鼠模型的创建，其中在启动改造过程过程中涉及的信号转导通路被激活。这种动物模型将有助于确定分子靶点，用于应用早期治疗性抗重塑策略治疗心力衰竭。

为了对损伤（如心肌梗死、长期高血压或心毒性剂）的反应，心脏最初通过激活信号转导途径进行适应，在短期内抵消心脏肌细胞损失或壁应力的增加。然而，这些通路的长期激活变得有害，导致心脏重塑的开始和传播，导致左心室几何形状的变化和左心室体积的增加;在收缩性心力衰竭 （HF） 患者中看到的现象型。在这里，我们描述了一个大鼠模型的压力过载诱导适度重塑和早期收缩功能障碍（MOD），通过上升主动脉带（AAB）通过血管夹与2毫米^2.手术在200克斯普拉格-道利大鼠中进行。MOD HF 表型在 AAB 后 8-12 周发展，通过回声心动图进行非侵入性特征。先前的研究表明，激活信号转导途径，改变基因表达和后转化后蛋白质在MOD HF表型模仿那些在人类收缩HF看到;因此，使MOD HF表型成为转化研究的合适模型，以识别和测试HF中潜在的治疗性抗重塑靶点。MOD HF 表型与表状收缩HF表型相比的优点是，它允许识别早期重塑过程和早期应用治疗干预的分子靶点。MOD HF 表型的局限性是，它可能无法模仿导致人类收缩HF的疾病谱。此外，这是一个具有挑战性的表型创建，因为AAB手术与高死亡率和失败率相关，只有20%的手术大鼠开发所需的HF表型。

心力衰竭（HF）是一种普遍的疾病，与高发病率和死亡率¹相关。由上升或横向主动脉带带产生的HF的啮齿动物压载过载（PO）模型通常用于探索导致HF的分子机制和测试HF中潜在的新治疗靶点。他们还模仿人类HF继发到长期全身性高血压或严重主动脉狭窄的变化。PO 之后，左心室 （LV） 壁的厚度逐渐增加，这个过程称为同心 LV 肥大 （LVH），以补偿和适应 LV 壁应力的增加。然而，这与一些不适应信号通路的激活有关，这导致钙循环和平衡、代谢和细胞外基质重塑和基因表达变化的紊乱的发生，以及增强的凋亡和自噬^2,2，3，4，5，6。^3,4,5,6这些分子变化构成心肌重塑启动和传播的触发因素，并转化为补偿性HF表型。

尽管使用近亲啮齿动物菌株和标准化的夹大小和手术技术，有巨大的阴极变异在LV室结构和功能在主动脉带模型^{77，8，9。8,9}大鼠PO后遇到的比世变异性，斯普拉格-道利菌株，被描述在其他地方^{10，11。10,}其中，两种HF表型遇到心肌重塑和信号转导通路激活导致氧化应激升高状态的证据。这与代谢重塑、基因表达改变和蛋白质的翻译后修饰变化有关，在重塑过程^10、12,12中完全发挥作用。第一种是中度重塑和早期收缩功能障碍 （MOD） 的表型，第二种是表型收缩HF （HFrEF）。

HF的PO模型优于HF的心肌梗塞（MI）模型，因为PO诱导的环壁和经间壁应力均匀分布于心肌的所有段。然而，这两种模型在PO^10、11和梗死大小^1113、14,14的严重程度上都存在变异性，在梗死部位¹⁵处伴有强烈的炎症和疤痕，胸壁和周围组织也附着，这在HF的MI模型中观察到。^,此外，大鼠PO诱导HF模型是具有挑战性的创造，因为它与高死亡率和失败率¹⁰相关，只有20%的手术大鼠开发MODHF表型^10。

