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动物模型中已被证明是在界定有助于慢性炎症的发展宿主和病原体的具体机制的宝贵工具。在这里,我们描述口腔感染的小鼠模型与人类病原体牙龈卟啉和细节的方法,以评估炎症的进展,在局部和全身的部位。
慢性炎症的病理组织损伤和许多慢性疾病的人一个统一的特征,包括肿瘤,自身免疫,慢性炎症性疾病的主要驱动力。新出现的证据牵连的开发和慢性疾病的进展有多种临床表现的病原体引起的慢性炎症。由于慢性疾病的复杂和多因素病因学,设计性实验的因果关系的证明,并建立了机械的联系是人类几乎是不可能的。使用动物模型的一个优点是,既可能影响特定疾病的过程中遗传和环境因素可被控制。因此,在设计感染的相关动物模型表示在确定有助于慢性炎症主机和病原体的特定机制的关键步骤。
在这里,我们描述的病原体引起的慢性infla小鼠模型mmation在局部和全身部位感染后的口腔致病菌牙龈卟啉菌 ,与人类牙周疾病密切相关的细菌。特定病原体小鼠经口感染诱导产生破坏牙齿的支撑牙槽骨,牙周疾病的一个标志局部炎症反应。在动脉粥样硬化的建立小鼠模型中,感染与体育牙龈加速动脉窦和无名动脉内的炎性斑块沉积,伴随着激活血管内皮,增加免疫细胞浸润,并表达升高病灶内炎性介质。我们详细方法炎症的局部和全身部位的评估。利用转基因小鼠和定义的细菌的突变体,使该模型尤其适合用于识别主机和参与起始,进展,以及疾病的预后的微生物因子。 Additionally,则模型可用于筛选新的治疗策略,包括疫苗和药物干预。
慢性炎症的病理组织损伤和许多慢性疾病的人的统一特性的主要驱动力。这些疾病包括肿瘤,自身免疫和慢性炎症性疾病1。许多慢性疾病的病因仍不清楚,但可以理解为是复杂和多方面的,既涉及遗传易感性和开征环境因素。而炎症的perpetuators仍然难以捉摸,免疫激活的细胞和分子分布重叠相当与那些在宿主反应病原体2观察到的模式。
越来越多的证据暗示感染的研发微生物病原体和慢性炎症的进展及其临床表现多样2,3。病原体可诱导并通过颠覆了宿主的免疫系统,建立持续性感染,直接维持慢性炎症 4。在不存在的微生物的持久性的,感染可能会沉淀从由分子模拟对自身抗原触发的免疫反应,改变自身抗原使得它们的免疫原性,或能够释放先前被屏蔽宿主抗原破坏的慢性炎症。然而,很少有具体的病原体被确定为一个特定的慢性疾病的普遍原因。相反,大多数现有的数据表明,病原体使用不同的机制来引起慢性炎症的临床表现及疾病预后的遗传易感宿主3来自各行各业。因此,由特定的病原体引起的慢性炎症可能对公共健康产生重大影响,以及治疗许多慢性疾病和预防的机制进行详细的了解。
尽管参与了慢性炎症的诱导和维持宿主和病原体的具体机制是了解甚少,在病原体引起的慢性炎症模型的进步已经开始促进我们这些过程的理解。 巴斯德牙龈口腔感染模型是病原体引起的慢性炎症,允许主机和病原体在局部(口腔骨质流失)促进慢性炎症的具体机制和系统网站(动脉粥样硬化),5,6分析了独特的,良好的特点小鼠模型。
牙龈是一种革兰氏阴性厌氧口腔病原体与人类牙周疾病,感染驱动的慢性炎症性疾病,其特征牙齿支持组织7的破坏。除了 病理感染的初始点,越来越多的证据暗示P。牙龈诱导的开发和全身性疾病,包括动脉粥样硬化5的进展慢性炎症,这种疾病的特点是慢性inflammation中的动脉血管壁。特定病原体小鼠P的口腔感染牙龈诱导局部炎症反应而导致的破坏牙齿的支撑牙槽骨8 P。牙龈可以从感染小鼠的嘴被恢复42天感染后8和小鼠发展水平高的病原体特异性血清抗体滴度9。在动脉粥样硬化的使用载脂蛋白-E建立的小鼠模型- / -小鼠(的ApoE - / - ),口腔感染与体育牙龈引起慢性炎症,其驱动主动脉窦10和无名动脉11内炎性斑块沉积。 P的无名动脉内渐进性炎症牙龈感染的小鼠能够使用体内的MRI活的动物进行监测。从体育组织学,动脉病变牙龈感染的小鼠表现出的脂质陪伴积累增加尼德由活化的血管内皮细胞的,增加的免疫细胞浸润,以及升高的表达的炎性介质12。使用该模型在基因敲除小鼠的已阐明主机信令组件和炎症介质的作用,以及细胞驱动P.特异性相互作用牙龈诱导免疫病理学12 - 14。此外,利用定义的细菌的突变体的实验已经确定了临界P.牙龈毒力因子的局部和全身的网站15有助于慢性炎症。
