建立和表征三个抗阿法替尼的肺腺癌PC-9细胞系与增加剂量的阿法替尼开发

开发了一种从肺腺癌PC-9细胞中建立抗阿法替尼细胞系的方法,并对抗性细胞进行了特征描述。该耐药细胞可用于研究表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂抑制剂机制,适用于非小细胞肺癌患者。

分子靶向抑制剂的习得抗药性是癌症治疗中的一个严重问题。在大多数国家,肺癌仍然是导致癌症相关死亡的主要原因。发现"致癌驱动因素突变",如表皮生长因子受体(EGFR)-激活突变,以及随后开发EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)(gefitinib,erlotinib,近几十年来,阿法替尼、达科米尼布和奥西米替尼的肺癌治疗发生了戏剧性的变化。然而,这些药物仍然不能有效在非小细胞肺癌(NSCLC)携带EGFR激活突变的患者。在获得抗药性后,NSCLC的系统性进展仍然是治疗EGFR突变阳性NSCLC患者的重大障碍。在这里,我们提出了一个逐步剂量升级方法,用于从NSCLC PC-9细胞中建立三个独立的获得性阿法替尼耐药细胞系,在EGFR exon 19中携带EGFR-激活突变的15碱基对。简要介绍了三个独立的阿法替尼-抗细胞系的特征化方法。EGFR TKIs 的后天电阻机制是异构的。因此,必须检查对EGFR-TKIs具有获得性强的多个细胞系。使用这种循序渐进的剂量升级方法,需要10到12个月才能获得具有获得性耐药性的细胞系。发现新的后天抵抗机制将有助于制定更有效和安全的治疗策略。

五种酪氨酸激酶抑制剂,靶向表皮生长因子受体(EGFR),包括格菲替尼、埃尔洛替尼、阿法替尼、达科米替尼和奥西米替尼,目前可用于治疗EGFR突变阳性非小细胞肺患者癌症(NSCLC)。在过去的十年中,随着新的潜在EGFR-TKIs的发现,针对此类患者的疗法得到了巨大的发展。在肺腺癌患者中,大约50%的亚洲人和15%的白种人患者中,在EGFR中发现细胞^突变。EGFR中最常见的突变是EGFR外电21和15碱基对(bp)缺失中的EGFR外电19²中的L858R点突变。在NSCLC的EGFR突变阳性患者中,EGFR-TKIs比以前的铂双子^化疗3标准提高了反应率和临床结果。

格菲替尼和埃尔洛替尼是第一批经批准的小分子抑制剂,通常被称为第一代EGFR TKIs。这些EGFR TKI通过与ATP竞争和逆向结合到ATP结合位点4来阻止酪氨酸激酶活性。阿法替尼是第二代EGFR TKI,不可逆转和共价结合于EGFR的酪氨酸激酶域,并被定性为泛人EGFR家族抑制剂5。

尽管这些疗法在NSCLC患者中具有显著的好处,但获得抗药性是不可避免的。对第一代和第二代EGFRTKIs最常见的抗药性机制是EGFR外大20中T790M突变的出现,该突变存在于肿瘤样本6、7、8的50-70%中。其他抵抗机制包括旁路信号(对MET,IGF1R和HER2),转化为小细胞肺癌,和诱导上皮到中位体过渡,这发生在临床前和临床9。EGFR TKI 的电阻机制是异构的。通过在临床前研究中识别新的抗药性机制,有可能开发新的治疗方法来克服耐药性。最佳序列疗法,使患者的临床效益最大化,必须考虑抵抗机制和治疗目标。

必须选择正确的亲细胞系,因为它是所有后续实验的基础。选择策略从临床相关性开始;有必要选择化疗和放疗幼稚的细胞系。以前的化疗和/或放射治疗可能诱发耐药性途径的改变和耐药性标记物表达的变化。在这项研究中,PC-9细胞,携带15 bp缺失在EGFR exon 19,用于建立对阿法替尼的后天抵抗。该细胞系来自一名日本NSCLC患者,他之前没有接受化疗和放疗。

