实验性曲霉病肺真菌负担的组织学定量测定

在这里我们描述了一个协议, 以确定侵袭性曲霉病小鼠肺部真菌负担的定量戈木日修饰甲胺银染色的组织学切片。这种方法的应用结果与较少的动物相比, 通过定量 PCR 的肺真菌 DNA 评估的真菌负担比较。

肺真菌负担的量化是确定肺真菌感染小鼠模型中免疫保护和真菌毒力相对水平的关键。虽然用多种方法评估真菌的负担, 但真菌 DNA 的定量聚合酶链反应 (qPCR) 已成为一种技术, 与以往的基于文化的方法相比具有多种优势。目前, 对侵袭性曲霉病 (IA) 小鼠的肺病理学、白细胞招募、真菌负担和基因表达进行综合评估, 必须使用大量的实验和控制动物。这里详细研究了用减少的动物数量来确定真菌负担的肺组织学染色的量化。肺切片染色, 以确定真菌结构与戈木日的改良甲胺银 (GMS) 染色。图像取自 GMS 染色的部分, 从4个离散的领域, 每一个福尔马林固定石蜡嵌入肺。每个图像中的 GMS 染色区域都使用图像分析程序进行量化, 从这个量化方法中, 每个样本都确定了染色面积的平均百分比。采用这一策略, 嗜酸细胞缺乏的小鼠在卡泊芬治疗中表现出真菌负担和疾病的减少, 而与卡泊芬的野生型小鼠没有改善。同样, 卡泊芬, qPCR 和 GMS 的定量测定, 也改善了缺乏γδ T 细胞的小鼠的真菌负担。因此, 将 GMS 量化作为一种测定相对肺部真菌负担的方法, 最终可能减少对侵袭性曲霉病进行综合研究所需的实验动物数量。

IA 是一种机会性感染, 可能会发展在有先天或后天免疫缺陷的敏感个体由于免疫抑制治疗或慢性感染^1,2。原发性感染通常发生在肺部, 虽然在某些情况下, 传播曲霉曲霉到肝脏, 肾脏, 心脏和大脑可能发生, 导致广泛组织侵入菌丝伴有严重疾病和高死亡率^1,2。此外, 现有 pharmacotherapies 的功效有限, 可能会因环境中抗真菌菌株的出现而进一步减弱³。因此, 重要的是要了解真菌毒力和宿主病理机制, 促进侵袭性真菌疾病的发展或恶化。

小鼠模型仍然是重要的机械 IA 研究, 因为他们允许研究人员评估真菌毒力基因和宿主免疫效应的作用, 以建立和增长的A. 曲霉在体内^4,5。因此, 为了有效地量化或比较实验动物组中的真菌负担, 设计了多种策略^6,7。这些策略包括基于文化的、生物化学的、免疫分析法或 qPCR 的方法, 每个都有明显的优缺点。此外, 这些方法中的每一个都涉及一个动物子集的奉献, 除了那些为评估免疫效应功能、基因表达分析和比较病理学⁷而牺牲的那些。因此, 综合 IA 研究往往需要大量的研究动物在一个巨大的成本。因此, 通过利用动物组织进行多种分析, 减少实验时间、动物成本和伦理考虑的有效策略是非常有价值的⁷。

在本报告中, 介绍了在组织学切片中对 GMS 染色的量化方法, 以比较实验组小鼠与 IA 的相对真菌负担。从真菌培养到感染、组织收获和加工、图像采集和数据分析的每一步都进行了详细描述。粒细胞减少模型中 qPCR 和卡泊芬处理的野生型或嗜酸性粒细胞缺陷小鼠与^ia8 进行比较, 得到了 GMS 定量的真菌负担。结果表明, 与 GMS 定量和 qPCR 真菌 DNA 相似。这表明, GMS 量化可能是有用的研究人员进行组织学分析, 作为一种补充或替代方法比较的相对真菌负担的小鼠与 IA, 并可能最终降低成本和使用的研究动物在复杂的, 机械的研究。

