RNA甲基转移酶活性分析的无抗体测定

这里描述了一种无抗体的体外测定,用于直接分析合成或体外转录RNA上的甲基转移酶活性。

RNA有100多个化学上不同的修饰,其中三分之二由甲基化组成。由于对RNA修饰,特别是甲基化的兴趣,由于在与疾病和癌症相关的生物过程中书写和清除酶所起的重要作用,重新出现了。这里提供了一种敏感的体外测定,用于准确分析RNA甲基化作家在合成或体外转录RNA上的活性。这种测定使用三聚体形式的S-腺苷-蛋氨酸,导致甲基化RNA直接贴上三聚糖标签。低能量的三聚能使该方法安全,而且预先存在的三聚物信号扩增方法,使得在不使用通常容易产生伪影的抗体的情况下,可以量化和可视化甲基化RNA。虽然这种方法是为RNA甲基化而编写的,但很少的调整使它适用于研究其他可放射性标记的RNA修饰,例如14 C乙酰辅酶A的RNA乙酰化。甲基化条件,抑制与小分子抑制剂,或RNA或酶突变体的作用,并提供一个强大的工具,以验证和扩大在细胞中取得的结果。

脱氧核糖核酸、RNA和蛋白质受到严格调节基因^表达1的修饰。在这些修饰中,甲基化发生在所有三种生物聚合物上。在过去的三十年里,DNA和蛋白质甲基化得到了很好的研究。相比之下,鉴于写、擦除或结合RNA甲基化的蛋白质在发育和^疾病2中的重要作用,对RNA甲基化的兴趣直到最近才重新燃起。除了在丰富的核糖体和转移RNA中更知名的功能,RNA甲基化通路调节特定的信使RNA稳定性3,4,^拼接5和翻译6,7,miRNA处理8,9和转录暂停和释放10,11。

这里报告了一种简单而可靠的方法,用于在分子生物学实验室的设置中对RNA甲基转移酶活性进行体外验证(如图1所示)。许多研究评估RNA甲基转移酶的活性,通过点斑点与抗体对RNA修饰的兴趣。然而,点泡在用RNA甲基转移酶孵育时不能验证RNA的完整性。这一点很重要,因为即使对核酸酶的重组蛋白进行轻微污染,也会导致部分RNA降解和混淆结果。此外,即使是高度特异性的RNA修饰抗体也能识别具有特定序列或结构的未修饰RNA。这里报道的体外RNA甲基转移酶测定利用了S-腺苷蛋氨酸可以在甲基组供体上三聚酯(图1)的事实,使得甲基化RNA在不使用抗体的情况下能够准确检测出来.提供在体外转录和纯化兴趣转录和测试该转录本的甲基化由感兴趣的酶。该方法灵活可靠,可根据任何给定项目的需求进行调整。例如,在体外转录和纯化RNA,化学合成RNA,也可以使用细胞RNA。此测定以闪烁计数的形式提供定量信息,并通过显示甲基化RNA在凝胶上的确切运行位置提供定性信息。这可以为RNA甲基转移酶的功能提供独特的见解,特别是在使用细胞RNA作为基质时,因为它提供了一种直接观察甲基化目标RNA或RNA的大小的方法。