由于阿法替尼是每天口服的,持续的体外治疗,其中细胞在阿法替尼的存在下不断培养,在临床上是相关的。实验各步骤中使用的药物剂量必须针对所选的亲子细胞系进行优化。细胞毒性测定可用于确定合适的药物范围,该范围应与药物的药代动力学信息相媲美。

在整个选择过程中,整个细胞群作为一个群体保持;不使用克隆或其他分离方法。细胞首先持续暴露于低水平的药物。随后,在细胞适应在药物存在的情况下生长后,药物的剂量缓慢地增加到药物10、11的最终最佳剂量。或者,脉冲药物管理或诱变可用于选择抗药性细胞,这些细胞也在^{药物治疗12、13}之前进行。不幸的是,一般不报告耐药性没有发展的情况。制定选择策略的目的是试图模拟癌症患者的条件,以重建临床相关的抗药性。有时,为了识别与耐药性机制相关的分子变化,使用高药物浓度。这种模式在临床上变得不那么相关。

在这里,我们描述了一种从PC-9细胞中建立三个独立的抗阿法替尼细胞系的方法,在EGFR exon 19中含有15 bp缺失,以及抗阿法替尼细胞系的初始表征。

1. 建立三个独立的抗阿法替尼PC-9细胞系

1. 使用3-(4,5-二甲基硫磷-2-yl)测定PC-9细胞的初始阿法替尼暴露浓度-2,5-二苯基四甲二甲二苯溴二甲二甲二甲苯(MTT)测定
   1. 在生长培养基中培养PC-9细胞,含有胎儿牛血清(10%)、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100微克/mL),在37°C的5%CO₂培养箱中处理10厘米的培养皿中。
   2. 在生长培养基中重新悬浮PC-9细胞,在生长培养基中重新悬浮4×10⁴细胞/mL,然后在96孔微孔盘中以50μL/孔播种。细胞的最终浓度为2.0 x 10³细胞/50μL/井。在 37°C 的5% CO2 培养箱中孵育过夜。
   3. 在不同浓度下加入50 μL的阿法替尼溶液:0、0.002、0.006、0.02、0.06、0.2、0.6、2、6和20 μM,以含有生长培养基(50μL)的井。阿法替尼的最终体积和浓度分别为100μL和0,0.001,0.003,0.01,0.03,0.1,0.3,1,3和10μM。
   4. 在 37°C 的 5% CO₂培养箱中孵育 96 孔板 96 小时。
   5. 向每口井添加15μL染料溶液(见材料表),在37°C的5%CO2培养箱中孵育4小时,然后向每口井中加入100μL的溶解/停止溶液(见材料表),并在5%的CO中孵育过夜。c10+2培养箱在37°C。
   6. 使用微孔板读取器测量 570 nm (OD₅₇₀₎的光学密度(参见材料表)。准备6-12复制和重复实验至少三次。
   7. 使用统计软件(参见材料表)以图形方式将这些数据绘制为半日志图,并计算 IC₅₀值,该值是将响应降低到其最大值的 50% 的药物浓度(参见材料表)).
2. PC-9细胞连续接触不可逆的EGFR-TKI,阿法替尼,在三个独立的10厘米菜中逐步增加剂量
   1. 培养PC-9细胞在p100菜中含有10mL的生长培养基。当PC-9细胞达到亚汇流阶段时,将1mL的细胞悬浮液转移到三个新的p100盘中,具有9 mL的生长介质。1:10稀释的PC-9细胞在3-4天内成为亚汇合体,细胞数约为4-5 x 10⁵细胞/mL。
   2. 第二天,在三个 p100 盘中加入 1/10 的 IC₅₀值的 afatinib。
      注:Afatinib 在 DMSO 中重组,库存浓度为 1 μM、10 μM、100 μM、1 mM 和 5 mM。根据所需的最终浓度,将1至10μL的法替尼溶液添加到培养基的10 mL生长培养基中。
   3. 当含有afatinib的p100盘中的细胞变成亚汇合时,用1mL移液器吸入,并在新的p100盘中将1mL的细胞悬浮液添加到9 mL的新鲜生长培养基中。接下来,在新的文化中加入10-20%高浓度的阿法替尼。
   4. 通过逐步剂量升级,在介质中增加0.1 nM至1 μM的阿法替尼浓度,在10-12个月内,阿法替尼浓度每步增加10-20%。
      注:当阿法替尼浓度接近IC₅₀值时,细胞生长变得相当缓慢。如果细胞被分割为1:9,它们可能不会生长,因为这些细胞被更高浓度的阿法替尼杀死。因此,在较高的阿凡尼替布浓度下,细胞可以以1:2的比例分裂。最具抵抗力的细胞在阿法替尼包含的培养基中生长3-14天,直到抗性细胞需要通过,该培养基才改变。
   5. 在1μM阿法替尼含有生长培养基培养2-3个月的抗阿法替尼细胞。在阿法替尼浓度为1μM时,需要10-12个月才能在此模型中产生对阿法替尼的抗药性。执行MTT测定,确认细胞对阿法替尼有抵抗力。三个独立建立的阿法替尼抗细胞系分别命名为AFR1、AFR2和AFR3。

