小鼠尿的解剖和外植体培养对囊附着的作用分析

我们描述了一个体外测定模型囊附着, 第一步胎盘形成。该协议展示了小鼠 allantoides 在固定化α4β1整合素上的解剖和外植体培养。尿附件是在预定的时间点显微镜下评估的。

胎盘对哺乳动物胚胎的生长发育至关重要。由于这个原因, 许多基因的改变和环境的侮辱, 扰乱胎盘的发展或功能可能导致早孕损失的小鼠和人类。然而, 简单的体外检测对胎盘形成的潜在影响是缺乏的。在这里, 我们的重点是建模的第一步和关键步骤的胎盘形成, 其中包括附着的尿的绒毛膜。我们描述了一种快速评估囊外植体附着在固定化α4β1整合素上的方法, 它是一种 chorio 模拟的基底。这种体外方法可以对不同连续时间点的多个尿的附着和扩散行为进行定性评估。该协议可用于调查有针对性的小鼠突变, 药物, 或各种环境因素的影响, 已与妊娠并发症或胎儿损失的尿附着在前体内。

胎盘在子宫环境中的胚胎生长发育是必不可少的。它构成了胎儿和母体循环之间的氧气、代谢物和养分交换的界面, 也是内分泌和免疫器官的功能。任何内生或外源性侮辱, 损害胎盘发育可能导致宫内发育迟缓, 胎儿的损失, 或怀孕并发症, 在小鼠和人类的¹。虽然导致胎盘生理异常的靶向小鼠突变的数量继续增加², 但目前在小鼠基因组信息学 (凡陀) 网站上列出的219种基因型是 (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0010038), 许多这些表型从机械的角度看不清楚。除了基因改变, 小分子药物, 单克隆抗体, 毒素, 病原体, 过量代谢物, 或各种环境因子可能影响胎盘发育和功能^3,4,5,6,7. 然而, 简单的体外分析了胎盘发育中的模型关键步骤是稀缺的。

小鼠胎盘发育在早期妊娠开始, 当尿 (脐带的发育前体) 从胚的后端出现, 作为一个芽, 生长向绒毛膜的⁸。Chorioadhesive 细胞在囊芽的外层斡旋在绒毛膜 (囊 "融合") 的表面上的附着和传播尿。绒毛膜随后折叠成绒毛进入其中尿的血管生长形成迷宫, 内部胎盘层在那里营养和氧气被交换在严密并列的母体血液窦和胚胎血管之间^{9 ,10}。

尿对绒毛膜的附着是迷宫形成的初始和关键步骤, 而这一过程中的缺陷是妊娠¹中最常见的胚胎致死原因之一。虽然已经描述了许多鼠标突变体, 但囊附件无法出现在¹⁰, 并且凡陀数据库当前列出了108个以异常囊融合为特征的鼠标突变体 (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), 血管细胞黏附分子之间的相互作用 molecule-1 (VCAM-1, 表达囊胚层) 和α4β1整合素 (表达在绒毛膜皮, 这是派生自外胚层) 似乎是必不可少的囊附件和融合^11,12,13。全芒野型胚的免疫组织化学染色表明, VCAM-1 在囊茎远端2/3 处以大约胚胎日 (E) 7.5¹³ (1-4 节阶段) 表达, 其表达仍然高在囊附件和-融合^11,12期间。囊附着于绒毛膜的失败通常通过子宫芽的组织学分析来检测。然而, 尿大小是生理上高度可变的在之间, 甚至在同一发育阶段的凋落物¹⁴, 和尿只能附加到绒毛膜当它已经达到足够的大小, 使身体接触。反射这自然可变性, 囊附件发生在 ~ e 8.0 和 e 9.0在子宫内, 并且一个统计地可靠评估这个过程由组织学是依赖于分析许多conceptuses 在适当的发育阶段获得足够的标本。

在这里, 我们描述一种方法来评估囊附件前子宫, 不太依赖于尿大小。我们展示了小鼠胚胎的解剖和他们的 allantoides 从怀孕的老鼠的子宫〜8天后 coitum (dpc; dpc 0.5 指定阴道插头的检测), 并随后培养尿外植体的固定α4β1整合.该方法能够对多尿外植体在不同的连续时间点上的附着和扩展行为进行快速、实用的评价。该协议可用于筛选目标突变、药物或各种环境因素对尿附着体的影响ex 体内。