1. 靶着RNA的体外转录和凝胶纯化

1. 使用既定的分子克隆^技术12或试剂盒,将感兴趣的序列克隆成含有T7和/或SP6启动子的质粒。
2. 为体外转录的DNA模板线性化
   1. 通过质粒的PCR放大感兴趣的序列,使用引物,通过插入物包括T7启动子区域,如前面描述的20-30 bp上游和下游。
   2. 或者,根据RE供应商提供的说明,使用限制酶(RE)切割部位在刀片下游消化5μg质粒。
      注: 请记住仔细检查刀片是否未被所选的 RE 切割。选择此步骤中使用的 RE 会显著影响成绩单的收益率。优先,线性化与钝或5'悬垂端产生RE,以避免模板切换的T7 RNA聚合酶在相反的DNA^链14。如果初始收益率不足,请尝试不同的 RE。
3. 使用DNA糖凝胶提取和清理试剂盒净化生成的DNA。用30μL的水洗脱DNA。
4. 通过涡旋、移液 1.5 μL 和微体积分光光度计测量 DNA 浓度,进行良好的混合。
5. 使用 250 ng 的 DNA 检查纯化 DNA 的质量和大小在 1x TBE 缓冲液中迁移 1h 的 1% 角糖凝胶凝胶电泳,在 4 V/cm 下迁移 1 小时。
6. 解冻体外转录试剂盒的冷冻试剂。将 T7 RNA 聚合酶混合物放在冰上,将其他试剂放在室温下的螺母上。完成解冻后,快速旋转 rNTP 管 5 s,在管底部收集溶液并放置在冰上。将10倍反应缓冲液保持在室温下,以避免降水。
7. 在1.5 mL管中按指示顺序将20μL转录反应的以下组分移至20μL转录反应中:6μL水,2μL(0.1 - 1 μg)线性DNA模板,2μL 75 mM ATP溶液,2μL 75 mM GTP溶液,2 μL 75 mM CTP 溶液,2 μL 75 mM UTP 溶液,2 μL 10x 反应缓冲液和 2 μL T7 RNA 聚合酶混合。
   注:对于PCR生成的DNA模板,使用100-200 ng DNA;对于由质粒限制性酶消化产生的DNA模板,使用+1 μg.活性重组_他的6标记T7RNA聚合酶可以在^{大肠杆菌15}中纯化。
8. 彻底混合管子。快速旋转5s,在管底部收集反应溶液,然后在37°C孵育2-4小时。
   注:每个成绩单的行为会有所不同,具体取决于DNA模板,其长度,其顺序或结构。通过测试不同孵育时间长达6小时,优化体外转录条件;不同浓度的DNA模板,T7RNA聚合酶,或NTP;或补充MgCl₂添加到T7RNA聚合酶混合物中。
9. 在潜伏期结束时,每20μL反应加入1μL的DNase I,并在37°C孵育15分钟。
   注:转录反应可以暂时保存在冰上,直到聚丙烯酰胺凝胶准备就绪。
10. 继续用聚丙烯酰胺凝胶进行纯化。
    注:由于RNA对pH和RNase污染敏感,请使用RNA专用设备和无RN酶试剂。
11. 根据兴趣成绩单的大小确定凝胶的聚丙烯酰胺百分比:100-2000 nt 的 3.5%(XC: 460 nt ;BB: 100 nt),5% 80-500 nt (XC: 260 nt ;BB: 65 nt), 8% 60-400 nt (XC: 160 nt ;BB: 45 nt),12% 40-200 nt (XC: 70 nt ;BB: 20 nt),15% 25-150 nt (XC: 60 nt ;BB: 15 nt),20% 6-100 nt (XC: 45 nt ;BB: 12 nt)。
12. 在 50 mL 锥形管中结合以下试剂制备尿素变性聚丙烯酰胺凝胶:9.6 g 分子级尿素、2 mL 10x TBE、x mL 40% 丙烯酰胺:乙丙烯酰胺混合物 (29:1) 和管上高达 20 mL 标记的水,其中 x=20 mL/(40%/凝胶百分比%)。
    注意:聚丙烯酰胺凝胶通常含有未聚合的丙烯酰胺,这是一种有毒物质,在引入环境时会产生危害。通过该机构的化学废物计划处理聚丙烯酰胺凝胶。
13. 微波15s,功率30%。在室温下或尿素完全溶解之前,在螺母上放置 10 分钟。
14. 当凝胶混合物旋转时,取回凝胶盒(18 孔,1 毫米厚;13.3 x 8.7 厘米(W x L),取出梳子并放置盒式凝胶铸造。