2. 三个独立抗阿法替尼细胞的特性

1. 父母PC-9细胞的生长曲线的确定和抗脂肪细胞的建立
   1. 在 37°C 的 5%_CO2培养箱中培养 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞。
   2. 用生长培养基将细胞重新悬浮在5 x 10³细胞/mL上,将种子100μL/孔放入96孔微孔板中,使细胞的最终浓度为500细胞/100μL/孔。
      注:执行 MTT 测定以在 0、1、2、3、5 和 7 天测量 OD₅₇₀值。每天需要六个 96 孔微孔板。
   3. 每 24 小时执行 MTT 测定,然后在 0、1、2、3、5 和 7 天执行 MTT 测定。测量 OD₅₇₀值并准备 6-12 个复制;重复实验至少三次,并使用统计软件以图形方式绘制结果(参见材料表)。
2. 通过实时PCR识别EGFR中的基因组DNA变化
   注:阿法替尼是一种小分子抑制剂,靶向EGFR酪氨酸激酶。EGFR表达状态在DNA和蛋白质水平确定。
   1. 根据制造商的说明,使用DNA纯化试剂盒(见材料表)分离基因组DNA。使用分光光度计测量分离基因组DNA的浓度(参见材料表),并将所有基因组DNA样本调整到25纳克/μL。
   2. 使用SYBR绿色主组合(见材料表)放大基因组DNA的50 ng,相当于25纳克/μL库存的2μL,并使用基于荧光的RT-PCR检测系统分析结果(见材料表)。
      注:PCR 循环条件从在 95°C 处初始变性步骤开始,为 20 s,然后是 40 个循环的 95 °C 变性 3 s,60 °C 退火 30 s。具体引物集如下:EGFR F:5+-CAAGGCCATATATCTCTCTCTCTCTCTCTCA-3_,R:5+-CTAGAGGGGGGAGGAA-3_。标准化基因LINE-1 F:5+-AAGCCGCTCAACTG-3_,R:5+-TGCTATATGGCGCAGAG-3_。
3. 西方污点分析对蛋白质改变对EGFR水平影响的评价
   1. 在24小时洗涤PC-9、AFR1、AFR2和AFR3细胞用PBS进行两次实验前,连续用法替尼处理细胞,然后在无法替尼的生长培养中播种。用 5 mL 的冷 PBS 清洗 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 电池两次。
   2. 在RIPA缓冲液中裂解含有1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(见材料表)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒II和III(见材料表),并在4°C孵育此溶液30分钟。将裂解物离心10分钟在100 x g和4°C时,收集清除的莱沙。
   3. 使用双辛辛酸测定测定蛋白质浓度(见材料表),使用4x样品缓冲液(500 mM Tris(PH 6.8),40%甘油,8%SDS,20%H₂O,0.02%溴酚蓝色)调整所有蛋白质样品至0.5或1微克/μL。在96°C下煮5分钟,将这些蛋白质样品储存在-80°C,直到进行西斑分析。