MOD是一个有吸引力的HF表型，构成传统创建的HFrEF表型的演变，因为它允许早期瞄准信号转导通路，在心肌重塑中发挥作用，特别是当它涉及到线粒体动力学和功能的扰动，心肌代谢，钙循环和细胞外基质重塑。这些病理生理学过程在MOD HF表型¹¹中非常明显。在本手稿中，我们描述了如何创建 MOD 和 HFrEF 表型，并在执行提升主动脉带 （AAB） 过程时解决陷阱。我们还详细介绍了如何通过回声心动法来最好地描述两种高频表型，MOD和HFrEF，以及如何将它们与其他未开发严重PO或开发严重PO和同心重塑但无显著偏心重塑的表型区分开来。

这里描述的所有方法和程序都已获得杜兰大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 创建 AAB 模型的工具和工具

1. 获得消毒剂，如70%的等丙醇和碘。
2. 获得氯胺酮和锡拉辛麻醉和丁丙诺啡的肛门。
3. 获得一个加热垫和重吸收一次性下垫与18英寸x30英寸的尺寸。
4. 获得 100% 棉线卷、胶带和理发器。
5. 获得20厘米x25厘米的塑料板，厚度范围在3-5毫米之间。
6. 获取 Z-LITE 光纤照明器。
7. 为小动物（例如，SAR-830/AP）获得机械呼吸机。
8. 获得 2-0 和 3-0 Vicryl 松丝缝合线和尼龙 3-0 单丝缝合线、无菌纱布垫和无菌超大型棉尖和无菌手套。
9. 获得16 G血管插管。
10. 购买以下手术工具。
    1. 获得韦克不锈钢止合结和不锈钢连合夹。
    2. 获得硬化的细光圈剪刀。
    3. 获取 Adson 钳子。
    4. 获得两个弯曲的格列夫钳子。
    5. 获得一个哈尔斯特德-蚊子Hemostats直钳。
    6. 获取梅奥-赫加针支架。
    7. 获得一个阿尔姆胸部缩回器与钝的牙齿。
11. 利用并获取高压灭菌器和珠子消毒器。

2. 上升主动脉带状外科手术

1. 麻醉动物与75-100毫克/千克氯胺酮和10毫克/千克锡拉辛混合的腹内注射。
   注:让动物完全镇静和松弛几分钟。如果麻醉剂量不足，且动物仍在笼子里移动，则在允许足够的时间后，在后续注射之间约 5-10 分钟，用相同的麻醉剂量重新注射动物。大多数动物需要1-2次注射才能实现深度镇镇镇化和麻醉。
2. 在位于右臂下右侧侧胸部位的手术部位上理发。
3. 通过将四肢轻轻绑在塑料板上，稳定动物。然后，用16G血管切开进行内切治疗插管。动物成功插管后，以50个周期/分钟和21%的FiO₂启动潮汐体积为2 mL的机械通风。每次呼吸时，都要寻找胸壁的对称上升。
4. 将动物慢慢转动，使其位于其左侧侧，然后以 U 形方式弯曲尾巴，然后轻轻将其贴在塑料板上，使其稳定下来。然后，继续消毒的扫描区域与局部应用的povidone-碘。
5. 在切口部位以50/50混合，以1-2%Lidocaine/0.25-0.5% Bupivacaine的体积渗透皮肤，作为先发制人的合痛药，然后进行切口。
6. 在右臂下1厘米的右轴层处进行1-2厘米长的右水平皮肤切口。然后，解剖胸肌层，直到到达胸肋笼。在第^{二和第三肋}骨笼之间做一个1厘米的胸腔切除术。
   1. 在解剖胸部肌肉层时，要小心，避免右关节动脉受伤，该动脉在右臂下运行。
      注:在1^节和第2^肋骨之间进行的胸腔切除术有带右胸骨动脉的风险，而不是上升主动脉。第三^和第四肋之间的胸腔切除术使得很难可视化和波段上升主床，因为操作者将看正确的中庭。
      注:避免将胸膜切除术过度地延伸到胸骨，以避免解剖和伤害右内乳腺动脉。
7. 轻轻解剖胸腺的两个叶，将它们推到一侧。然后识别上升主塔，并通过弯曲的Graefe钳子钝剖解剖将其与卓越的维纳卡瓦隔离。
   注:对胸腺进行重大操作会使胸腺肿胀，并使得难以可视化上升主主。
   1. 从主床中分离高级维纳卡瓦，格外小心，以避免对高级维纳卡瓦的损伤或破裂，这是致命的。这可能是程序中最棘手的部分，而且即使在大多数有经验的手中，也预计会不时发生，但通常与初学者和学习者一起发生。
8. 用弯曲的Graefe钳子轻轻抬起上升的主提塔，并将血管夹放在上升主塔周围。
   1. 通过塑料预切 7" 件调整血管止形夹连接工具，以获得所需内部区域为 1.5 mm²或 2 mm²的血管夹，具体取决于所需的 HF 型号。
9. 通过维里尔2-0单丝缝合胸腔。然后通过3-0维基里尔单线缝合缝合胸部的肌肉层。然后通过尼龙3-0单丝缝合皮肤切口。
10. 手术后48-72小时服用下列药物的组合，在术后期间用作肛门:1） 布丙诺啡每8-12小时下皮0.01-0.05毫克/千克， 2） Meloxicam 每 12h 分泌 2 mg/kg，3） 吗啡 2.5 mg/kg，每 2-4h 为剧烈疼痛而下皮。
    注:在定期监测下，让动物在加热垫上恢复。一旦动物从麻醉中表现出恢复的迹象（能够自发呼吸 - 没有气喘或使用辅助肌肉超过两分钟的证据 - 具有良好的反射，红色和温暖的四肢），排泄动物，并将其返回到笼子。