15. 快速旋转 50 mL 管 5 s,在管底部收集凝胶溶液。加入125 μL的10%硫酸铵溶液(APS)。将螺母放在螺母上 1 分钟,再次快速旋转 5 秒。
16. 加入25μL的四甲基二胺(TEMED),通过上下移液5次,用25mL移液器避免气泡,仔细混合。
17. 将液器放入凝胶铸造中,并小心地插入凝胶梳,避免气泡。
18. 通过在盒式磁带顶部添加一个大的活页夹来拧紧密封件。
19. 让凝胶聚合1小时。
20. 凝胶凝固后,取出粘合剂夹。将盒插入电泳盒。将 1x TBE 缓冲器添加到顶部和底部储液罐中。
21. 检索转录反应。加水至100μL,然后加入100μL的2x凝胶加载缓冲液。将推荐量与水混合至 10 μL 和 10 μL 的 2x 凝胶加载缓冲液,将推荐量混合到单独的 1.5 mL 管中,从而准备梯子。
22. 在70°C的温混混合器中孵育梯子和体外转录反应15分钟。
23. 当样品在 70°C 下变性时,小心地取出梳子,用 P1000 移液器上下移液,清洁井,并立即在 100 V 下预运行 10 分钟。
24. 样品在70°C下完成15分钟的变性后,从热混合器中取出管子,立即放在冰上。
25. 用 P1000 移液器再次清洁凝胶的每个井。在第一口井左侧加载 20 μL 的梯子,在 10 口独立井上加载 20 μL 的 RNA 样品,在未利用的井上加载 20 μL 的 1x 凝胶加载缓冲液。
26. 根据凝胶的聚丙烯酰胺百分比,在 100 V 下运行凝胶 60 -240 分钟。
    注: 凝胶加载缓冲液中的染料在穿过凝胶时将分离成两个波段,一个缓慢迁移的溴酚蓝 (BB) 蓝色带,以及快速迁移的二甲苯青色 (XC) 青色带。这些带在不同%聚丙烯酰胺凝胶中的近似迁移是众所周知的(参见步骤1.11),可用于估计凝胶中RNA的迁移。
27. 停止凝胶后,小心地从盒中取出凝胶。
28. 将凝胶放入含有50 mL 1x TBE缓冲液的清洁盒中,含有50μL的核酸凝胶染色液,并在摇臂上孵育5分钟,以染色RNA。
29. 在凝胶成像系统上拍摄凝胶的带前和后切除图片,最好使用蓝光而不是紫外线转光。
30. 使用无核酸酶的一次性凝胶切割尖去除每个感兴趣的带。每口井后,将含有凝胶切片的尖端转移到1.5 mL管中,然后短暂旋转以收集凝胶片。重复此操作,直到在同一 1.5 mL 管中收集所有频段。
31. 收集所有凝胶切片后,将100 μL无核酸酶水或TE缓冲液加入1.5 mL管中。储存在4°C,约48小时。这允许RNA将凝胶切片退出溶液中。
32. 48小时后,将水或TE缓冲液移至新鲜的1.5 mL管中。处理剩余的凝胶片。通过清理试剂盒净化RNA,如下所示。
    1. 在室温下将旋转柱平衡至少 30 分钟。
    2. 在步骤 1.32 处的新 1.5 mL 管中 100 μL 的 RNA 溶液中,加入 350 μL 的 RLT 缓冲液,并在螺母上混合 2 分钟。在 200 x g下旋转 1 s 以收集管底的溶液。
    3. 加入 675 μL 的 100% EtOH,在螺母上混合 2 分钟。在 200 x g下旋转 1 s,然后立即继续执行下一步。
    4. 将 565 μL 的混合物转移到自旋柱上,并在 15,000 x g下旋转 1 分钟。通过吸入清空收集管。
    5. 对示例的后半部分重复上一步。
    6. 向列中添加 500 μL 的 RPE 缓冲液,并在 15,000 x g下旋转 1 分钟。通过吸入清空收集管。
    7. 将 750 μL 的 80% 乙醇加入柱中,在 15,000 x g下旋转 1 分钟。通过吸入清空收集管。
    8. 将柱子放入新的 2 mL 收集管中,盖打开,以 15,000 x g旋转 5 分钟。
    9. 将柱转移到新的 1.5 mL 管中。
    10. 在柱中心加入 17 μL 的水,以 15,000 x g旋转 1 分钟以洗去。再次使用另外17μL的水。回收的总体积应为 32 μL。
33. 通过涡旋、移液1.5μL进行良好混合,并使用微体积分光光度计测量RNA的浓度。
34. 检查通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶的RNA纯化质量,如步骤1.11-1.29。