   4. 将等量的蛋白质样品(优选为 20-30 μL)分离 8% SDS 页,并将蛋白质转移到聚氯乙烯 (PVDF) 膜中。
      注:硫酸二甲酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在实验室中通常用于根据分子量分离蛋白质。
      1. 用乙醇清洁玻璃板,组装玻璃板和垫片。制备含有1.5M Tris-HCl、pH 8.8、40%Bis-丙烯酰胺、10%SDS、10%APS和TEMED的8%聚丙烯酰胺凝胶。在室温下聚合30分钟。
      2. 随后,制备含有0.5M Tris-HCl、pH 6.8、40%双丙烯酰胺、10%SDS、10%APS和TEMED的堆叠凝胶。加入堆叠凝胶溶液,插入梳子,并在室温下将凝胶聚合20-30分钟。
      3. 将凝胶放入电泳装置中,用运行缓冲液(0.25 M Tris、1.92 M 甘氨酸和 1% SDS)填充油箱。加载相等量的蛋白质样品(20-30 μL),并在180 V下运行凝胶。
      4. 用TBST清洗凝胶1-2分钟,然后通过半干印迹(见材料表)将蛋白质转移到PVDF膜上,在300mA的恒定电流下1.5小时。
   5. 用5%的脱脂干牛奶(见材料表)在室温下用TBST溶液(见材料表)将膜堵塞1小时,然后用抗EGFR、抗磷-EGFR(Y1068)、抗HER2、抗HER2、抗磷-EGFR、抗HER2、抗磷-EGFR、抗HER2、抗磷-EGFR、抗磷-EGFR、抗HER2、抗磷脂、抗磷脂、抗磷、抗热乳(Y1068)、抗HER2、抗磷脂、抗磷脂、抗磷脂、抗磷脂、抗磷杀毒、抗磷脂、抗磷干牛奶、抗磷脂牛奶、抗磷脂牛奶、抗磷脂(Y1068)、抗HER2、抗磷干奶、抗磷脂、抗磷干牛奶、抗磷脂、抗磷脂、抗热膜、抗磷脂、抗热膜、抗HER3、抗MET和抗Actin抗体(在TBST中稀释1:3,000)(见材料表)在4°C过夜。
   6. 用TBST清洗膜三次10分钟,然后将膜暴露在二级抗体(在TBST中稀释1:200)1-1.5小时室温下。在室温下用TBST清洗膜5次10分钟,将其暴露于ECL溶液中(见材料表),并使用薄膜可视化信号。
4. 通过测序分析EGFR突变
   1. 使用EGFR外电19-21的特定引核素扩增基因组DNA。PCR 循环条件从在 94°C 处的初始变性步骤开始 1 分钟,随后在 98°C 下进行 30 次变性,10 秒,在 55°C 下退火 30 秒,在 72°C 下延长 1 分钟。
      注:EGFR exon 19 的具体引力:F:5+-GCATATCAGCCTGGCGCCTC-3_R:5_-CATAAAAGAAATATATATATGG-3_, 外向 20: F: F: F: 5°-CCATATATATATATATATATATATATATATATATATAACT-3_, R: 5_-CATATCTATATCTCTCTCTCTTGC-3_, 和 exon 21: F: 5°- ATAACATACATATATTATT-3_, R: 5°-格克塔卡帕加特加特格加加-3+。
   2. 使用PCR纯化试剂盒(见材料表)纯化扩增PCR产物,并对扩增剂进行测序。