本文详细介绍了方法学体育的评价诱发牙龈慢性炎症的局部和全身的网站。我们提供的牙槽骨骨量丢失的微型电脑使用阿米拉软件分析的详细协议。此外,我们定义序列在体内活的动物MRI检查的效用逐步在评估无名动脉内flammation。我们有方法的可视化和炎性斑块在动脉病变量化,并描述它们的组织学特征。利用转基因小鼠和定义的细菌的突变体,使该模型尤其适合用于识别主机和参与起始,进展,以及疾病的预后的微生物因子。此外,该模型可用于筛选新的治疗策略,包括疫苗和药物干预。
1,生长和培育细菌
2,口腔感染
注意:由于显示在图1中 ,使用适当的小鼠模型和口腔感染治疗方案,P.牙龈诱导慢性炎症和免疫病理学,在本地(口腔)和全身性位点(动脉)。
3,微型计算机断层扫描(微型电脑)
动脉粥样硬化4。评估
动脉粥样硬化病变的5学评价
动脉粥样硬化病变的6免疫组化鉴定。
一般抗体为基础的协议通常采用以下步骤概述了评估动脉粥样硬化病变的体育牙龈感染的小鼠。此协议需要优化每个抗体或试剂。
7,MRI检查
使用适当的小鼠模型和口腔感染治疗方案, 第牙龈诱导慢性炎症和免疫病理学,在本地(口腔)和全身性位点(血管)( 图1)。
在小鼠中,口腔感染与体育引起牙龈驱动牙齿的破坏支撑牙槽骨8局部炎症反应。 体育牙龈感染的小鼠发生血清抗体反应,此有机体,主要是IgG同种型9。在图4中示出的结果是代表在其中的C57BL / 6被感染P.gingivalis三次两个天的时间间隔,并处死6周对牙槽骨丧失通过显微CT评估的实验。使用阿米拉软件体积分析表明, 体育与未感染的对照组相比, 牙龈 -感染的小鼠表现出显著骨损失( 图4A)。与对照相比( 图4B和图4C)重构的半侧上颌骨的视觉检查示出了增加在感染小鼠的摩尔根的暴露表面面积。
在动脉粥样硬化倾向的ApoE - / -小鼠,P.牙龈引起慢性炎症,其驱动主动脉窦15和无名动脉11内牙槽骨丧失12和炎性斑块沉积。P.牙龈诱导发生动脉粥样硬化,早在24小时后,最后的感染,并且可以通过免疫接种感染前16来防止。在P的无名动脉炎进步牙龈感染的小鼠可在活体小鼠通过串行体内磁共振成像在不同的时间被监测点在感染后( 图5)。苏丹IV染色的主动脉的连接面的测量表明, 第牙龈感染显著增加的脂质沉积,并在内膜面皮损面积( 图6)。在的牺牲,组织学和免疫组织化学的时间可以用在细胞组成,各抗原的表达,并且脂质含量的上下文来定性或定量地表征动脉粥样硬化病变。主动脉窦病变的免疫组织化学分析揭示了在巴斯德增加巨噬细胞浸润和升高的表达的天然免疫受体的Toll样受体2(TLR2)的牙龈 -感染的小鼠( 图7)。
图1:P。诱发牙龈慢性炎症的局部和全身的网站。此前感染与体育牙龈小鼠administe红抗生素随意在他们的饮用水10-14天之后是为期两天的抗生素的休息时间。抗生素治疗抑制土著口腔菌群,便于定植。为肺泡损失的诱导,小鼠被感染三次在2天的时间间隔和牙槽骨的体积进行测量后6周感染。在评估动脉粥样硬化,动脉粥样硬化多发的ApoE - / -小鼠感染通常每周5次,连续3周,牺牲16-24周后感染。活体小鼠的无名动脉内的渐进性炎症可以通过串行体内磁共振成像在不同时间测量点后感染。组织学和免疫组织化学可用于染色的脂质和炎症细胞在终止实验,以验证成像数据。在处死时,牙槽骨丧失是由微型电脑测定和全球动脉粥样硬化负担被连接整个主动脉的表面染色进行评估。 https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51556/51556fig1highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
图2鼠标半侧颌骨的说明1 OBS OBS和2.3个臼齿标记(M1-M3)和相关的解剖学术语所表示的位置。 请点击这里查看该图的放大版本。
图3:小鼠半侧颌骨示出通过5的OBS 1的定位。1556 / 51556fig3highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。