2. 体外RNA甲基转移酶测定

1. 在冰上1.5 mL管中设置100μL RNA甲基转移酶测定:23 μL水,10μL 10x TBS(500 mM Tris-HCl,pH 7.5;pH 7.5;1.5 M NaCl),2μL 0.05 M EDTA,5 μL 100 mM DTT, 40 μL 50% 甘油, 4 μL 58 μM ³H-SAM, 5 μL 20x 蛋白酶抑制剂鸡尾酒, 1 μL RNaseOUT (可选), 5 μL RNA 和 5 μL 甲基转移酶.
   注意:放射性三聚体材料是危险的,只有在戴手套、实验室外衣和任何其他必要的PPE时才应处理。所有与放射性物质接触的移液器尖端和管均被视为固体放射性废物。根据实验室批准的放射性废物协议处理所有固体和液体放射性废物。
   注:包括不含甲基转移酶和RNA的控制样品。试剂浓度可能需要优化和/或包含二价阳离子盐,如MgCl_2或未标记的SAM。最终RNA浓度的最佳范围为50 nM至1 μM,而甲基转移酶浓度为25 nM至300 nM。
2. 轻轻涡旋管,彻底混合。在 200 x g处旋转 5 s 以收集管底的溶液。在37°C下孵育管子2小时。
3. 使用柱纯化清洁反应,如步骤 1.32 中。
   注意:小心妥善处理任何放射性物质,特别是在柱下处理时(移液器,而不是从收集管中吸气废物)。
4. 执行液体闪烁计数
   1. 设置闪烁计数机架,每个样品有一个小瓶,一个用于背景测量的小瓶,一个用于刷卡测试的瓶。用 5 mL 的闪烁计数溶液填充小瓶。
   2. 将每个洗脱的放射性RNA样品加入1小瓶中,并拧紧盖子并轻轻混合。
   3. 准备刷卡测试小瓶。在协议期间使用的所有表面和设备上彻底擦拭子。将拭子加入装满 5 mL 闪烁溶液的小瓶中,然后拧紧盖子。
   4. 在闪烁计数器上运行示例,如下所示。打开柜台罩,将机架插入机器并关闭发动机罩。选择"计数单机架"。选择"选择用户计划"。选择或创建一个程序,测量3H为60s.命中计数机架。重复闪烁计数三次。
      注:设备将测量每个样品的闪烁计数,并将输出到屏幕和打印输出。如果需要,可以在此处暂停协议。步骤 2.3 中的剩余 RNA 样品应冷冻在 -80 °C,以供以后使用。
5. 继续自动无线电报
   1. 如步骤1.11-1.20中那样准备和预运行尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
   2. 将20μL的放射性RNA物质移液器放入一个新的1.5 mL管中,含有20μL的2x凝胶加载缓冲液。混合好。按照步骤 1.21 中的准备梯子。在70°C下孵育样品15分钟。
   3. 在样品加载前,再次清洗凝胶的井。在准备好的梯形上加载 20 μL,在剩余通道上加载 20 μL 的样品和 20 μL 的 1x 凝胶加载缓冲液。根据聚丙烯酰胺百分比,在 100 V 下运行凝胶 60-180 分钟。
   4. 凝胶一旦完成运行,从盒中取出凝胶,并将其放入含有 5μL 超敏感核酸凝胶染色的 5x TBE 缓冲液的盒中。
   5. 在摇臂上孵育5分钟,使RNA染色。
   6. 小心地将凝胶从包装盒中拿出来,并将其放在凝胶成像系统的紫外线透射器上,然后将水井向上,梯子位于左侧。
   7. 根据信号强度,将相机聚焦在凝胶上,打开紫外线,然后根据信号强度从 50 毫秒到 1 毫秒进行曝光,从而拍摄凝胶图像。
   8. 关闭紫外线曝光,并将图像另存为 Tiff 文件。
   9. 将凝胶放回盒子里。删除 TBE。在摇臂上,在室温下将凝胶固定在50 mL的固定溶液(50%甲醇、10%醋酸、40%超纯水)上30分钟。
   10. 再次轻轻地将凝胶移动到含有 25 mL 的自动放射增强溶液的新鲜黑盒中。在没有黑匣子的情况下,用铝箔盖住盒子,以保护溶液免受光线照射。
   11. 在摇臂上室温下孵育30分钟。
   12. 轻轻提起凝胶,将其正面朝下放在一块塑料包装上,将水井向上,梯子位于右侧。在凝胶背面放置两张色谱纸。轻轻翻转整个堆栈。
   13. 将凝胶干燥器预热至 80°C。将凝胶干燥器上的塑料盖移后。将包装纸、凝胶纸和色谱纸堆叠在塑料盖下方,然后将塑料盖移后,形成密封。
   14. 在凝胶干燥器中,在 80°C 下干燥 1 小时。
   15. 关闭凝胶干燥机并轻轻取出烟囱。取出包装纸和第二色谱纸。将剩余的色谱纸与干凝胶一起用在自动放射录相盒中。
   16. 在黑暗的房间里添加1张自动辐射膜。
   17. 将盒式磁带置于-80°C,并根据信号强度在 1 小时到 4 周后制作薄膜,根据先前测得的闪烁计数可以判断:250-1,000 cpm 为 1-4 周,1000-10,000 cpm 为 1h 至 24 h 至 24 h,为 >10,000 cpm.
   18. 薄膜开发完成后,将薄膜放在盒式磁带顶部,并仔细标记凝胶的 4 个边缘(每个边缘)以及 XC 和 BB 染料的位置。
   19. 以每英寸 300 或 600 像素的分辨率扫描胶片,并将图像另存为 Tiff 文件。