小鼠育种得到了 Regierung Unterfranken 的批准, 所有的分析都严格按照德国和欧洲联盟关于实验室动物护理和使用的法律和法规进行。

1. 尿外植体培养的α4β1整合素孔板包衣

1. 重组冻干小鼠α4β1整合素在200µg/毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在 5ml (37 ° c) PBS 中稀释至最终浓度为10µg/毫升。吸管20µL/稀释α4β1整合素溶液到所需数量的孔板 (1 尿/井) 的井。
   注: 在孔板上涂布井时避免气泡形成。
2. 在37° c 的孔板上孵育60分钟, 将它们放置在湿润的组织培养孵化器中。
3. 用吸管小心地吸上清液。使用温和的吸力和倾斜的板, 以避免触及井底与吸管尖端。通过添加50µL 5ml (37 ° c) 培养基, 如 Dulbecco 氏改良鹰培养基 (DMEM) 冲洗两次, 并通过轻柔的吸力除去洗涤介质。
4. 关键步骤: 通过将孔板放置在湿化组织培养箱中, 在37° c 中加入50µL/0.1% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA)/DMEM 并孵育为≥30分钟, 以阻止自由结合点。
   注: 尿外植体可附着在血清存在的各种表面。因此, 必须阻止非特异性结合位点, 在用整合素对水井进行涂布后, 并在加入含血清培养基中的外植体培养的解剖尿 (见步骤 4.4)。
5. 在4.4 步之前, 将涂覆的水井保持在37° c 的堵塞溶液中。

2. 在 Dpc 8 的怀孕小鼠子宫剥离

注意: 减少假阳性妊娠率的体重增加歧视¹⁵。

1. 用颈椎脱位处死小鼠。用 70% (v/v) 乙醇喷洒, 对腹部的外套进行消毒。
   注意: 处理小鼠时要戴上手套。无麻醉剂的宫颈脱位可防止尿的化学污染, 这可能会干扰尿的附着。
2. 用剪刀在中线上做一个小切口, 打开腹部的皮肤。用戴手套的手指按住切口上方和下方的皮肤, 将皮肤拉向鼠标的胸部和尾部。
3. 用钳子抓住腹膜。另一方面, 用剪刀从前向后方做 V 形切口, 并将组织移开以暴露腹腔。用镊子将肠道推到一侧, 以获得子宫。
4. 找到两个子宫角。用钳子钳住宫颈 (尾段), 用细剪刀切开韧带。然后用剪刀割断输卵管的两个子宫角。
5. 用镊子将子宫转移到无菌、室温 (RT) PBS 的10厘米的无菌皿中。用细钳和/或剪刀除去子宫角周围的脂肪组织、血管和神经 (图 1A)。

3. 胚胎解剖

注意: 在装有8:1 缩放范围的显微镜下执行以下步骤。

1. 用剪刀在植入部位之间切割, 分离胚胎。用镊子抓住子宫芽肌的子宫内衬, 并将其拉开, 露出蜕膜 (图 1B)。
2. 使用镊子, 将子宫芽转移到一个新的10厘米的碟含有无菌, RT PBS。
3. 用钳子钳把胚胎周围的蜕膜固定下来。
4. 用细钳 (图 1C) 在蜕膜的 anti-mesometrial 一侧做切口, 并用钳子剥开蜕膜以露出胚胎 (图 1D)。
   注: 蜕膜的 mesometrial 极具有极强的血管化作用, 在其基底上可比 anti-mesometrial 部分更宽, 其中包含胚胎并呈苍白。
5. 用镊子解剖胚胎 (图 1E, F)。
6. 使用微勺, 将胚胎移植到一滴无菌的 PBS 中, 包含在3.5 厘米的无菌皿中。
7. 使用微勺将胚胎移植到同一 3.5 cm 盘中的 PBS 中, 用镊子将胚胎从卵黄囊中解剖 (图 1G, H)。
8. (可选), 如果需要 (例如, 通过聚合酶链反应进行基因分型), 将卵黄囊转移到无菌管中, 将其与 ~ 5 µL PBS 吸进一个大孔200µL 吸管尖端。贮存在-20 ° c。
   注意: 母体组织 (即, 包括赖克特膜和 ectoplacental 锥在内的顶叶囊) 可能会污染卵黄囊的制备, 导致基因分型结果错误。切除这些组织是最容易的前胚胎解剖从蛋黄囊。