由微型电脑测量图4牙槽骨骨量丢失 。雄性C57BL / 6口服感染与体育牙龈或车辆单(未感染)和牙槽骨量由微型电脑6周使用阿米拉评估。(一)半侧颌骨的感染和P.牙槽骨量牙龈感染的C57BL / 6。结果表示骨量的基准平面上方(从CEJ 120微米)。数据表示为从每群n = 8只小鼠的骨量的SD。 *** P <0.001,相对于未感染的对照组(B)和(C)的半侧上颌骨的未感染的(B)的代表性的三维重建和P.牙龈感染的(C)的小鼠。在牙槽骨货量则显著下跌可以在体育可见牙龈感染的小鼠相比,未感染的对照。箭头指示的地方可见骨质流失发生在第牙龈 -感染小鼠(注意增加磨牙根部暴露的表面积)。 请点击这里查看该图的放大版本。
无名动脉以下的体育中图5进炎牙龈感染的MRI检查(甲)代表磁共振(MR),主动脉弓和载脂蛋白E的主要血管造影的-/ -小鼠(B)轴向先生从黄线在A的鼠标,0.3毫米低于其分支无名动脉的形象。无名动脉通过MRA成像在基线和在12和16周后的感染(C)中的管腔面积的时间变化(毫米2),计算个别小鼠(n = 10-12 /组)。未感染的ApoE - / - (蓝色); P牙龈感染的载脂蛋白E - / - (红色) 点击此处查看本图的放大版本。
图6: 恩面部确定病变区域在整个主动脉(A)主动脉<苏丹IV染色EM>恩面对病变16周后感染与体育牙龈 。(二)感染(白色符号)的总主动脉内量化脂质含量和P.牙龈 -感染的小鼠(黑色符号)组(n = 10-13 /组)。主动脉的百分比由脂质被占用使用ImageJ计算。 * P <0.05。 请点击这里查看该图的放大版本。
主动脉窦病变图7免疫组化分析雄性apoE - / -小鼠喂食标准饲料感染与体育牙龈或感染,牺牲16周后感染。从主动脉窦获得的冰冻切片进行染色,防鼠标F4 / 80和TLR2。比例尺,100微米。 请点击这里查看该图的放大版本。
巴斯德牙龈口腔感染模型提供了病原体引起的慢性炎症的局部和全身的网站学习的重要工具。这种独特的模式使得促进慢性炎症和免疫病理学宿主和病原体的具体机制的表征。此外,该模型可用于筛选新的治疗策略,包括免疫和药物干预。在这个协议中列出的步骤描述了成功运用这种模式和细节的方法来评估P的发生,发展和结局牙龈诱导的慢性炎症。
有使用该协议来检查炎性骨质流失时,要记住几个关键方面。首先,应当注意的是,感染与P的结果主机感染2)病原体1)遗传易感性: 牙龈是由三个关键因素决定毒力(病原体的基因)和3)将得到的宿主 - 病原体相互作用(这两个基因之间的相互作用)。易患体育诱发牙龈牙槽骨丧失的小鼠遗传决定的,因此,必须注意要学习17选择小鼠的应变时服用。小鼠近交系之间的差是宿主反应可以被利用来进行正向遗传筛选和鉴定涉及的易感和抗性病原体诱导的慢性炎症基因。此外,相当多的异质性存在于不同P的能力牙龈株诱导牙槽骨丧失的小鼠18。该协议使用的小鼠上,由于转基因小鼠的可用性和它们的易感性的动脉粥样硬化的C57BL / 6背景。P.牙龈株381诱导牙槽骨吸收和动脉粥样硬化的小鼠对C57BL / 6背景,并使用THI一些细菌的突变体被设计了S品系。
小鼠动脉粥样硬化尤其抗性和显性动脉病变的发展需要使用动脉粥样硬化的转基因小鼠模型。我们使用的ApoE - / -小鼠模型,因为它是动脉粥样硬化的行之有效的小鼠模型中,不需要的高脂肪的饮食对损伤形成馈送,并概括了人类疾病19的许多方面。饮食的实验过程中,以给动物喂食的类型是一个重要的变量。对于大多数我们的工作,我们喂养的小鼠正常饮食的饮食,以避免外源性脂质在我们的研究结果解释的贡献。在初步研究中,我们发现,喂食老鼠感染和P之间的高脂肪食物口罩差异恩面对病损区牙龈感染的主动脉窦内的老鼠。然而,高脂肪食物和P.牙龈感染协同工作时inflam进展息是在无名的MRI或组织学11监控。在小鼠中,无名动脉有病变进展的程度高,并且病变此动脉快递设有临床疾病在人类中,包括血管狭窄,萎缩性介质,血管周围的炎症,和斑块破裂特性。病变的细胞组合物中的区别是很明显的,在不同的解剖部位。巨噬细胞是主要的免疫细胞浸润的主动脉窦的病变,而无名动脉病变是由两种巨噬细胞和T细胞。
实验持续时间和该时间点的炎症终点评估的其他因素评估启动,进展时要考虑的,和P的结果牙龈诱发动脉粥样硬化。我们以前表明,P。牙龈感染的载脂蛋白E - / -小鼠表现出巨噬细胞浸润,表达升高的先天免疫标志物中,次以下的主动脉窦之内,最后感染,早在24小时增加发炎的斑块沉积,这可以通过免疫接种16被防止。在我们手中,炎症和免疫病理学增加随着年龄和是显而易见的最多24周后感染。然而,关于这项研究的持续时间决定最终依靠的基本假设上正在研究,分析模式和动脉粥样硬化的特定环境条件下的程度的先验知识。