体外转录反应
图 2A表示与 7SK snRNA 的 T7 RNA 聚合酶的体外转录反应的典型运行,该酶是相对较短(331 nt)和结构高度结构化的 RNA。如该原始图像所示,有多个不需要的波段,时间都短于 7SK,可能是随机转录启动或终止事件造成的。因此,体外转录反应后的凝胶纯化对于获得干净的RNA样本非常重要,如图2B所示。 此时,感兴趣的RNA可以通过相对于梯子的位置进行识别,并通过凝胶纯化进行纯化。

如前所述,在凝胶纯化步骤之前,可能需要优化转录反应的长度。长时间转录反应会导致极高的RNA产生,使下游难以识别正确的转录。使用特定的引录剂通过逆转录和定量PCR(RTqPCR)验证纯化抄本的身份也很重要。

体外RNA甲基转移酶测定
图 3显示了协议中使用我们推荐RNA和蛋白质浓度的下限描述的RNA甲基转移酶测定的代表性结果。此测定允许闪烁计数的定量结果,以及自射图的定性结果。在这里,MePCE,一种已知甲基化7SK¹⁰的RNA甲基转移酶,被证明能够同时甲基化U6。此外,正如最近7SK¹⁶所示,将组蛋白H4与MePCE结合也抑制U6甲基化。我们能够在闪烁计数(图3C)和自动放射图(图3B)中观察到这一点,显示了该协议的鲁棒性。