3. 回声心动图

1. 用80-100mg/kg氯胺酮的腹内注射使动物被塞。确保适当的镇套，以便正确获取高质量的回声图像。
   注:使用异氟兰作为麻醉剂不鼓励其心抑郁剂的作用，特别是在严重压力过载的设置，并可能给人一个错误的印象，LV扩张和收缩功能障碍，解决一旦动物关闭麻醉。
   1. 要谨慎，在看起来呼吸困难和口服药的动物中施用一半甚至三分之一的氯胺酮剂量，怀疑它们已经开发出HFrEF表型。
2. 在完全镇静的动物中，把胸部的头发前去。
3. 把动物放在背上，稳定在塑料板上。
4. 在毛细管肌肉水平上获取 2D 准骨长轴和 2D 准轴短轴视图剪辑。此外，从帕细血管肌肉水平的短抛物轴视图中获取 M 模式图像，以测量二叶草的 LV 隔膜和后壁厚度以及 LV 端度肌和端收缩直径。
   1. 以每分钟 370 - 420 次的心率获取图像或剪辑，以确保正确评估 LV 大小和功能。以较低的心率采集图像将导致对抑郁的LV功能和LV扩张的假象。
      注: 获取前缩的 2D 长准轴视图图像/剪辑会导致错误测量。出于质量控制目的，请确保在同一平面切割中可视化 LV 顶点和主角角度。
   2. 获取 2D 短准轴视图图像/剪辑在中毛细血管肌肉的水平。这将作为参考，以获得可靠的串行和随后的LV测量，而跟踪动物随着时间的推移在整个研究期间。
5. 在主动脉瓣的长准轴视图中获取 M 模式图像，以评估端层的离心庭 （LA） 直径的相对主动脉。
   注:具有MOD和HFrEF表型的动物应显示LA扩张的证据，LA/Ao比为±1.25和<1.5在MODHF表型和+1.5在HFrEF表型^10。