使用非侵入性的成像技术来监测在无名动脉渐进炎症可用于指导实验持续时间。串行MRI允许动脉粥样硬化的进展,在同一动物的详细研究,可以描绘动脉腔和小血管壁区域20的缩小。相比之下,传统的方法,如解剖血管的脂质染色,MR成像不需要安乐死并且允许纵向研究,以评估动脉粥样硬化的发生和发展。在转基因小鼠中,细菌的突变体,或实验性治疗的同时,通过MRI提供的时间信息可被用于评估主机遗传学,病原体的毒力因子,和治疗性干预的效果。作为一个额外的好处,组织学和免疫组织化学可用于染色的脂质和炎症细胞在终止实验,以验证成像数据。我们最近使用的这些方法,以证明口服感染第牙龈加速动脉粥样硬化中的ApoE的无名arterties - / -小鼠,将免疫系统提供保护斑块进展,并且与在脂质和炎症细胞11的积累减少。
综上所述,该协议概述了需要产生的病原体引起的慢性炎症稳健模型的步骤,以及如用于局部和全身的网站,以评估炎症的方法。除了使用该模型来检查主机和病原体参与炎症的骨丢失和动脉粥样硬化的具体机制,它可以适合于研究的病原体引起的慢性炎症,以额外的疾病模型的贡献。这可通过使用病的转基因小鼠模型,包括类风湿关节炎,糖尿病和癌症来完成。新的证据表明,一些病因不明的慢性疾病可能会传染来源。这些疾病包括肿瘤,自身免疫和炎性疾病,以及一起危及全世界发病率和死亡率的主要原因。因此,使用动物模型的研究中病原体的慢性炎症驱动的疾病中的作用已为广泛的治疗作用和改善诊断的潜力。
作者宣称,他们没有竞争的经济利益。
这项工作是由过敏和美国国立传染病授予P01 A1078894到CAG
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amira analysis software | Visualization Sciences Group | ||
Anaerobic chamber DW Scientific Model MG500 | Microbiology International | ||
BHI | Becton-Dickinson | 211059 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | 51280-5G | |
Menadione (Vitamin K) | Sigma-Aldrich | M5625-25G | |
Yeast Extract | Becton-Dickinson | 212750 | |
Carboxymethyl cellulose (medium viscocity) | Sigma-Aldrich | C-4888 | |
Sulfamethoxazole and trimethoprim oral suspension 200 mg/40 mg per 5 ml | Hi-Tech Pharmacal | NDC 50383-823-16 | |
μCT 40 | Scanco | ||
HistoChoice Tissue Fixative | Sigma-Aldrich | H2904 | |
Sudan IV | Sigma-Aldrich | S4261-25G | |
Vertical-bore 11.7T Avance spectrometer | Bruker | ||
Paravision | Paravision | ||
ImageJ | NIH | ||
Rat anti-mouse F4/80 | Serotec | MCA497R | |
Rat anti-mouse TLR2 | eBioscience | 13-9021-80 | |
Leica S4 dissecting scope | Leica | ||
Microm HM 550 cryostat | Microm |
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