所有动物规程由印第安纳国立大学的动物照料和用途委员会批准, 印第安纳大学医学院的寄宿校园-渔村高级。

1. 用于感染的A. 曲霉孢子的制备

1. 在通风良好的油烟机中工作时, 将125µL曲霉293 库存解决方案添加到900µL 细胞培养级水 (CCGW) 中。然后通过吸管将溶液转移到麦芽萃取琼脂 (多边环境) 板上, 并均匀地与接种循环一起传播。
2. 在黑暗中储存24摄氏度的真菌片至少14天, 不超过28天。
3. 使用玻璃珠作为先前描述的⁹来收获孢子。
4. 将1.5 克0.5 毫米的玻璃珠倒入板上, 轻轻地来回倾斜, 直到珠子被涂上以提取孢子。在15毫升圆锥管中收集珠/孢子混合物。悬浮在5毫升 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 和漩涡。
5. 用 hemocytometer 对 DPBS 中上清的50x 稀释中的孢子进行计数。计算图 1所示区域中的生孢子数, 并使用等式 1计算浓度。
   #Conidia x 稀释因子 x 10⁴= 孢子/mL (等式 1)
   注意: 可以计算额外的 4 x 4 平方角区域, 这些区域的平均值在等式 1中用作 #Conidia。

图 1: 用于分孢子计数的 Hemocytometer 代表性区域 (框、箭头)。

6. 用无菌生理盐水稀释孢子悬浮液 (DPBS), 以获得所需浓度, 1.0 x 10⁸孢子/毫升, 用于感染 5 x 10⁶ conidia/50 µL. 准备50µL 的孢子溶液每 ' n + 2 ' 小鼠被感染占吹打错误.
   注: 标准菌的收获和准备/过滤可以交替使用¹⁰。玻璃珠法是最好的方法, 以确保获得最小的小/可溶性菌丝抗原的孢子样品的渴望。

2. 免疫抑制和小鼠模型感染

1. 使用7-10 周大的老鼠。
   注: 本研究采用 BALB、C57BL/6 (B6)、嗜酸细胞缺乏 (ΔdblGATA、BALB/c 背景) 和γδ T 淋巴细胞缺失 (TCRδ/B6 背景) 小鼠。对于每个实验, 年龄和性别匹配 (男性和女性) 小鼠被用于每组。
2. 耗尽中性粒细胞通过腹腔 (IP) 注射0.1 毫升 (0.5 毫克) anti-mouse-Ly-6G 抗体, 在45°在右下象限的不育盐水中 (为实验计划, 请参阅图 2)。
3. 24小时后, 通过吸入感染小鼠 5.0 x 10⁶A. 曲霉孢子悬浮在50µL 无菌生理盐水中 (见步骤 2.4-2.10), 如前所述¹¹。继感染后, 在本研究中使用的 DPBS 中注射抗真菌剂 (如5毫克/千克卡泊芬双乙酸) 的动物子集 (每日, 请参阅图 2)。
4. 用兽医麻醉机麻醉99.9% 异氟醚的小鼠。
   1. 将纸巾放在感应室的地板上, 以捕获粪便和尿液。
   2. 将鼠标放在感应腔内, 确保盖子的安全, 并将蒸发器设置为5% 异氟醚, 2 分钟, 三十年代。
      注: 不使用兽医软膏, 因为麻醉总时间少于5分钟。
   3. 将蒸发器减少到三十年代最大设置的一半。
5. 通过观察慢呼吸, 缺乏运动, 以及对脚趾捏刺激缺乏反应, 确认老鼠被适当麻醉。
6. 从感应腔中取出鼠标并放置在斜板上。将鼠标向后放在板上。确保其上切牙被带橡皮筋轻轻地约束, 下切门牙用金属丝轻轻地抑制。
7. 用小钳和吸管50µL 的孢子/PBS 悬浮在舌头的基础上, 小心地握住舌头。
8. 保持舌头完全伸展;倾听呼吸急促的声音和渴望的明显的点击声。保持二十年代或直到悬浮完全吸气。
9. 从斜板上取下鼠标, 轻轻地放在笼子里观察。
10. 在吸入后, 老鼠应在1分钟内恢复知觉. 监视鼠标直到完全清醒, 并能够绕着笼子走。动物应该被安置在21°c 并且每日被监视两次直到肺被收获。
11. 重复嗜中性粒细胞 (步骤 2.2) 24 h 感染后的损耗 (图 2)。