图1显示了使用分步剂量升级程序从PC-9细胞中建立三个阿法替尼-抗细胞系的架构。图2显示,随着阿法替尼浓度的增加,父母PC-9细胞的细胞增殖减少,表明PC-9细胞对阿法替尼暴露敏感。图3显示了三个细胞系的阿法替尼抗性。三种抗阿法替尼细胞系AFR1、AFR2和AFR3均未显示在阿法替尼暴露下抑制细胞增殖。图 4显示了 PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞的细胞增殖曲线。三个抗阿法替尼细胞系的生长明显慢于亲亲PC-9细胞。图5显示了PC-9和三个抗阿法替尼细胞中EGFR gDNA的表达水平,这表明抗阿法替尼细胞表达的EGFR gDNA水平明显高于亲亲PC-9细胞。图6显示了PC-9和抗法替尼细胞中EGFR的蛋白质表达。在可比的gDNA表达水平下,抗性细胞中的EGFR蛋白表达高于父母PC-9细胞。图7显示PC-9、AFR1、AFR2和AFR3细胞中EGFR外大19和20的测序结果。PC-9细胞在EGFR exon 19和野生型EGFR中显示15bp缺失在外显子20。然而,AFR1和AFR2细胞表现出野生型EGFR外子19的扩增。AFR3细胞在EGFR外大19中含有15bp缺失,如PC-9细胞,但在EGFR外大20中观察到点突变T790M。

图 1:用于从PC-9建立三个抗阿法替尼细胞系的过程的架构。首先,PC-9细胞被分成三个p100盘,以IC₅₀值的1/10暴露于阿法替尼。接下来,生长培养基中的阿法替尼浓度通过分步剂量升高到1μM而增加。10-12个月后,建立了三个独立的抗阿法替尼细胞系,并命名为AFR1、AFR2和AFR3。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2:亲PC-9细胞对不可逆的EGFR TKI,阿法替尼敏感。细胞在生长培养基的2 x 10³细胞/孔/50μL下种子到96孔微孔板中,并在一夜之间预孵化。细胞用指示的阿法替尼浓度治疗96小时。执行MTT测定,使用微板读取器测量OD₅₇₀值(参见材料表),并代表对照单元获得的值的百分比。数据以 6-12 个复制井中值的平均值和 SEM 形式显示。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3:已建立的细胞表现出对不可逆的EGFR TKI,阿法替尼的抵抗力。细胞被播种到96孔微孔板中,在2 x 10³细胞/孔/50μL的生长培养基和预孵化过夜。细胞用指示的阿法替尼浓度治疗96小时。执行MTT测定,使用微板读取器测量OD₅₇₀值(参见材料表),并代表对照单元获得的值的百分比。数据以 6-12 个复制井中值的平均值和 SEM 形式显示。请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:抗阿法替尼细胞系的增殖速度比亲的PC-9细胞慢。细胞被播种到96孔微孔板在5 x 10²细胞/100μL/孔。使用微板读取器(参见材料表)在 0、1、2、3、5 和 7 天(参见材料表)执行 MTT 测定,并测量 OD₅₇₀值,并将其表示为控制单元获得的值的百分比。数据以 6-12 个复制井中值的平均值和 SEM 形式显示。请点击此处查看此图的较大版本。

图 5:在抗法替尼细胞中,EGFR的基因拷贝数升高。EGFR基因拷贝数的高程是通过从PC-9、AFR1、AFR2和AFR3细胞中分离的基因组DNA的定量PCR测量的。请点击此处查看此图的较大版本。

图 6:抗法替尼细胞中EGFR蛋白的基底水平增加。PC-9、AFR1、AFR2 和 AFR3 细胞中磷-EGFR、EGFR、HER2、HER3 和 MET 表达的西斑分析。β-Actin 用作负载控制。请点击此处查看此图的较大版本。

图 7:DNA序列在EGFR外号19和20中读取。PC-9、AFR1、AFR2和AFR3的基因组DNA被EGFR外生19和21的特定引基因扩增,并纯化为测序。请点击此处查看此图的较大版本。