在AAB之后8-12周内发育的HF表型的表型特征，可以很容易地通过回声心动图进行。图 1A中介绍了 Sham、AAB 后第 3 周、MOD 和 HFrEF 表型的代表性 M 模式图像。图 1B和图 1C分别显示了用于创建 MOD HF 表型和 HFrEF 表型的血管夹大小。LV 端分量 （LVEDV） 和端收缩 （LVESV） 卷可以使用区域长度方法的公式计算:V=5/6°A Ω L，其中 V 以 ml 表示体积;A 是 CM²中的 LV 腔的横截面区域，从短准轴视图获得，位于 diastole（Ad） 和 systole（As） 的中毛细血管肌肉水平;L 是 LV 腔的长度（厘米），从长准轴视图测量，从内角 LV 顶点到硅石 （Ld） 和 systole （Ls） 中的斜体-主动脉结的距离。图2所示长准线轴和短准轴超声心动图图像，说明如何测量Ld、Ls、Ad和As，在Sham和MODHF表型中，如图2所示。MOD HF 表型中的 LVEDV 通常范围在 600 - 700 μL 之间，LVEDV 大于 700 μL 和高达 1000 μL 的动物很少;同时，MOD 表型中的 LVESV 范围在 120 - 160 μL 之间（表 1）。从图2所示的2D短准线轴视图回声线影像图像中，人们可以欣赏到MOD表型中LVH的程度与假象相比。图3中介绍了 Sham、AAB 后第 3 周、MOD 和 HFrEF 表型的代表性压力体积环跟踪。LV最大压力至少为200毫米汞柱，即使在AAB后的第3周，由于动物和主动脉的生长与上升主动脉的固定产生狭窄不匹配，在AAB后的第8周进一步增加。请注意，与假动物相比，AAB 后第 3 周的动物通过将 LVEDV 和 LVESV 向左移动而得到完全补偿。随着渐进偏心肥大和改造，与AAB后的第3周相比，在MOD和HFrEF表型中，LVEDV和LVESV向右发生了转变。人们还可以理解，在MOD表型中LVESV的显著增加和HFrEF表型中LVESV的显著增长，这反映了与AAB后第3周相比，MOD和HFrEF表型的中风体积和LVEF分别显著而深刻地下降。此外，人们可以欣赏AAB后第3周的LVEF显著增加，以及与假人相比，HFrEF表型的LVEF显著减少。

大鼠PO诱导HF模型与高死亡率和失败率相关。只有大约20%的接受AAB的大鼠，其内部直径为^{2 mm2}的血管夹，将过渡以发展MOD HF表型。图 4中介绍了失败型的代表性 M 模式图像。图4A显示了具有代表性的M模式图像，这些动物在AAB后的第8周未开发LVH，并且完全失去了完全回归LVH（类似沙姆）或在第8周AAB后具有可变程度的LVH和PO，导致轻度中度LVH表型的PO。图4B显示了具有严重PO（LV最大压力>200 mmHg）和严重LVH的动物具有代表性的M模式图像，这些动物在无偏心重塑、同心重塑（CR）组或轻度（MILD组）偏心改造的证据下仍然得到补偿。图5和表1中介绍了假、失败和成功/期望的表型的超声心动图和血液动力学数据。请注意，随着动物从补偿型向更偏心和重塑型的表型过渡，心脏重量和LV重量逐渐增加。此外，随着动物从补偿的同心重塑向解补偿的偏心重塑表型，LVESV呈指数级增长，LVEF减少。特别令人感兴趣的是，与所有其他表型相比，MOD和HFrEF HF表型的心肌刚度程度与末端二分压体积关系（EDPVR（mmHg/μL）的刚度系数*测量的相似程度，而随着动物向更偏心重塑型的现象型，LV效率逐渐降低。LV 效率是根据最终收缩压体积关系 （ESPVR） 除以动脉电成 （EA） 计算的。尽管在ESPVR和ESPVR/EA中，MOD和HFrEF表型和假组之间没有显著的统计差异，但情况是错误的，因为MOD和HFrEF表型与假型相比具有高得多的LV端收缩压力，使得ESPVR斜率在V0向右移动时比假。此外，当MOD和HFrEF表型与具有相同PO度的补偿和同心重塑型进行比较时，人们可以欣赏LVESV和ESEV的显著和渐进的增加，以及ESPVR和ESPVR/EA的滴向，与CR和MILD表型相比，在MOD和HFrEF表型中观察到的有渐进的偏心重塑。Figure 5