4. 固定化α4β1整合素的尿解剖和前子宫培养

1. 使用细钳 (图 1H) 将尿从其在胚胎后端的基底插入部位切开。
2. (可选), 如果需要发展分期, 节对胚胎的视觉检查使用的显微镜, 配有相衬光学和5×和10x 目标。
   注意: 胚胎可以用镊子延长, 以方便节计数。囊附着和融合发生在 e 8.0 和 e 9.0 在胚胎与≥6节对。转动开始在胚胎与6-8 节对。
3. 吸管40µL/井的 DMEM 补充 10% (v/v) 胎牛血清, l-谷氨酰胺, 和抗生素在所需数量的预孔板井 (见第 1)。
4. 收集漂浮的尿通过吸它与〜5µL PBS 到一个大孔200µL 吸管尖端。转1尿/井。
5. 通过将孔板放置在湿润的组织培养孵化器 (37 ° c, 5% CO₂) 中, 用于例如、6、12和 24 h, allantoides 孵化。为了防止干扰与尿附件, 不要移动孔板材在这些时间点之间。
6. 在每个时间点, 评分尿附件 (例如, 没有附件/浮动尿; 部分或完全连接的尿; 完全传播尿) 使用具有相衬度或差分干涉对比度光学的显微镜和5×或10x 目标 (图 2)。
   注意: 新隔离和完全连接的 allantoides 的典型示例如图 2所示。前子宫, 从野生 C57BL/6J 小鼠中分离出的 allantoides 远端的末端附着在4-6 小时内 (这被称为尿的部分附着), 整个尿的完全附着是在 12 h 的培养基中实现的。18-24 h, 外植体已扁平, 并假设一个圆形 (称为完全传播尿) 与一个 CD31-positive 血管丛^9,16。

5. 说明尿对内皮细胞标记 CD31 的验证染色

1. 通过添加40µL/4% (w/v) 甲醛/PBS, 来吸取培养基中的完全传播外植体和固定细胞。
   注: 甲醛是有毒的。戴上手套和安全护目镜, 避免皮肤和眼睛接触。
2. 在 RT 处孵育10分钟, 然后抽出上清液。洗涤三次, 加入40µL/PBS, 并通过温和的吸力去除洗涤介质。
3. Permeabilize 细胞和阻断非特异性结合位点, 添加40µL/井 0.1% (v/v) 海卫十-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) 正常山羊血清在 PBS 为30分钟 RT. 通过添加40µL 或 PBS 的好, 洗两次, 并通过温和的吸力去除洗涤介质。
   注意: 在这一点上, 协议可以在一夜之间暂停。
4. 染色细胞添加20µL/良好的主要 anti-CD31 抗体稀释1:50 在 0.1% (w/v) BSA/PBS 过夜在4° c。洗涤三次, 加入40µL/PBS, 并通过温和的吸力去除洗涤介质。
5. 通过在 RT 中添加20µL/荧光标记的二级山羊鼠抗体稀释1:200 在 0.1% (w/v) BSA/PBS 为1小时, 以检测束缚的主要抗体. 保护孔板免受光通过铝箔包装或放置在一个黑暗的房间。洗涤三次, 加入40µL/PBS, 并通过温和的吸力去除洗涤介质。
6. 通过添加20µL/好的安装介质来嵌入单元格。在 RT 中孵育1小时直到安装介质凝固。在 RT 或4° c 处储存孔板, 免受光线的保护。
7. 图像的尿外植体的血管丛的荧光显微镜下配备了5×或10x 目标和合适的荧光过滤器。
   注: 在图 3中显示了完全展开尿的 CD31-positive 血管丛的代表性图像。其他用于血管丛的标记, 如针对 Flk-1、外语、Tie-1 或 Tie-2 的抗体, 也可用于¹⁶。

