لقد قمنا بتطوير اختبار حساس وكمي قائم على زراعة الخلايا يمكن استخدامه لتقييم إشارات Sonic Hedgehog ، والتي يتم نقلها في الغالب عبر الأهداب الأولية. يمكن استخدام هذا الاختبار لفحص التغيرات الجينية والجينية ، والتي ترتبط بالخلل الوظيفي للأهداب الأولية. على الرغم من الدور المركزي للأهداب الأولية في إشارات Sonic Hedgehog ، إلا أن المنهجيات الحالية غالبا ما تفتقر إلى الحساسية المطلوبة لتقييم وظيفة الأهداب الأولية في ظل التغيرات الجينية.
يملأ هذا البروتوكول هذه الفجوة من خلال توفير اختبار قائم على زراعة الخلايا ، ويحاكي تنشيط Sonic Hedgehog والتعبير الجيني المستهدف Sonic Hedgehog في الخلايا المهدبة. بالمقارنة مع البروتوكولات الأخرى ، مثل توطين البروتين المنعم على طول الأهداب الأولية عند تنشيط مسار Sonic Hedgehog ، فإن فحصنا كمي وسهل المتابعة وحساس لأنه يعتمد على زراعة الخلايا. للبدء ، قم بإزالة قارورة ثقافة الخلايا T25 التي تحتوي على خلايا RPE-1 شبه ملتقية تنمو في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل من حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
تخلص من وسط الثقافة من قارورة زراعة الخلية وقم بإزاحة الخلايا بالنشاط الأنزيمي لمحلول التربسين-EDTA الدافئ مسبقا. أعد تعليق الخلايا في قارورة باستخدام وسط كامل دافئ مسبقا. عد الخلايا على مقياس كثافة الدم لتحديد كثافة الخلية في المعلق.
ضع غطاءين معقمين مقاس 12 ملم في طبقين لزراعة الخلايا مقاس 35 ملم. البذور مرتين في 10 إلى قوة خمس خلايا RPE-1 تنمو بشكل غير متزامن في كل طبق يحتوي على زلات غطاء. أضف ملليلترين من الوسط الكامل إلى كل طبق وقم بتنمية الخلايا لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط من خلايا RPE-1 النامية وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت DPBS الدافئ مسبقا. أضف ملليلترين من وسط DMEM الدافئ مسبقا الذي يحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين بدون FBS إلى كل طبق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، استبدل الوسط بوسط متعطش للمصل يحتوي على ناهض ناعم بتركيز نهائي يبلغ 250 نانومولار. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الحضانة ، انقل زلاقات الغطاء إلى صفيحة 24 بئرا ، مع وضع زلة غطاء واحدة في كل بئر.
أضف 0.5 مل من الميثانول المبرد إلى كل بئر لإصلاح الخلايا. احتضان الطبق عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 10 دقائق. اغسل الغطاء على الفور ثلاث مرات باستخدام 0.5 مل من محلول الغسيل.
تخلص من الوسيط من الأطباق. أضف 0.5 مل من كاشف TRIzol مباشرة إلى كل طبق. وزعي الكاشف بالتساوي واتركيه لمدة خمس دقائق.
الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لإنشاء خليط متجانس وتجميعه في 1.5 ملليلتر وأنابيب طرد مركزي دقيقة خالية من النوكلياز أضف 0.1 مل من الكلوروفورم إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا مختلطة بثلاثية الأبعاد معالجة بناهض ناعم و DMSO. احتضان الأنابيب لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق قبل الطرد المركزي عند 12،000 جم عند أربع درجات مئوية. نقل المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة.
أضف 0.25 مل من الأيزوبروبانول إلى المرحلة المائية واحتضان الأنابيب لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي العينات عند 12 ، 000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لاحظ تكوين حبيبات الحمض النووي الريبي البيضاء الشبيهة بالهلام.
تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة دقيقة. ثم, أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي في 0.5 مل من الإيثانول المخفف حديثا 75٪. قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة لضمان الخلط.
الطرد المركزي للعينات عند 7 ، 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة دقيقة. جفف كريات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 10 دقائق.
أعد تعليق الكريات في 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير عند 260 نانومتر. استخدم ميكروغراما إلى ثلاثة ميكروغرامات من إجمالي الحمض النووي الريبي من كل عينة لتصنيع (كدنا) باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة توليف (كدنا).
قم بإعداد تفاعلات qPCR في ثلاث نسخ باستخدام (كدنا) المخفف من واحد إلى خمسة من كل عينة مع مجموعات أولية من جينات GLI1 و PTCH1 و HHIP و SMO و beta-actin ، مع مزيج رئيسي qPCR في لوحة PCR متعددة الآبار وحساسة للفلورسنت. قم بتغطية لوحة PCR بمادة مانعة للتسرب مناسبة. ضع اللوحة في أداة qPCR.
قم بتشغيل برنامج qPCR القياسي مع 40 دورة تضخيم ، متبوعا بتحليل منحنى الانصهار. بعد التشغيل ، تحقق من منحنى الذوبان لكل أمبليكون للحصول على ذروة واحدة عند درجة الحرارة المطلوبة. تصدير بيانات التضخيم إلى جدول بيانات.
احسب التعبير النسبي لكل نسخة عن طريق التطبيع مقابل تعبير بيتا أكتين ، ورسم بيانات التعبير النسبي على الرسم البياني ، وحساب الدلالة الإحصائية للتغييرات في التعبير باستخدام اختبار t غير متزاوج. جمعت معظم الخلايا المتعطشة للمصل أهداب أولية بأكثر من 85٪ هدب. في هذه الحالة ، زادت مستويات التعبير عن GLI1 و PTCH1 و HHIP بشكل كبير في الخلايا الملساء المعالجة بناهضات مقارنة بالخلايا المعالجة ب DMSO ، بينما لم تظهر مستويات نسخ SMO أي تغيير كبير.