图1:在提升主动脉带后第8周代表心力衰竭表型。（A） 在上升主动脉带 （AAB） 和 AAB 之后的八周之后，假动物、动物的代表性 M 模式图像。图1A已被修改从Chaanine等人，美国生理学-心脏和循环生理学杂志，2016年。（B） 血管夹大小，用于创建具有中度偏心重塑 （MOD） 的严重左心室肥大 （LVH）。（C） 血管夹大小，用于创建具有幻收缩性心力衰竭 （HFrEF） 的严重 LVH。图1B和1C已被获得和修改从Chaanine等人，分子生物学方法，2018年。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2:使用区域长度方法，通过回声心动图计算左心室体积。代表 2D 长准线轴和 2D 短准轴视图回声心动图图像，以测量左心室 （LV） 腔长度在 diastole （Ld） 和 systole （Ls） 和 LV 腔横截面区域在 diastole （Ad） 和 systole （As） 中，以计算二甲苯和 systole 末端的 LV 体积。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:使用开胸和左心室腔穿刺方法，通过1.9 F大鼠压力体积导管获得压力体积环追踪。代表压力体积环跟踪在 Sham，第 3 周后 AAB， MOD 和 HFrEF 表型在 AAB 后的第 8 周.图已被修改从Chaanine等人，循环:心力衰竭，2013年。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4:在 AAB 之后的第 8 周遇到表型，但未能开发所需的心力衰竭表型。（A） 代表 M 模式图像的动物失去了压力过载 （PO） 和未开发 LVH （沙姆类） 和那些具有可变 PO 和 LVH （轻度中度 LVH） 表型的动物。（B） 代表 M 模式动物的 M 模式图像，这些动物发育了严重的 PO、LVH 和同心重塑 （CR），但没有 （CR） 或具有轻度 （MILD） 偏心重塑型。图4B已由Chaanine等人修改，《美国心脏协会杂志》，2017年。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 5:不同表型中的回声心动图和压力体积循环参数。数据以单个值（点）形式显示，在 AAB 后的第 8 周，不同表型中具有中值（水平线）。表1显示了不同表型中呈现数据的统计分析结果。LVESV:左心室端收缩体积，LVEF:左心室弹出分数，EDPVR:端去舒张压力体积关系，ESPVR:末节压体积关系，EA:动脉起生。请点击此处查看此图形的较大版本。

表1:沙、深、深、中度LVH、CR、MILD、MOD和HFrEF表型的回声心动图和压力体积参数。

在大鼠中与AAB相关的PO之后，LV通过增加LV壁厚（称为同心LVH）进行同心重塑，作为补偿机制，以抵消LV壁应力的增加。在 AAB 之后的第一周，LV 壁厚度的增加变得明显，并在 AAB 后 2-3 周内达到其最大厚度。在此期间，不自适应信号转导通路的激活导致LV逐渐扩大，LV体积增加，这个过程称为偏心肥大或重塑。预计大鼠的HF表型在大多数动物中出现AAB后8周左右，其中很少在AAB之后的第12周出现HF。根据 AAB 的严重程度，会出现两种高频表型。MOD 表型是通过创建内部直径为 2 mm²的升序主动脉带 （AAB） 获得的，而 HFrEF 表型的创建需要 AAB 的内径为 1.5 mm²的更紧密的血管夹。在上升主动脉带后2-3周内进行超声心动图，以验证严重同心LVH的存在，这一点很重要。严重LVH定义为LV隔膜和后壁厚度+1.5倍正常（0.19厘米），通常范围在0.27 - 0.3厘米之间。 在AAB之后第3周未出现严重LVH的动物，将被视为AAB不成功，此后不应跟随。在AAB之后的第3周出现严重LVH的人，将在AAB之后的第8周接受回声心动图，以评估所需HF表型的发展。在 AAB 之后的第 3 周遇到 LVH 严重的动物在 AAB 之后的第 8 周出现回归或解析 LVH 的情况并不罕见，原因我们将在讨论的后一节中讨论。严重LVH和同心重塑的动物没有或与温和的偏心改造在第8周后AAB，因此CR和MILD表型，分别不太可能发展进一步的偏心重塑，即使他们遵循一两个延长一个月或两个月。那些位于MILD和MOD表型之间的，如果再遵循一个月，可能会开发MOD HF表型。