在这里,我们描述了一种建立三个独立的抗阿法替尼细胞系的方法,并通过与亲的PC-9细胞进行比较来对这些细胞进行特征化。通过逐步剂量升级暴露,父母PC-9细胞在10-12个月内获得对阿法替尼的抵抗力。临床上,EGFR TKIs的抗性机制是异质的,因此,在使用阿法替尼进行初步治疗后,PC-9细胞被分成三个独立的p100碟,并进一步暴露在阿法替尼。最初,细胞生长没有显著减缓,但随着药物浓度接近IC₅₀值,细胞增殖减缓。这是获得对抑制剂的后天抗性细胞的关键步骤。增殖细胞应以1:10或1:5的比例分裂并转移到新的p100盘。当PC-9细胞在p100盘中培养时,观察到一些粘附性,但大多数细胞在悬浮中生长。随着阿法替尼浓度的增加,细胞粘附在组织培养处理的菜肴的底部。如果大多数细胞是附着的,它们可以通过细胞刮刀分离。阿法替尼的最终浓度为1μM,约为血清最大浓度(C最大值)14的5倍。为了获得亲子克隆和抗性克隆之间的明显差异,最终浓度设置为高于C_最大值。

即使 RPMI-1640 含有青霉素和链霉素,在手术过程中也是一个严重的问题是细菌污染。为了避免这种情况,当细胞分裂时,可以准备两个含有新鲜生长培养基的p100菜。当细胞到达亚汇合阶段时,一个p100盘中的细胞可以进一步分裂,而另一个p100盘中的细胞可以储存在-80°C的冷冻保存培养基(见材料表)作为备份,这样,如果一条线被污染,可以使用存储的行。

使用细胞培养法基尼的产生将很难完全复制人类的阿法替尼耐药性。据报道,EGFR外显子20中T790M突变的出现是阿法替尼抵抗的主要原因。在我们的报告中,一个抗药性克隆含有T790M^突变11。此外,我们和其他组^报告,野生型EGFR的增加,如AFR1和AFR2细胞。EGFR突变的丧失和野生型EGFR的增加也报告在临床样本从获得性抗EGFR-TKIs17,18的患者。 因此,我们目前模型的体外研究可能反映具有后天性临床标本的分子图谱。

这种分步剂量升级方法被认为是获得获得抗药性细胞系的最可靠方法。然而,在培养细胞中首次高剂量阿法替尼暴露可能更好地反映阿法替尼治疗对癌症患者的影响,尽管建立耐药细胞更加困难。不仅浮动细胞线,如PC-9,而且粘附细胞线,如HCC827,11-18,或HCC4006,可用于此方法。这种分步剂量升级方法对于使用代表其他类型的癌症的其他细胞系建立对其他抑制剂具有抗药性的克隆也很有用。

据报道,父母细胞暴露于诱变剂(如N-乙基-N-亚硝酸)中,然后选择对阿法替尼或奥西替尼治疗具有抗药性的细胞,以便快速获得耐药^{克隆19 ,20}.但是,这种人工方法倾向于导致特定的基替换,例如 GC 到 AT 转换和 AT 到 TA 转换。此外,EGFR TKI 不是 NSCLC 患者的诱变剂。因此,分步剂量升级的方法比使用诱变剂更具代表性。

虽然EGFRTKIs最初有效,但细胞最终对这种单靶药物产生抗药性,使得治疗癌症变得困难。因此,靶向多个分子的抑制剂对于开发至关重要。为此,有必要获得对多目标抑制剂的获得性抗药性的细胞,并评估耐药性背后的机制。

作者没有什么可透露的。

我们感谢高级癌症转化研究所的成员,感谢他们在英语编辑方面给予的周到评论和编辑。这项工作得到了JSPS KAKENHI(赠款编号:16K09590到T.Y.)的支持。