本协议描述了一种方法来隔离和外植体小鼠 allantoides前体, 并详细的定性评估的尿附着α4β1整合素, 一个关键的过程中, 在体内囊融合。在图 1A-H中显示的代表性结果演示了从怀孕子宫开始的尿隔离的连续步骤。围绕子宫角的母体组织, 如脂肪组织和血管 (图 1A) 被移除, 并在打开肌肉子宫层后以逐步的方式从子宫内膜解剖胚胎 (图 1B E)。随后, 其他产妇组织, 如顶叶卵黄囊和 ectoplacental 锥被删除 (图 1E, F)。图 1G-H显示该技术包括从卵黄囊、另一外和高度带血管的组织中剥离外尿。因此, 根据本议定书隔离的 allantoides 基本上没有污染母体或 (额外) 的胚胎组织, 而非尿。

图 2显示了 allantoides 的大小和形状, 从一个单一的小窝中刚解剖过的胚胎可以大大改变¹⁴。Allantoides C57BL/6J 野生胚胎解剖在 E 8.5 有一个拉长的形态学在74% 的情况下 (45 的61分析胚胎), 如图 2和图 1H。然而, 在 15% (9/61) 的胚胎, allantoides 显着更小, 更圆润 (见参考¹⁴) 和 11% (7/61) 的胚胎尚未形成一个可见的尿在解剖时。尽管在尿外植体培养的起始时间点上有异种形状和大小 (图 2, 面板ah), 但在12小时内观察到了固定化α4β1整合素的尿附着和全传播从七只凋落物的胚胎中分离出的54新鲜的 allantoides。然而, 12 h 培养后的外植体的形状和大小是有点不均匀的 (图 2), 反映了在试验起始点的不同囊形态。

图 3显示了在 24 h 外植体培养后完全附着的 allantoides CD31-positive 内皮细胞的免疫组织化学染色, 这证实了外植体在此时间点上已详细阐述了血管丛, 如预期的^9,16. 这种附着的尿培养物可用于研究血管形成体外⁹。因此, 所提出的方法产生尿外植体, 可以很容易地培养ex 体内, 与以前发表的实验研究的协议^9,16。

该协议设置的框架, microscopy-based 评估的尿附着在预定的时间点, 例如后12小时或 24 h 的外植体培养。结果可以以定性的方式进行评估 (在特定时间点部分/全部附件或完全传播), 是/否)。由于相同的外植体可以反复地进行可视化和评分, 这一分析反映了个体尿外植体培养的特点。此外, 在固定和染色的外植体中形成血管丛是可以评估的 (图 3)。

图 1: 尿解剖中的代表性步骤.(A) 隔离子宫角的详细视图。包含胚胎的子宫芽是由星星标记的;脂肪组织和血管周围的子宫角是看到左侧。(B) 子宫肌层切除后的蜕膜 (子宫) 的视图。高血管化的, mesometrial 极的蜕膜是面向左边, anti-mesometrial 部分 (标有一颗星), 其中包含胚胎是面向右翼。(C) 蜕膜 anti-mesometrial 极的侧面图 (以星号标记)。箭头指示胚胎的位置。(D) 孕 (箭头) 的顶部视图, 在周围的蜕膜部分切除后, 由顶骨卵黄囊包围。(E, F)在胚胎解剖的后续步骤的代表性观点 (箭头)。箭头指示卵黄囊。在 (E) 中, ectoplacental 锥 (epc) 在右侧可见。(G) 从卵黄囊 (箭头) 部分剥离胚胎 (箭)。尿上标有红星。(H) 与尿 (红星) 分离的胚 (箭头)。尿将从其在胚胎后端的基底插入部位切开的位置, 用红色的断线表示。图像被拍摄在一个显微镜8:1 变焦范围。所有刻度线均为 1 mm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: allantoides 的异构形状和大小.八 allantoides (a-h) 从一个单一垃圾的胚胎中分离出来。左面板, 解剖后立即 allantoides (0 小时)。右面板, 同一 allantoides 后 12 h 的外植体培养。外植体牢固附着, 间充质细胞扩散。外植体被圈出以可视化外植块大小。图像被拍摄在显微镜上, 配有相衬光学和 5× (左面板) 或10x 目标 (右面板)。所有刻度线均为500µm.请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 尿外植体培养中的血管丛形成.Allantoides 对固定化α4β1整合素进行了解剖和说明, 如本议定书所述。外植体被培养 24 h, 血管丛中的内皮细胞被染色使用 anti-CD31 原代抗体和荧光标记的二级抗体。内皮细胞呈绿色。上部图像显示整个血管丛在一个代表性的尿外植体中心区。该图像是在装有荧光光学和5×物镜的显微镜上拍摄的。刻度条, 500 µm。两个较低的板是高放大图像的另一种尿外植体解剖和培养在相同的条件下。可以看到血管状结构和个体内皮细胞。图像是在共聚焦显微镜上拍摄的;刻度条, 25 µm.请单击此处查看此图的较大版本.