PO大鼠模型可能会令人沮丧，因为相关的高死亡率和失败率^10，尽管使用标准化血管夹大小和手术技术，这也增加了研究费用，因为大量的动物需要接受AAB，以实现所需的目标数量（n），以及动物需要遵循的时间长度之前，他们开发所需的HF表型。未能发展严重的LVH与不成功的带状或带状的权利胸椎动脉，而不是主动脉，这是不常见的。在随后的后续评估中，严重LVH的回归和/或分辨率与动脉瘤形成和近带主动脉重塑有关，导致PO⁹严重性损失。目前还不清楚为什么患有严重LVH和PO的动物在偏心重塑方面出现型比变化，尽管它们具有相同的剪辑大小、性别和应变。建议可视化上升主动脉，以筛选围带主动脉重塑和动脉瘤形成。发育了直径约1厘米的升序主动脉瘤的动物应安乐死，因为这将由于对周围结构造成障碍和动物的苦恼。此外，建议通过颜色多普勒检查带内湍流，但不幸的是，由于无法将连续多普勒与上升主塔中的血流方向对齐，因此无法通过连续多普勒精确估计整个带的压力梯度。

MOD是一种有吸引力的HF表型，构成传统创建的HFrEF表型的进化，因为它允许瞄准信号转导途径，在疾病过程的早期在心肌重塑中发挥作用，特别是当它涉及到线粒体动力学和功能的扰动，心肌代谢和钙循环和细胞外基质重塑和心肌僵硬;在MOD HF表型¹¹中非常明显的功能。此外，早期术后死亡率（定义为AAB后头7天的死亡率）较低，夹大小为2 mm^2，用于创建MOD表型，比1.5 mm²的夹子大小低，用于创建HFrEF表型^10（5%对21%，P = 0.009使用Fisher的精确测试）。但是，两个剪辑尺寸之间的成功率，用于创建 MOD 和 HFrEF 表型，在统计上显著¹⁰，（20% vs 13%，P = 0.56 使用费舍尔的精确测试）。此外，血管夹的主动脉带比主动脉带更有利，方法是将尼龙缝合线拧紧在27 G针上，这种技术通常用于收缩小鼠的横向主动脉，因为与缝合技术相比，夹体尺寸的变化较小，对主动脉的创伤也较少。

HF的PO模型优于HF的心肌梗塞（MI）模型，因为PO诱导的环壁应力和经络壁应力均匀分布于心肌的所有部分。然而，这两种模型在PO^10、11和梗死大小^1113、14,14的严重程度上都有变化，在梗死部位¹⁵处伴有强烈的炎症和疤痕，以及粘附在HF MI模型中观察到的胸壁和周围组织。^,此外，大鼠PO诱导HF模型是具有挑战性的创造，因为它与高死亡率和失败率¹⁰相关，只有20%的手术大鼠开发MODHF表型^10。与自发性高血压大鼠（SHR）模型相比，PO诱导的HF模型是研究心肌重塑途径的较好模型。在PO诱导的高频模型中，systole的后负荷和心肌壁应力的增加比SHR模型高得多。SHR开发收缩HF大约需要两年时间，收缩HF的机制并不完全为人所知，并且被^老化的16号系统所迷惑。SHR模型和其他高血压模型，如DOCA盐模型，更频繁地用于研究与高血压和可能舒张功能障碍有关的机制和疗法^16。

总之，MOD HF表型是研究心肌重塑背景下信号转导途径的一种有吸引力的模型，可用于应用和测试潜在的治疗策略，在大型动物模型和人类心力衰竭中验证其疗效之前。

所有作者报告没有利益冲突。

NIH 向 P.D 授予 HL070241。