图 2: 实验计划.此数字是从以前的出版物⁸中修改的。

3. 小鼠肺的采集和保存进行组织学分析

1. 深麻醉的动物与致命剂量的0.1 毫升390毫克/毫升戊巴比妥钠溶液 IP。
2. 通过观察缺乏自发性呼吸和缺乏对肢体刺激的镊子的反应来确认安乐死。一旦安乐死, 用70% 乙醇喷洒尸体以杀菌。
3. 将屠体放在覆盖有吸收垫的泡沫板上。
   注: 该屠体应放在其背上, 用别针将所有四只四肢固定在泡沫板上。
4. 小心使用剪刀打开上胸腔。为了暴露肺部和心脏, 把肋骨剪掉。切开下腔静脉, 允许灌注。避免切割血管和穿刺器官。
5. 用25克针慢慢地在心脏右心室灌注5毫升的冷 DPBS。重复灌注5毫升10% 福尔马林。
6. 小心地暴露气管并分离周围的脂肪垫。慎用, 避免穿刺气管。确保多余的结缔组织被删除, 以充分可视化气管, 然后再继续。一旦气管暴露, 将镊子放在气管下面, 将其抬高。
7. 用25克针戳上气管上的一个小孔。
   注: 孔应定位, 使整个套管适合气管。小心避免气管破裂。
8. 插入套管通过孔和向肺部。在气管周围松散的外科螺纹固定套管。
   注: 如果气管破裂, 套管可能会在气管内尽可能地插入到呼吸道。
9. 使用注射器, 用1毫升10% 福尔马林缓冲器通过套管充气肺部。确保肺部的膨胀是可见的。如果没有, 调整导管并重复。一旦肺部膨胀, 迅速取出套管小心, 并拧紧线程安全地封闭气管。
   注: 如果气管破裂, 肺部不能充气, 肺部可能仍会被收割, 但这可能会阻止正确的固定。
10. 小心地将气管与镊子的结缔组织连接在一起, 轻轻地拉上螺纹, 轻轻地将气管和肺部从胸腔中取出。将肺部和气管放在50毫升圆锥管中, 15 毫升10% 福尔马林缓冲器。将螺纹的一端置于管外, 并密封盖。倒置管完全淹没在固定的样品。
11. 将样品在室温下贮存至少24小时, 或直至进一步加工。
    警告:福尔马林是危险的。佩戴适当的个人防护设备, 包括护目镜和口罩。处理样品时, 在化学罩下工作。

4. 小鼠肺部 DNA 真菌负担的收获和保存

1. 按照上面描述的一个单独的鼠标执行步骤 3.1-3.5。
2. 用25克针慢慢地在心脏右心室灌注10毫升的冷 DPBS。
3. 用剪刀将肺部和放置在标记的1.5 毫升管上。
4. 储存肺部在-80 °c, 直到进一步处理。
5. 使用所描述的标准技术 (嵌入和切片), 并根据制造商的协议 (请参阅材料表)。

5. 显微和成像

1. 打开图像量化程序 (请参阅材料表)。
2. 使用光显微镜, 获得至少4个不同领域的 GMS 彩色幻灯片 (10X 目标)。确保图像在肺部内受感染的呼吸道具有类似组织密度的代表性。
   注: 如果菌丝病灶的密度和分布明显不同于对照组和实验群之间, 则可采取额外的电场, 或整个肺切片的 GMS 面积可成像 (4X 目标)。如果需要, 获得与苏木精和伊红染色的连续肺切片的肺相同区域 (由等效组织形态学鉴定) 的图像。
3. 在必要时向图像中添加缩放条, 并保存要量化的图像。选择、编辑 > 添加/编辑校准标记 > 菜单: 选择线条粗细、颜色和缩放栏大小 > 单击要放置缩放条的图像。关闭菜单并选择、编辑 > 合并 > 合并校准标记 > 选择文件保存为 > 命名文件并单击 "保存"。

6. 使用图像处理程序计算真菌负担 (图 3)