在血清的存在, 这是一个丰富的来源, pro-adhesive 细胞外基质分子, 如纤维连接蛋白, 尿植体将欣然附加到各种塑料, 玻璃, 或过滤表面^9,16。因此, 如果进行的试验的目的是专门研究基因修饰或任何其他治疗对固定化α4β1尿附着的影响, 就必须阻止非特异性结合位点 (例如, 用牛血清白蛋白) 涂层后的表面与整合素和前孵化与含血清的媒体。

初始附着的尿外植体的固定化α4β1整合素是非常敏感的运动, 因此, 组织培养板应保持不受干扰的预先确定的时间段 (例如, 12 小时) 之前得分尿附件.请注意, 与基体的稳定接触形成所需的时间可能会因分析的小鼠应变或固定化α4β1整合素的浓度而异。

细胞间 VCAM-1/α4β1-interaction 的要求为成功的囊融合牢固地建立了^11,12,13。此外, 细胞外基质分子, 如纤连蛋白, 胶原和其他感兴趣的分子也可以固定化, 并作为 "chorio 模拟" 基板。

囊附着依赖于 VCAM-1 与其结合的伙伴整合素α4β1之间的细胞间相互作用。在子宫内, 囊附件和随后的融合只能在尿足够扩展以与绒毛膜接触时发生。鉴于在特定发展阶段尿大小的生理变异性, 囊附件和融合发生在 e 8.0 和 e 9.0 之间 (范围, e 7.5-e 9.25)^14,16。方法对活体小鼠子宫内尿附着的瞬态过程进行了研究, 目前尚不容易获得。相反, 分析主要集中在费力地确定囊融合通过组织学评估的例如, 囊在绒毛膜表面的传播和迷宫层的发展在一个单一的, 预先决定时间点^11,12,13,16。这一端点分析不能区分的缺陷, 特别是由于尿的附件受损的绒毛膜和绒毛膜依赖性的影响, 并限制在胚胎发育阶段的固有变异性和囊大小.如在代表性结果下讨论的那样, 尿大小的生理变异性可能导致 C57BL/6J 野生胚胎中26% 囊融合的相对延迟。从统计学上讲, 几乎2/7 只怀孕的老鼠将因此过早地牺牲 (61 个胚胎从七窝, 平均产仔数 8.7), 这就转化为大规模研究的大量繁殖过剩的必要性。有趣的是, 显微外科实验表明, 绒毛膜已经有能力与尿在1节对阶段, 和尿展示最大融合能力的胚胎与3-5 节对¹⁴。因此, 尿的 chorioadhesive 细胞在实际的囊附件在体内之前形成并功能胜任。对固定化配体的尿附着体的前子宫分析, 因此, 这是相对独立于给定的尿大小。因此, 这种方法的一个优点是, 它绕过尿伸长的缺陷, 并着重于下一步的胎盘形成,即, chorioallantois 附件。此方法可用于区分遗传小鼠突变体的尿伸长和 chorioallantois 附着缺陷。

