私たちは、主に一次繊毛を介して形質導入されるソニックヘッジホッグシグナル伝達の評価に使用できる、細胞培養ベースの高感度で定量的なアッセイを開発しました。このアッセイは、原発性繊毛機能障害に関連する遺伝的およびエピジェネティックな変化を調べるために使用できます。ソニックヘッジホッグシグナル伝達における一次繊毛の中心的な役割にもかかわらず、現在の方法論では、遺伝的変化下での一次繊毛の機能を評価するために必要な感度が不足していることがよくあります。
このプロトコルは、繊毛細胞におけるSonic Hedgehogの活性化とSonic Hedgehogの標的遺伝子発現を模倣した細胞培養ベースのアッセイを提供することにより、このギャップを埋めます。Sonic Hedgehog経路の活性化時に一次繊毛に沿って平滑化されたタンパク質の局在化などの他のプロトコルと比較して、当社のアッセイは定量的で、追跡が容易で、細胞培養ベースであるため感度が高いです。まず、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターから、5ミリリットルの完全培地で増殖するほぼコンフルエントなRPE-1細胞を含むT25細胞培養フラスコを取り出します。
細胞培養フラスコから培地を捨て、予熱した0.25%トリプシン-EDTA溶液の酵素活性で細胞を取り出します。予熱した完全培地を使用して、細胞をフラスコに再懸濁します。血球計算盤で細胞をカウントし、懸濁液の細胞密度を決定します。
2つの滅菌12mmカバースリップを2つの35mm細胞培養皿に入れます。カバースリップを含む各ディッシュで、5つの非同期増殖RPE-1細胞の累乗で10の2倍に播種します。各皿に2ミリリットルの完全培地を加え、細胞を24時間成長させます。
インキュベーション後、増殖中のRPE-1細胞から培地を取り出し、予熱したDPBSバッファー1ミリリットルで細胞を1回洗浄します。各皿に、FBSを含まない1%ペニシリンストレプトマイシンを含む2ミリリットルの予熱したDMEM培地を追加します。.細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。
翌日、培地を、最終濃度250ナノモルの平滑化アゴニストを含む血清飢餓培地と交換します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%でさらに24時間インキュベートします。インキュベーション後、カバースリップを24ウェルプレートに移し、各ウェルに1枚のカバースリップを置きます。
0.5ミリリットルの冷却メタノールを各ウェルに加えて、細胞を固定します。プレートをマイナス20°Cで10分間インキュベートします。すぐにカバースリップを0.5ミリリットルの洗浄バッファーで3回洗ってください。
皿からメディウムを捨てます。0.5ミリリットルのTRIzol試薬を各皿に直接加えます。試薬を均等に分散させ、5分間放置します。
ピペットを数回上下させて均質な混合物を作成し、それを1.5ミリリットルのヌクレアーゼフリー微量遠心チューブに集めます 平滑化アゴニストとDMSOで処理されたトリゾール混合細胞を含む各チューブに0.1ミリリットルのクロロホルムを追加します。チューブを2〜3分間インキュベートしてから、摂氏4度で12, 000gで遠心分離します。RNAを含む水相を新鮮な微量遠心チューブに移します。
0.25ミリリットルのイソプロパノールを水相に加え、チューブを10分間インキュベートします。サンプルを 12, 000g で 10 分間、摂氏 4 度で遠心分離します。白いゲル状のRNAペレットの形成を観察します。
マイクロピペットを使用して上清を慎重に捨てます。次に、RNAペレットを0.5ミリリットルの新たに希釈した75%エタノールに再懸濁します。チューブを短時間渦巻きにして、混合を確認します。
サンプルを7, 500gで摂氏4度で5分間遠心分離します。マイクロピペットを使用して上清を慎重に捨てます。RNAペレットを10分間風乾します。
ペレットを25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。260ナノメートルの微量分光光度計を使用して、総RNA濃度を測定します。各サンプルから1〜3マイクログラムの全RNAを使用して、cDNA合成キットの製造元の指示に従ってcDNAを合成します。
各サンプルから 1 対 5 に希釈した cDNA と GLI1、PTCH1、HHIP、SMO、および β-アクチン遺伝子のプライマーセットを使用し、マルチウェルの蛍光感度 PCR プレートに qPCR マスターミックスを使用して、qPCR 反応を三重にセットアップします。PCRプレートを適切なシーラーで覆います。プレートをqPCR装置に入れます。
標準化されたqPCRプログラムを40回の増幅サイクルで実行し、続いて融解曲線分析を行います。分析後、各アンプリコンの融解曲線で、目的の温度で 1 つのピークが得られることを確認します。増幅データをスプレッドシートにエクスポートします。
β-アクチン発現に対して正規化して各転写産物の相対発現を計算し、相対発現データをグラフにプロットし、対応のないt検定を使用して発現の変化の統計的有意性を計算します。血清飢餓細胞の大部分は、85%以上の繊毛で一次繊毛を組み立てました。この状態では、GLI1、PTCH1、およびHHIPの発現レベルは、DMSO処理細胞と比較して、スムースアゴニスト処理細胞で有意に増加しましたが、SMO転写産物レベルは有意な変化を示さなかった。