1. 打开图像处理程序。选择带有示例的 "文件" > "文件夹" 以量化 > 图像 (图 3A)。选择 "图像" > "类型" > "转换为" RGB 堆栈 "(图 3B)。
2. 使用右箭头键选择三给定图像的第二个 (图 3B)。点击 "控制 + shift + T" 以弹出 "阈值" 菜单设置调节器 (图 3C)。将原始. tiff 或. jpg 图像定位为参考, 并使用图像查看程序 (图 3C) 打开。
3. 将顶部滑块一直向左拖动, 然后调整底部滑块, 直到所选区域 (以红色表示) 是显微图像的代表 (通常从滑块的右侧 (图 3C) 中所示的130-160 不等。
4. 选中后, 按 "设置" > "确定" (图 3D)。选择 "分析" > "设置测量" > 检查 "区域、区域分数、限制阈值、显示标签", 并保留底部设置 (下拉菜单和小数位) 作为默认 > "确定" (图 3D)。
5. 空白或背景染色的重要区域可能被排除通过选择适当的组织与区域或多边形工具。
6. 最后选择 "分析" > "度量" (显示一个带有数据的窗口, 或者 windows 任务栏上的选项卡将出现标记为 "结果") (图 3E)。将数据传输到数据分析程序以进行图形和统计分析。
7. 输入每个肺样本的四面积百分比的平均值。5-8 样本通常足以检测组之间的显著差异。如果比较两个实验组, 请执行未配对学生的t测试以确定其重要性。

图 3: 用于 GMS 组织学场量化的每个步骤的典型截图.(A) 选择带有示例的 "文件" > "文件夹" 以量化 > "选择图像"。(B) 选择图像 > 类型 > 转换为 "RGB 堆栈"。使用右箭头键选择三给定图像的第二个。(C) 命中 "控制 + shift + T" 以提出 "阈值" 菜单设置调节器。将原始. tiff 或. jpg 图像定位为参考, 并使用照片查看器程序打开。向左拉顶部滑块并调整底部滑块, 直到选定区域 (以红色表示) 是显微图像的代表 (通常从滑块右侧显示的130-160 不等)。(D) 一旦选中按下 "设置" > "确定"。选择 "分析" > "设置测量" > 检查 "区域, 区域分数, 限制阈值, 显示标签", 并保留底部设置 (下拉菜单和小数位) 作为默认 > "OK"。(E) 最后选择 "分析" > "度量" (显示一个带有数据的窗口, 或者 windows 任务栏上的选项卡将显示为 "结果")。请单击此处查看此图的较大版本.

7. DNA 真菌负担

1. 从-80 摄氏度和 lyophilize 中取出肺部至少4小时 (隔夜是最佳的), 或直到完全干燥的冷冻干燥系统。
2. 当肺干燥时, 准备 DNA 提取缓冲器 (0.1 米氯化钠, 10 毫米 EDTA ph 值 8.0, 10 毫米三盐酸盐 ph 值 8.0, 和 0.5% SDS)。
3. 将准备好的 DNA 提取缓冲器放在60摄氏度的水浴中预热。另外, 放置苯酚: 氯仿: 异戊醇 (25:24:1) 在50毫升圆锥管和允许分离。
4. 将冻干肺放在2毫升螺钉盖管中, 0.2 毫升玻璃珠。使用一个珠搅拌器, 研磨干燥的肺组织为 15-30 s, 直到它形成一个细粉。
5. 将0.8 毫升的热 DNA 提取缓冲器添加到每个管和涡旋井中。在65摄氏度的珠浴中孵化每管15分钟, 然后在孵化前再进行涡流, 再增加15分钟。孵化后, 涡旋, 然后离心管在 2.5万 x g 10 分钟。
6. 为每个样品贴上3套1.5 毫升管, 并将上清上一层转移到一组管子中。在吹打水顶层时要小心, 以免干扰中间层。
7. 加入等量的 phenol:chloroform:isoamyl 醇, 混合均匀。然后离心机在 2.5万 x g 15 分钟之前, 吹打出上层到第二套管。
8. 增加等量的氯仿: 异戊氯仿, 混合好, 离心机在 2.5万 x 克10分钟. 小心地将上层的吸管移出第三组管子。
9. 添加500µL 异丙醇和50µL NaoAc (pH 5.2), 混合良好, 并允许样品在室温下孵化10分钟。然后离心机在 2.5万 x g 30 分钟和醒酒上清。
10. 用750µL 冰冷70% 乙醇和离心机清洗 DNA 颗粒, 在 2.5万 x g 上醒酒乙醇, 并允许颗粒在通风管中空气干燥40分钟。
11. 并用重悬300µL 的干颗粒。
    注: DNA 可以储存在-20 摄氏度, 直到量化。
12. 使用分光光度计量化 dna, 并准备100µL 0.2 µg/µL 每个 dna 样本进行 qPCR 分析。
13. 执行标准 qPCR, 如前所述, 1 µg 的 DNA 样本, 真菌 18S rDNA 底漆, 和探针集与改进的探针淬火 (5 '-/56-/AGC CAG CGG/禅宗/CCC),^G/3IABkFQ/-3') 12, 13.
14. 从曲霉基因组 DNA 中准备一个标准曲线, 并使用平均记者染料 Ct 值计算每个样本中 pg 的真菌 DNA 浓度。
15. 用平均值的标准误差绘制真菌 DNA 的 pg/µg。执行学生的t测试分析以确定其重要性。
    注: 作为一种毒性较低的替代苯酚-氯仿 dna 提取在这里使用, 柱基 dna 提取套件可以使用。