与传统的方法尿吸入从它的附着点到胚胎用嘴吸管¹⁶, 当前协议使用手工切口方法, 并且尿以后使用大孔吸管技巧处理.尿吸入的一个重要优点是这种方法避免了直接组织的处理。切割和操纵尿可能损害囊皮外鞘内的 chorioadhesive 细胞。然而, 切割尿钳已成功地使用前在前体内培养的 pre-placental 组织¹⁷, 和囊外植体附着体的动力学和体外培养的形态学描述目前的研究是类似于发表的数据基于尿隔离的愿望¹⁶。这些发现表明, chorioadhesive 细胞是充分保存后, 手工切割的尿, 并指出, 外植体分化不严重扰动, 由 CD31-positive 内皮的形成表明。直接切割尿还提供了一种可能性, 仅解剖 VCAM-1 的尿的上部三分之二的¹³, 并确保较少的污染与卵黄囊衍生细胞, 这可能必须修剪远离基地尿后尿吸入¹⁸。

前子宫囊外植体粘附于固定化的重组α4β1整合素提供了一个重要的, 初始步骤, 是囊融合所需的一个主要的读数,即, 细胞间相互作用之间的 VCAM-1 表达的尿, 和α4β1整合素本地化绒毛膜皮, 这是从外胚层。然而, 虽然这两个黏附分子被认可作为原则球员在囊融合, ~ 50% 胚胎与合性淘汰赛突变在 VCAM-1 或α4整合素做接受囊融合在体内^{11 ,12,13}。由于这种不完整的显, 本协议中描述的ex 体内方法可能不足以排除囊融合失败的遗传模型中的这两个黏附分子的要求。

在生理条件下, α4β1整合嵌在绒毛膜滋养的细胞膜上, 并被合并在一个复杂的结构和信号蛋白网络中, 配合调节细胞 (和细胞基质) 的黏附¹⁹. 与大多数简化体外方法一样, 绒毛膜 VCAM-1 结合界面的复杂性只在很有限的程度上被固定化的α4β1整合素所模拟。除了可能缺乏其他重要的结构或信号输入从完整的绒毛膜在这个系统中, 很可能只有一小部分的整合是固定在一个刚性的, two-dimensional 表面上存在的活动,具有约束力, "开放" 的构象。

所提出的方法接近尿的早期附着和传播步骤的绒毛膜, 也可以报告囊血管丛的发展, 并结合对血管形成的分析⁹。然而, 目前的方法并没有建立囊内皮细胞介导的发芽血管生成的绒毛膜的入侵, 也没有反映绒毛膜的分支形态发生, 这是一个重要的过程, 囊融合和胎盘迷宫的随后发展¹⁰。

使用相衬或差分干涉显微镜结合 (半) 自动图像分析, 提出的方法可以应用于较大规模的屏幕上的初始分析延迟或失败的囊附件体外。除了对小鼠突变体的分析外, 该方法还可能对药物、病原体、代谢物或环境因子对囊附着的影响进行筛选。

在许多小鼠突变体中, 囊附着不发生, 虽然尿和绒毛膜似乎已经发育正常。此外, 显示囊附件缺陷的变种人通常会显示不完整的显^1、2、10。重要的是要研究这些功能明显不同的基因是否会影响共同的分子通路和/或细胞过程。活体成像的尿外植体衍生的小鼠突变有潜力阐明这种机制。例如, 解剖尿外鞘中的细胞可以用重要的荧光染料 (如 DiI 或迪奥亲油性 carbocyanine 示踪剂^16,18) 来标记图像粘连和传播事件, 或跟踪细胞实时迁移。此外, 荧光的记者, 可视化的细胞骨架或黏附蛋白可能证明是信息。

最近, 对 pre-attachment 小鼠 allantoides 和 chorions 的一个ex 体内共培养系统进行了描述, 并成功地使用这种方法来调查囊附件后发生的事件, 如迷宫层编队¹⁷。固定化 chorions 尿附着效率的分析从不同的 (例如, 基因改良的) 小鼠模型可能会产生新的洞察力的分子的球员和途径, 管理的早期步骤的发展小鼠胎盘

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了德意志 Forschungsgemeinschaft SFB688 (对司法部) 的支持。