图 1.典型RNA甲基转移酶测定工作流程的原理表和预期结果。辛霉辛是一种具有竞争力的甲基转移酶抑制剂。L:梯子;WT:野生型;M:催化突变体;cpm:每分钟数数。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2.代表性实验显示在变性尿素-聚丙烯酰胺8%凝胶上,在变性尿素-聚丙烯酰胺8%凝胶上,在(A)和(B)纯化之前和(B)纯化后,有外体转录产物。箭头指向凝胶纯化前后的 7SK 成绩单。L:梯子。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3.体外RNA甲基转移酶测定与MePCE对U6进行。体外甲基转移酶测定使用重组剂GST-MePCE(25 nM),3个H-放射性SAM作为甲基组供体,体外转录U6RNA(50 nM)作为基质。 自动辐射图暴露2周,以检测_Histone H4样品中的残留活性(250 cpm)。请点击此处查看此图的较大版本。

在这里,报告了一种简单而可靠的方法,用于对特定转录本进行RNA甲基转移酶活性的体外验证。该测定利用了S-腺苷可对甲基组供体进行三聚酯(图1)的事实,使得甲基化RNA在不使用抗体的情况下能够准确检测。然而,需要注意的是,这种测定不能指示酶甲基化的残留物或化学组。为了识别或验证特定残留物是否甲基化,其他方法,如突变分析、逆转录块或RNA基质谱分析,可与RNA甲基转移酶测定结合使用。

RNA的选择及其合成方式取决于RNA的大小。18 到 120 nt 之间的特定 RNA 可以从许多知名的核酸提供者方便地定制合成。然而,最常见的是,各种大小的特定RNA在体外转录。体外转录的DNA模板可以以各种方式生成,并且要求感兴趣的序列位于T7或SP6启动子的下游。当RNA的精确末端很重要时,建议使用pRZ质粒17。高灵敏度的测定(图3)也允许用细胞RNA的混合物替代纯化的RNA,例如总RNA或信使RNA。事实上,凝胶和自动放射图提供了一种直接观察甲基化目标RNA的大小的方法。

在协议第2.1步中报告的条件最适合BIN3的甲基转移酶家族,该家族在人类中具有两种同源性,MePCE¹⁰和BCDIN3D^9。需要强调的是,测定条件需要根据感兴趣的特定蛋白质和RNA进行调整。例如,研究表明,MgCl₂的存在降低了 BCDIN3D 活性^18,但是,MgCl₂可以成为 RNA 结构的重要协调器,因此可以构成其他 RNA 测定的重要成分甲基 转移 酶。

使用自动放射图(可以长时间曝光)的优点是,它可以检测闪烁测定中未检测到的非常弱的活动。通常这表明蛋白质是甲基转移酶,但一个或多个反应条件或试剂需要优化:酶;基板、副因子、缓冲条件等⁹。例如,可能需要改进酶纯化以去除或更改标签的位置。也可能作为基质的RNA需要正确折叠,或与另一种蛋白质或RNA因子相互作用,以便被酶甲基化。因此,需要仔细审查细胞中已有的文献和/或自身结果,以设置感兴趣的酶和RNA的测定条件。

测定也非常灵活。例如,它可以是另一种检测类型的前体步骤,因此放射性甲基化RNA用于定量和定性脱甲基酶测定11,或在RNA结合测定中,允许具体可视化甲基化RNA与未修饰的RNA相比。该测定也可以轻轻调整,以分析使用可放射性标记的辅酶的RNA的修饰,如乙酰辅酶A用于RNA乙酰化19、20的研究。

作者没有什么可透露的。

作者要感谢图里亚·坎蒂·德布纳特博士对ChemDraw的帮助。Xhemalée 实验室的研究得到国防部 - 国会指导医学研究计划 - 乳腺癌突破奖 (W81XWH-16-1-0352), NIH 格兰特 R01 GM127802 和细胞和研究所的启动资金支持美国奥斯汀得克萨斯大学分子生物学和自然科学学院。