图 4包括卡泊芬治疗 IA 的野生型或嗜酸细胞不足小鼠生存图。结果表明, 嗜酸性粒细胞不足的小鼠与野生型小鼠相比 (分别为50% 的死亡率和100% 的死亡率) 表现出更大的生存率。图 5显示了由粒细胞减少野生型和嗜酸性粒细胞不足的小鼠卡泊芬治疗或未治疗的代表性 GMS 染色。卡泊芬治疗导致嗜酸细胞缺乏的相对真菌清除, 但不是野生型小鼠 (右面板), 而两组没有收到卡泊芬是相似的 (左面板)。图 6显示了卡泊芬治疗和控制未经处理的野生型或嗜酸细胞缺乏小鼠的真菌负担的比较, 使用真菌 DNA 的 qPCR (图 6A) 和代表性的 GMS 量化 4 (10X 客观) 领域 (图 6B)。这两种技术产生的结果表明, 卡泊芬治疗导致野生型和嗜酸细胞不足小鼠最显著的真菌负担减少 (图 6A)。然而, 在未经治疗的小鼠中, 只有 GMS 量化导致缺乏嗜酸性粒细胞的小鼠显著减少 (图 6B)。计算全肺 GMS 染色断面平均面积 (4X 目标) 时, 其差异与4个代表性10X 字段的结果相似, 但统计意义较小 (图 6C)。图 7显示了具有代表性的 GMS 染色 (4 个10X 字段) 的生存期、图像和真菌负担的两种方法在γδ T 细胞缺乏 (TCRδKO) 小鼠的治疗与控制, 未经治疗的小鼠的卡泊芬。卡泊芬治疗改善生存 (图 7A) 和真菌负担 (图 7BD) 在 TCRδKO 小鼠。与图 6的结果类似, 由 qPCR (图 7B) 和代表性 GMS 量化 (图 7C) 测量的真菌负担的结果是可比较的。

图 4: 卡泊芬治疗后嗜酸性粒细胞缺乏 (ΔdblGATA) 小鼠的存活率增加.15-30 小鼠/组。3-6 项实验总结。p < 0.0001。此数字是从以前的出版物⁸中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 由野生型、嗜酸性粒细胞缺乏、卡泊芬治疗或控制未治疗的小鼠与 IA 染色的肺切片的代表性图像.代表3-4 只老鼠/组。刻度条等效于100µm。此数字是从以前的出版物⁸中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6: 卡泊芬治疗或控制的野生型嗜酸粒细胞不足小鼠的真菌负担.(A) qPCR 真菌 DNA。15-30 小鼠/组, 总结3-6 项实验。(B) gms 定量的组织学切片, mean% 4 个领域的 gms 染色 (10x 目标)。(C) GMS 量化, mean% 全肺切片 (4X 目标)。B 和 C 是5小鼠/组的总结。* p < 0.05。p < 0.001。p < 0.0001。此数字是使用以前发布的⁸中报告的数据生成的。请单击此处查看此图的较大版本.

图 7: 卡泊芬治疗后γδ T 细胞缺陷小鼠 IA 的严重程度下降.(A) 生存。(B) 真菌 DNA 的 qPCR。(C) GMS 对组织学的量化。(D) 由γδ T 细胞与 IA、治疗或未治疗的卡泊芬染色切片的代表性图像。a 和 B 是两个实验的总结, 7-10 只老鼠/组。C 和 D 是4小鼠/组的总结。* p < 0.05。** p < 0.01。p < 0.001。此数字是从以前的出版物⁸中修改的。请单击此处查看此图的较大版本.

本文的目的是通过利用 GMS 染色的肺组织学切片进行图像分析和定量分析, 介绍一种测定 IA 小鼠肺真菌负担的方法。在本研究中, 用β葡聚糖合成靶向抗真菌药物卡泊芬¹⁴的治疗并没有改善粒细胞减少野生型小鼠的生存或真菌负担 (^IA8)。然而, 在缺乏嗜酸性粒细胞或γδ T 淋巴细胞的情况下, 生存和真菌负担有所改善。我们的研究结果还表明, 与广泛使用的真菌 DNA qPCR 方法⁶相比, GMS 真菌负担可获得可比结果。

利用 GMS 真菌负担量化有几个好处。首先, 该过程可能利用现有的组织学样本, 从而有可能减少所需的实验数量, 以确定重大差异。第二, 在这项研究中, 比起真菌 DNA 的 qPCR, 对 GMS 的真菌负担量化需要较少的动物 (图 6,图 7)。第三, 在核糖体 DNA 拷贝数¹⁵中, 不同分离株的真菌负担的比较可能受 qPCR 的差异的影响。相比之下, GMS 量化不受复制数的影响, 因为真菌负担是由相对水平的肺部真菌生长决定的。因此, 使用 GMS 定量的真菌负担减少了对脊椎动物的使用, 不需要预先确定 rDNA 复制号。最后, 除了改变真菌的形态, 卡泊芬疗法增加真菌碎片, 从而可以人为地增加真菌负担时, 通过孤立的菌落形成单位从肺组织匀^浆12, 16 ^,17。因此, GMS 定量的真菌负担避免了与其他常用方法固有的一些限制。

然而, GMS 量化和/或这项研究的局限性值得注意。首先, 作者假设在每个实验组的肺部都有可比分布的菌丝生长, 因此使用4个代表性10x 客观领域的量化来作为对整个肺部真菌负担的代表性测量。(图 6B)。在某些情况下, 菌丝灶的相对分布、大小和密度会有很大差异, 从而使真菌的负担与这种方法和 qPCR 方法的等效性不同。然而, 我们的额外结果与整体肺部分量化使用4X 客观的领域显示相似, 虽然统计上不显著, 组之间的差异 (图 6C)。这一策略增加了这个量化指标的标准误差, 可能是由于4X 目标的菌丝分辨率降低和次优场的背景增加。因此, 有代表性的量化更少的领域在更高的放大率是首选。第二, 每个样本只使用一个中央截面。在真菌分离或小鼠菌株的基础上, 一些研究可能导致菌丝生长的不均匀分布。在这些情况下, 每个石蜡区块中的其他部分应量化, 以获得更有代表性的负担。第三, 在诱发粘液大量生产的实验中 (即, 量化过敏性支气管肺曲霉病 (ABPA)¹⁸或囊性纤维化 (CF)¹⁸) 的气道真菌生长, GMS 反应与富含多糖的粘液¹⁹可产生非特异的 GMS + 结果, 从而使一些样品倾斜, 有利于较高的真菌负担。由于仅在本研究中使用了 IA 的粒细胞减少模型, 因此使用其他免疫能力强或抑制模型可能会导致比较少的结果。尽管有这些告诫, 但 GMS 量化提供了一种可比性的方法来确定真菌负担, 其继续在其他研究中的使用可以进一步验证这种方法的实用性, 因为它是一致的、可靠的和具有成本效益的。

作者没有什么可透露的。

这项研究得到了印第安纳大学医学研究增强补助金和 NIH-NIAID 1R03AI122127-01 的部分支持。在这段期间, 位免疫学家美国协会的免疫学研究事业获得了部分支持。